Name: Autor destacado: Desentrañando la mecanobiología del pinzamiento del tendón: un modelo de explante de extremidades traseras murinas multiaxiales
Uploaded: 2023-12-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Mechanobiology of Tendon Impingement – A Multiaxial Murine Hind Limb Explant Model at JoVE.com

Los autores agradecen el apoyo y la asistencia brindados por Jeff Fox y Vidya Venkatramani del Centro de Investigación Musculoesquelética de la Universidad de Rochester, financiado en parte por P30AR06965. Además, los autores desean agradecer al Centro de Microscopía Óptica y Nanoscopía (CALMN) del Centro Médico de la Universidad de Rochester por su ayuda con la microscopía multifotónica. Este estudio fue financiado por R01 AR070765 y R01 AR070765-04S1, así como por 1R35GM147054 y 1R01AR082349.

Todo el trabajo con animales fue aprobado por el Comité de Recursos Animales de la Universidad de Rochester.
1. Preparación de medios de cultivo de tejidos
<ol><li>Cultivar todos los explantes en el Medio Eagle Modificado de Dulbecco (1x DMEM) con 1% v/v de penicilina-estreptomicina y 200 μM de ácido L-ascórbico en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2. Para el pretratamiento inicial de 48 h, se cultivó cada explante en 70 mL de medio de cultivo suplementado c...

Comprensión del pinzamiento del tendón: modelo de explante murino para el estudio de la mecanobiología

La plataforma experimental de explante de extremidades posteriores murinas, junto con el protocolo de cultivo de tejidos descrito en este estudio, proporciona un modelo adecuado para estudiar la mecanobiología de la formación de fibrocartílago impulsada por el pinzamiento en la inserción del tendón de Aquiles. La utilidad de este modelo de explante queda demostrada por los resultados representativos, que indican el mantenimiento de la viabilidad celular concomitante con un cambio significativo y espacialmente hetero...

