Name: Författare Spotlight: Att reda ut mekanobiologin för senimpingement - En multiaxial murin bakbens explantationsmodell
Uploaded: 2023-12-08T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Mechanobiology of Tendon Impingement – A Multiaxial Murine Hind Limb Explant Model at JoVE.com

Författarna är tacksamma för stöd och hjälp från Jeff Fox och Vidya Venkatramani vid University of Rochester Center for Musculoskeletal Research's Histology, Biochemistry, and Molecular Imaging (HBMI) Core, delvis finansierad av P30AR06965. Dessutom vill författarna tacka Center for Light Microscopy and Nanoscopy (CALMN) vid University of Rochester Medical Center för hjälp med multifotonmikroskopi. Denna studie finansierades av R01 AR070765 och R01 AR070765-04S1, samt 1R35GM147054 och 1R01AR082349.

Allt djurarbete godkändes av University of Rochester Committee on Animal Resources.
1. Beredning av vävnadsodlingsmedier
<ol><li>Odla all explantat i Dulbeccos Modified Eagle Medium (1x DMEM) med 1 % v/v penicillin-streptomycin och 200 μM L-askorbinsyra i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2 . Under den inledande 48 timmar långa förbehandlingen odlas varje explantat i 70 ml odlingssubstrat kompletterat med 100 nM dexametason74. Efter f?...

Förstå