Una multitud de tendones, incluidos el tendón de Aquiles y los tendones del manguito rotador, experimentan pinzamiento óseo debido a la posición anatómica normal1,2,3,4. El pinzamiento del tendón genera una tensión compresiva dirigida transversalmente al eje longitudinal de la fibra5,6,7. Las regiones de pinzamiento del tendón demuestran un fenotipo único de fibrocartílago en el que las células redondas y encogidas (fibrocondrocitos) están incrustadas dentro de una red de colágeno desorganizada con un contenido marcadamente mayor de glicosaminoglicanos (GAG)2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Estudios anteriores sugieren que el entorno mecánico dispar producido por el pinzamiento del tendón sostiene esta matriz rica en GAG al impulsar la deposición de grandes proteoglicanos agregantes, sobre todo agrecano, aunque los mecanismos subyacentes no están claros1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Si bien el fibrocartílago es una característica normal en las regiones afectadas de tendones sanos, el metabolismo aberrante de los proteoglicanos asociado con la formación excesiva de fibrocartílago es una característica distintiva de la tendinopatía, una enfermedad común y debilitante que surge de manera desproporcionada en los tendones con afectación crónica1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. En consecuencia, el pinzamiento del tendón se reconoce clínicamente como un factor extrínseco importante que impulsa varias de las tendinopatías más comunes, incluida la enfermedad del manguito rotador y la tendinopatía insercional del tendón de Aquiles (IAT)50,51,52. En la actualidad, el tratamiento de la tendinopatía es ineficiente. Por ejemplo, aproximadamente el 47% de los pacientes con TAI requieren intervención quirúrgica después de un tratamiento conservador fallido, con resultados postoperatorios variables53,54,55,56. A pesar de la aparente relación entre el pinzamiento y la tendinopatía, los mecanismos mecanobiológicos por los cuales las células del tendón pinzado sienten y responden a su entorno mecánico están mal descritos, lo que oscurece la comprensión de la patogénesis de la tendinopatía y da lugar a un tratamiento inadecuado.
Los modelos de explantes son herramientas útiles en el estudio de la mecanobiología tendinosa57,58. Como primer paso hacia la comprensión de la mecanobiología del pinzamiento tendinoso, varios estudios previos han explorado la respuesta celular tras la aplicación de la compresión uniaxial simple a las células o explantes tendinosos extirpados 27,29,30,31,32,33,34,39. Sin embargo, las células in vitro carecen de matrices extracelulares y pericelulares que faciliten la transferencia de cepas, secuestren importantes factores de crecimiento y citocinas liberadas por deformación mecánica, y proporcionen sustrato para complejos de adhesión focal que desempeñan un papel en la mecanotransducción57,59. Además, tanto los estudios in vitro como los de explantes extirpados no logran recapitular el ambiente de deformación mecánica multiaxial generado por el pinzamiento tendinoso in vivo, que depende de las características anatómicas de la región afectada 5,6. En el contexto de la inserción del tendón de Aquiles afectado, esto incluye los tejidos circundantes como la bolsa retrocalcánea y la almohadilla de grasa de Kager 60,61,62,63. Por el contrario, los modelos in vivo de pinzamiento tendinoso 25,28,36,37,38,64,65,66 permiten un control mínimo sobre la magnitud y frecuencia de la carga aplicada directamente al tendón, lo cual es una limitación bien reconocida de los modelos in vivo para el estudio de la mecanobiología del tendón 57,58,67,68,69,70. Dados los desafíos en la medición de la deformación tendinosa in vivo, el entorno de deformación interna generado dentro de estos modelos a menudo está mal caracterizado.
En este manuscrito, presentamos una plataforma experimental personalizada que recrea el pinzamiento de la inserción del tendón de Aquiles sobre el calcáneo dentro de explantes de extremidades posteriores murinas enteras que, cuando se combina con este protocolo de cultivo de tejidos, mantiene la viabilidad durante 7 días en cultivo de explantes y permite el estudio de las secuelas biológicas del pinzamiento del tendón. La plataforma está construida sobre una base de ácido poliláctico (PLA) impresa en 3D que proporciona la base para la fijación de las empuñaduras y el inserto de reducción de volumen de PLA impreso en 3D. Las empuñaduras se utilizan para sujetar la parte superior de la pierna y la rodilla proximales a la unión miotendinosa del tendón de Aquiles con la cara caudal de la extremidad posterior hacia arriba, lo que permite obtener imágenes del tendón de Aquiles desde arriba utilizando una sonda de ultrasonido o un microscopio invertido (Figura 1A). El inserto de reducción de volumen se desliza a lo largo de una pista en la base y reduce el volumen requerido de medios de cultivo de tejidos. Una línea trenzada envuelta alrededor de la pata trasera se enruta fuera de la plataforma utilizando el diseño de la base y un clip de PLA impreso en 3D. Al tirar de la cuerda, la pata trasera se flexiona dorsal y la inserción del tendón de Aquiles se incita contra el calcáneo, lo que resulta en una tensión compresiva transversal elevada 5,6 (Figura 1A). La plataforma está contenida dentro de un baño acrílico que mantiene los explantes de la extremidad posterior sumergidos en medios de cultivo de tejidos. Asegurar la cuerda tensa al exterior de la bañera con cinta adhesiva mantiene la dorsiflexión del tobillo para producir un pinzamiento estático de la inserción del tendón de Aquiles. Los archivos CAD para componentes impresos en 3D se proporcionan en múltiples formatos (Archivo complementario 1), lo que permite la importación a una gama de software CAD comercial y gratuito de código abierto para su modificación y adaptación a las necesidades experimentales. Si el acceso a las impresoras 3D no está disponible para la fabricación, se pueden proporcionar archivos CAD a los servicios de impresión 3D en línea que imprimirán y enviarán las piezas a bajo costo.
Es importante destacar que el complejo musculotendinoso tríceps sura-tendón de Aquiles abarca las articulaciones de la rodilla y el tobillo 71,72,73. En consecuencia, la tensión de tracción en el tendón de Aquiles se ve influenciada por la flexión de la rodilla. La extensión de la rodilla pone el tendón de Aquiles bajo tensión, mientras que la flexión de la rodilla reduce la tensión. Al extender primero la rodilla y luego dorsiflexionar pasivamente el tobillo, las tensiones de compresión en la inserción impactada se pueden superponer a las tensiones de tracción. Por el contrario, al flexionar pasivamente el tobillo con la rodilla flexionada, se reduce la tensión de tracción y queda la tensión de compresión. El protocolo actual explora tres de esas condiciones. 1) Para el pinzamiento estático, el pie se flexiona dorsal a < 110° con respecto a la tibia para incidir la inserción, con la rodilla flexionada para reducir la tensión. 2) Para el grupo de tensión basal, el tobillo se extiende por encima de los 145° de dorsiflexión con la rodilla extendida, generando predominantemente tensión de tracción en la inserción. 3) Para el grupo descargado, los explantes se cultivan en una placa de Petri con la rodilla y el tobillo en posiciones neutras en ausencia de carga aplicada externamente. Los ángulos mencionados anteriormente se miden fotográficamente en relación con un sistema de coordenadas en el que el pie y la tibia son paralelos en un ángulo de 180° y perpendiculares en un ángulo de 90°.
Los pasos clave del protocolo incluyen: 1) la disección de los explantes de las extremidades posteriores y la extracción cuidadosa de la piel y el tendón plantar; 2) cultivo de explantes después de un pretratamiento de 48 h con dexametasona; 3) corte de tejido y tinción histológica; y 4) análisis de imágenes en color para evaluar la formación de fibrocartílago. Después de la disección, cada explante de extremidad posterior se pretrata durante 48 h en medios de cultivo suplementados con dexametasona74. Las extremidades contralaterales de cada ratón se asignan a grupos experimentales separados para su comparación por pares, lo que ayuda a controlar la variabilidad biológica. Después del pretratamiento, los explantes se colocan en plataformas como se describió anteriormente y se cultivan durante 7 días más (Figura 1B). Se realizan comparaciones adicionales con un grupo pretratado (día 0) en el que los explantes se retiran inmediatamente después del pretratamiento de 48 h.
Después del cultivo del explante, las extremidades posteriores se recortan, se fijan en formol, se descalcifican y se incrustan en parafina. El corte en serie en orientación sagital proporciona una visualización del tendón de Aquiles desde la unión miotendinosa hasta la inserción del calcáneo, al tiempo que permite realizar un seguimiento de la profundidad de la sección a través de todo el tendón. El marcaje X-nick de dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) (TUNEL) se utiliza para visualizar el daño en el ADN secundario a la apoptosis y evaluar la viabilidad. La histología del azul de toluidina y el análisis de imágenes en color personalizadas se realizan para cuantificar los cambios en la tinción de GAG. A continuación, se utilizan secciones de tejido teñidas con azul de toluidina para la obtención de imágenes de SHG con el fin de caracterizar las alteraciones en la organización de las fibras del collage (Figura 1B).
Los resultados representativos proporcionados sugieren una tinción histológica alterada de la matriz rica en GAG y una desorganización de la red de colágeno extracelular generada por 7 días de pinzamiento estático dentro del modelo. Este modelo se puede utilizar para explorar los mecanismos moleculares que subyacen al cambio fibrocartilaginoso impulsado por el pinzamiento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent underpads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td>For benchtop dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic bath</td>
			<td>Source One</td>
			<td>X001G46CB1</td>
			<td>Contains the explant platform submerged in culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-361-20</td>
			<td>Used as secondary containment, holds two platforms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided line</td>
			<td>KastKing</td>
			<td>30lb test</td>
			<td>Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-541-034</td>
			<td>Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>8312-4</td>
			<td>Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>MP Biomedical LLC</td>
			<td>194561</td>
			<td>CAS#50-02-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>D12345</td>
			<td>CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch Brand</td>
			<td>34-8724-5195-9</td>
			<td>To attach sandpaper to Grip platens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (1X DMEM)</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA tetrasodium salt dihydrate</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>J15700.A1</td>
			<td>CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T038181000</td>
			<td>CAS#64-17-5, 1 L supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam biopsy pads</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801000</td>
			<td>Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #SS Standard Inox</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11203-23</td>
			<td>Straight, smooth, fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Micro-Adson 4.75&#34;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-820-073</td>
			<td>Straight, fine tips with serrated teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garnet Sandpaper, 50-D Grit</td>
			<td>Norton</td>
			<td>M600060 01518</td>
			<td>Or other coarse grit sandpaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-500</td>
			<td>CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grips</td>
			<td>ADMET</td>
			<td>GV-100NT-A4</td>
			<td>Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histobond Adhesive Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16005-108</td>
			<td>Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15-959</td>
			<td>Or any other labeling tape of preference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td>CAS#50-81-7, for culture media formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered formalin, 10%</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3800600</td>
			<td>For sample fixation, 5 gallon supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7741-1CS</td>
			<td>100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (100X)</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td>-</td>
			<td>Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Processing cassettes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802631</td>
			<td>For fixation, decalcification and paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>P36931</td>
			<td>Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1700-50</td>
			<td>CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Fine</td>
			<td>FST</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>Straight, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Staining Set, 12-place</td>
			<td>Mercedes Scientific&#160;</td>
			<td>MER 1011</td>
			<td>Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, anhydrous</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>A1318430</td>
			<td>CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-964</td>
			<td>For paraffin sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>348601000</td>
			<td>CAS#92-31-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volume Reduction Insert</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803665</td>
			<td>4 gallon supply for histological staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine hind limb explant model for studying the mechanobiology of achilles tendon impingement

El pinzamiento tendinoso sobre el hueso genera un ambiente de deformación mecánica multiaxial con una deformación compresiva transversal marcadamente elevada, que provoca un fenotipo de fibrocartílago localizado caracterizado por la acumulación de matriz rica en glicosaminoglicanos (GAG) y la remodelación de la red de colágeno. Si bien el fibrocartílago es una característica normal en las regiones afectadas de tendones sanos, el exceso de depósito de GAG y la desorganización de la red de colágeno son características distintivas de la tendinopatía. En consecuencia, el pinzamiento se reconoce clínicamente como un factor extrínseco importante en el inicio y la progresión de la tendinopatía. Sin embargo, la mecanobiología que subyace al pinzamiento del tendón sigue siendo poco estudiada. Los esfuerzos anteriores para dilucidar la respuesta celular al pinzamiento del tendón han aplicado compresión uniaxial a las células y extirpado explantes de tendones in vitro. Sin embargo, las células aisladas carecen de un entorno extracelular tridimensional crucial para la mecanorespuesta, y tanto los estudios in vitro como los de explantes extirpados no logran recapitular el entorno de deformación multiaxial generado por el pinzamiento del tendón in vivo, que depende de las características anatómicas de la región afectada. Además, los modelos in vivo de pinzamiento tendinoso carecen de control sobre el entorno de deformación mecánica. Para superar estas limitaciones, presentamos un novedoso modelo de explante murino de extremidad posterior adecuado para estudiar la mecanobiología del pinzamiento del tendón de Aquiles. Este modelo mantiene el tendón de Aquiles in situ para preservar la anatomía local y reproduce el entorno de tensión multiaxial generado por el pinzamiento de la inserción del tendón de Aquiles sobre el calcáneo durante la dorsiflexión del tobillo aplicada pasivamente, al tiempo que retiene las células dentro de su entorno nativo. Describimos un protocolo de cultivo de tejidos integral para este modelo y presentamos datos que establecen la viabilidad sostenida del explante durante 7 días. Los resultados representativos demuestran un aumento de la tinción histológica de GAG y una disminución de la alineación de las fibras de colágeno secundaria al pinzamiento, lo que sugiere una formación elevada de fibrocartílago. Este modelo se puede adaptar fácilmente para investigar diferentes regímenes de carga mecánica y permite la manipulación de vías moleculares de interés para identificar mecanismos que median el cambio fenotípico en el tendón de Aquiles en respuesta al pinzamiento.

A multitude of tendons, including the Achilles tendon and rotator cuff tendons, experience bony impingement due to normal anatomical positioning1,2,3,4. Tendon impingement generates compressive strain directed transversely to the longitudinal fiber axis5,6,7. Regions of tendon impingement demonstrate a unique fibrocartilage phenotype in which shrunken, round cells (fibrochondrocytes) are embedded within a disorganized collagen network with markedly increased glycosaminoglycan (GAG) content2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Prior studies suggest the disparate mechanical environment produced by tendon impingement sustains this GAG-rich matrix by driving the deposition of large aggregating proteoglycans, most notably aggrecan, although the underlying mechanisms are unclear1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. While fibrocartilage is a normal feature in impinged regions of healthy tendons, aberrant proteoglycan metabolism associated with excessive fibrocartilage formation is a hallmark feature of tendinopathy, a common and debilitating disease that disproportionately emerges in chronically impinged tendons1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Accordingly, tendon impingement is clinically recognized as an important extrinsic factor driving several of the most common tendinopathies, including rotator cuff disease and insertional Achilles tendinopathy (IAT)50,51,52. Currently, treatment of tendinopathy is inefficient. For example, approximately 47% of patients with IAT require surgical intervention after failed conservative management, with variable postoperative outcomes53,54,55,56. Despite the apparent relationship between impingement and tendinopathy, the mechanobiological mechanisms by which cells in impinged tendon sense and respond to their mechanical environment are poorly described, which obscures understanding of tendinopathy pathogenesis and results in inadequate treatment.
Explant models are useful tools in the study of tendon mechanobiology57,58. As a first step towards understanding the mechanobiology of tendon impingement, several prior studies have explored cellular response following the application of simple uniaxial compression to cells or excised tendon explants27,29,30,31,32,33,34,39. However, cells in vitro lack extracellular and pericellular matrices that facilitate strain transfer, sequester important growth factors and cytokines released by mechanical deformation, and provide substrate for focal adhesion complexes that play a role in mechanotransduction57,59. Additionally, both in vitro and excised explant studies fail to recapitulate the multiaxial mechanical strain environment generated by tendon impingement in vivo, which depends on anatomical features of the impinged region5,6. In the context of the impinged Achilles tendon insertion, this includes surrounding tissues such as the retrocalcaneal bursa and Kager&#39;s fat pad60,61,62,63. Conversely, in vivo models of tendon impingement25,28,36,37,38,64,65,66 allow minimal control over the magnitude and frequency of load applied directly to the tendon, which is a well-recognized limitation of in vivo models for studying tendon mechanobiology57,58,67,68,69,70. Given challenges in measuring tendon strain in vivo, the internal strain environment generated within these models is often poorly characterized.
In this manuscript, we present a custom experimental platform that recreates impingement of the Achilles tendon insertion upon the calcaneus within whole murine hind limb explants that, when paired with this tissue culture protocol, maintains viability over 7 days in explant culture and allows for study of the biologic sequelae of tendon impingement. The platform is built upon a 3D printed polylactic acid (PLA) base that provides the foundation for the attachment of the grips and 3D printed PLA volume reduction insert. The grips are used to clamp the upper leg and knee proximal to the Achilles myotendinous junction with the caudal aspect of the hind limb facing upward, allowing the Achilles tendon to be imaged from above using an ultrasound probe or inverted microscope (Figure 1A). The volume reduction insert&#160;slides along a track on the base and reduces the required volume of tissue culture media. A braided line wrapped around the hind paw is routed out of the platform utilizing the base design and a 3D printed PLA clip. By pulling on the string, the hind paw is dorsiflexed, and the Achilles tendon insertion is impinged against the calcaneus, resulting in elevated transverse compressive strain5,6 (Figure 1A). The platform is contained within an acrylic bath that maintains the hind limb explants submerged in tissue culture media. Securing the taut string to the outside of the bath with adhesive tape maintains ankle dorsiflexion to produce static impingement of the Achilles tendon insertion. CAD files for 3D printed components are provided in multiple formats (Supplementary File 1), allowing import into a range of commercial and free, open-source CAD software for modification to suit experimental needs. If access to 3D printers is not available for fabrication, CAD files can be provided to online 3D printing services that will print and ship the parts at low cost.
Importantly, the triceps surae-Achilles musculotendinous complex spans both the knee and ankle joints71,72,73. Consequently, tensile strain in the Achilles tendon is influenced by knee flexion. Knee extension places the Achilles tendon under tension, whereas knee flexion reduces tension. By first extending the knee and then passively dorsiflexing the ankle, compressive strains at the impinged insertion can be superimposed upon tensile strains. Conversely, by passively dorsiflexing the ankle with the knee flexed, tensile strain is reduced, and compressive strain remains. The current protocol explores three such conditions. 1) For static impingement, the foot is dorsiflexed to &#60; 110&#176; with respect to the tibia to impinge the insertion, with the knee flexed to reduce tension. 2) For the baseline tension group, the ankle is extended above 145&#176; of dorsiflexion with the knee extended, generating predominately tensile strain at the insertion. 3) For the unloaded group, explants are cultured in a Petri dish with the knee and ankle in neutral positions in the absence of externally applied load. The angles referred to above are photographically measured relative to a coordinate system where the foot and tibia are parallel at an angle of 180&#176; and perpendicular at an angle of 90&#176;.
Key steps of the protocol include 1) dissection of hind limb explants and careful removal of the skin and plantaris tendon; 2) explant culture following a 48 h dexamethasone pretreatment; 3) tissue sectioning and histological staining; and 4) color image analysis to assess fibrocartilage formation. Following dissection, each hind limb explant is pretreated for 48 h in culture media&#160;supplemented with dexamethasone74. Contralateral limbs from each mouse are assigned to separate experimental groups for pairwise comparison, which helps control biological variability. After pretreatment, explants are positioned into platforms as described above and cultured for 7 more days (Figure 1B). Additional comparisons are made to a pretreated (day 0) group in which explants are removed immediately following the 48 h pretreatment.
After explant culture, hind limbs are trimmed down, formalin fixed, decalcified and embedded in paraffin. Serial sectioning in sagittal orientation provides visualization of the Achilles tendon from the myotendinous junction to the calcaneal insertion while allowing section depth to be tracked through the entire tendon. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP X-nick labeling (TUNEL) is used to visualize DNA damage secondary to apoptosis and assess viability. Toluidine blue histology and custom color image analysis are performed to quantify changes in GAG staining. Toluidine blue stained tissue sections are then used for SHG imaging to characterize alterations in collage fiber organization (Figure 1B).
The provided representative results suggest altered histological staining of the GAG-rich matrix and disorganization of the extracellular collagen network generated by 7 days of static impingement within the model. This model can be utilized to explore molecular mechanisms underlying impingement-driven fibrocartilaginous change.

Autor destacado: Desentrañando la mecanobiología del pinzamiento del tendón: un modelo de explante de extremidades traseras murinas multiaxiales 

Modelo de explante de extremidad posterior murina para el estudio de la mecanobiología del pinzamiento del tendón de Aquiles

We study the mechanobiology underlying tendon impingement and the process by which this unique mechanical demand drives localized fiber cartilage formation in health and disease. Here we seek to characterize matrix for modeling relative to spatially heterogeneous patterns of multiaxial mechanical strain, generated by impingement and to identify molecular mechanisms mediating this response. In vitro models for studying impingement mechanobiology have applied simple compression to isolated tendon cells or artificial uniaxial compression to partial and whole tendon explants.Established animal models of tendon impingement, manipulating external source of tendon impingement in vivo most often surgically and explore biology following resuming physical activity. In vitro models present significant limitations as isolated cells lack their three dimensional extracellular environment, crucial to mechano-response. While excised explant models circumvent this limitation, both fail to recreate multiaxial strain patterns generated by impingement in vivo.Conversely, animal models offer limited ability to measure or control internal tissue strains. Our Murine Hind Limb Explant Model for studying impingement mechanobiology maintains cells within their extracellular environment and preserves local anatomy of the impinged achilles tendon insertion in situ, allowing controlled prescription of impingement through passively applied joint motion to recreate multiaxial patterns of tissue strain that are measurable and well-characterized.

Las imágenes representativas de las secciones de tejido teñidas con TUNEL demuestran núcleos apoptóticos mínimos dentro del cuerpo del tendón de Aquiles después de 7 días de cultivo de explantes en grupos experimentales (Figura 2A). La cuantificación de estas imágenes proporciona evidencia de que el protocolo de cultivo de tejidos mantiene hasta un 78% de viabilidad en promedio dentro del tendón de Aquiles después de 7 días de cultivo de explantes en condiciones de carga (<stron...

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Presentamos una plataforma experimental personalizada y un protocolo de cultivo de tejidos que recrea el cambio fibrocartilaginoso impulsado por el pinzamiento de la inserción del tendón de Aquiles en explantes de extremidades posteriores murinas con viabilidad celular sostenida, proporcionando un modelo adecuado para explorar la mecanobiología del pinzamiento tendinoso.

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a ...

Estudiamos la mecanobiología subyacente al pinzamiento del tendón y el proceso por el cual esta demanda mecánica única impulsa la formación de cartílago de fibra localizada en la salud y la enfermedad. En este trabajo se busca caracterizar la matriz para modelarla en relación con patrones espacialmente heterogéneos de deformación mecánica multiaxial, generados por el impacto e identificar los mecanismos moleculares que median esta respuesta. Los modelos in vitro para el estudio de la mecanobiología del pinzamiento han aplicado la compresión simple a células tendinosas aisladas o la compresión uniaxial artificial a explantes tendinosos parciales y completos.Se establecieron modelos animales de pinzamiento tendinoso, manipulando la fuente externa de pinzamiento tendinoso in vivo, la mayoría de las veces quirúrgicamente, y explorando la biología después de reanudar la actividad física. Los modelos in vitro presentan limitaciones significativas ya que las células aisladas carecen de su entorno extracelular tridimensional, crucial para la mecano-respuesta. Si bien los modelos de explantes extirpados eluden esta limitación, ambos no logran recrear los patrones de deformación multiaxial generados por el impacto in vivo.Por el contrario, los modelos animales ofrecen una capacidad limitada para medir o controlar las tensiones de los tejidos internos. Nuestro modelo de explante de extremidad posterior murina para estudiar la mecanobiología del pinzamiento mantiene las células dentro de su entorno extracelular y preserva la anatomía local de la inserción del tendón de Aquiles afectado in situ, lo que permite la prescripción controlada del pinzamiento a través del movimiento articular aplicado pasivamente para recrear patrones multiaxiales de tensión tisular que son medibles y están bien caracterizados.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a localized fibrocartilage phenotype characterized by accumulation of glycosaminoglycan (GAG)-rich matrix and remodeling of the collagen network. While fibrocartilage is a normal feature in impinged regions of healthy tendons, excess GAG deposition and disorganization of the collagen network are hallmark features of tendinopathy. Accordingly, impingement is clinically recognized as an important extrinsic factor in the initiation and progression of tendinopathy. Nevertheless, the mechanobiology underlying tendon impingement remains understudied. Prior efforts to elucidate the cellular response to tendon impingement have applied uniaxial compression to cells and excised tendon explants in vitro. However, isolated cells lack a three-dimensional extracellular environment crucial to mechanoresponse, and both in vitro and excised explant studies fail to recapitulate the multiaxial strain environment generated by tendon impingement in vivo, which depends on anatomical features of the impinged region. Moreover, in vivo models of tendon impingement lack control over the mechanical strain environment. To overcome these limitations, we present a novel murine hind limb explant model suitable for studying the mechanobiology of Achilles tendon impingement. This model maintains the Achilles tendon in situ to preserve local anatomy and reproduces the multiaxial strain environment generated by impingement of the Achilles tendon insertion upon the calcaneus during passively applied ankle dorsiflexion while retaining cells within their native environment. We describe a tissue culture protocol integral to this model and present data establishing sustained explant viability over 7 days. The representative results demonstrate enhanced histological GAG staining and decreased collagen fiber alignment secondary to impingement, suggesting elevated fibrocartilage formation. This model can easily be adapted to investigate different mechanical loading regimens and allows for the manipulation of molecular pathways of interest to identify mechanisms mediating phenotypic change in the Achilles tendon in response to impingement.

We present a custom experimental platform and tissue culture protocol that recreates fibrocartilaginous change driven by impingement of the Achilles tendon insertion in murine hind limb explants with sustained cell viability, providing a model suitable for exploring the mechanobiology of tendon impingement.

Investigación

Bioingeniería

Explant Dissection to Generate Murine Hind Limb Explant Model to Study Tendon Impingement

To begin, transfer 70 milliliters of pre-warmed Dulbecco's Modified Eagle Medium into a Petri dish in a sterile biosafety cabinet and add dexamethasone at a concentration of 100 nano molar. Assemble the surgical tools required for the dissection, which includes smooth, straight, fine tip forceps. Straight fine tip forceps with serrated teeth and straight sharp fine scissors.To dissect hind limb explants. Locate the hip joint of a euthanized mouse positioned supine on the bench top lined with absorbent under pads. Use fine scissors to create a small incision on the skin covering the proximal and anterior aspects of the upper leg.Then use fingers to pull the incision apart to expand and pinch the exposed upper leg. Carefully pull the skin distally to de-glove the hind limb to the level of the ankle. Insert one scissor blade gently under the skin along the dorsal aspect of the foot.Then make an incision that extends towards the toes and continue pulling the skin distally until it is completely removed. Position the mouse to have a clear view of the Achilles tendon insertion onto the posterior aspect of the calcaneus near the ankle. To remove the plant terrace tendon, insert one tip of the smooth fine tip forceps between the two tendons.Pass the tip medially under the plantaris tendon. Then pull it proximally to tear through the plantaris muscle. Then using fine tip serrated forceps, grasp the detached proximal end of the plantaris tendon and pull it distally to completely remove it.At the hip joint, employ fine scissors to precisely sever through the pelvis, isolating the hind limb. Use the scissors to gently remove the remaining pelvis, revealing the femoral head. In the biosafety cabinet transfer the hind limb explant into the dish containing cell culture media and dexamethasone.Relocate the dish to the incubator and subject it to pre-treatment for 48 hours.

Disección de explantes para generar un modelo de explante de extremidades posteriores murinas para estudiar el pinzamiento de tendones

Explant Culture and Platforms Loading to Study the Biologic Sequelae of Tendon Impingement

To begin, preheat an adequate amount of sterile culture media while the 48-hour dexamethasone pretreatment of murine hindlimb explant is about to complete. Once the pretreatment ends, move the pretreated explants to the biosafety cabinet. For the unloaded group, aspirate the pretreatment media and transfer the explants to fresh Petri dishes.Add 70 milliliters of culture media to each dish before returning them to the incubator. To prepare the explant platforms for the baseline tension and static impingement group, cut pieces of sandpaper to match the size of the grip platens. For the static impingement group, cut pieces of braided line and pret tie a loose overhand knot halfway along the length of the line.Tear pieces of aluminum foil to cover each acrylic bath and spray them with 70%ethanol. Transfer the prepared components to the biosafety cabinet. Arrange the components such as acrylic bath, base, volume reduction inserts, clip, and grips for platform assembly.Place platform components inside secondary containers of sufficient volume to contain any potential culture media leaks. Submerge the containers in a solution of at least 10%bleach for a minimum of one hour. Rinse the bleach solutions with tap water.After transferring the rinsed components to the biosafety cabinet, use M3 screws and compression springs to affix the platens to the grips. Securely attach the grips to the base employing an M5 screw and insert the M6 screws until they contact the platens. Enhance the platens'functionality by affixing sandpaper using double-sided tape.Close the grips to facilitate the adhesion of the sandpaper to the platens. To load a platform, fully open the grips and use forceps to carefully position the upper leg and knee between the platens. Close the grips gently to hold the limb in place.Use forceps to grasp the exposed femoral head or foot and adjust the knee flexion angle, while gradually closing the forceps to secure it in place. For the baseline tension group, extend the knee joint while closing the grips. In the case of the static impingement group, flex the knee joint while closing the grips.For the static impingement group, place the overhand knot of the string around the distal paw and tighten it securely. Route the string through a slot in the base underneath the explant and through the clip hole. Position the base into the acrylic bath and fasten the clip to the top edge of the bath.To dorsiflex the foot, pull the string until it reaches at least 110 degrees relative to the tibia. Use a permanent marker to mark the string as it exits the clip. Capture a photograph of the explant in this dorsiflexed position for future quantification of the dorsiflexion angle.Remove the base from the setup and attach the volume reduction insert by sliding it along a track on the base. Place the base back into the acrylic bath and reposition the clip on the top edge. Use the marked string as a guide.Pull it to restore the foot to its original dorsiflexion angle and secure the string to the exterior of the bath using tape to maintain a static dorsiflexed position. For the baseline tension group, once the explant is positioned between the grips, take a photograph to quantify the dorsiflexion angle. Then slide the volume reduction insert onto the base and place it into the acrylic bath.Add 125 milliliters of prewarmed culture media to each platform to submerge the explants. After covering the top of the bath with aluminum foil, place the entire setup into a secondary container. Relocate the secondary container to the incubator and culture for seven days.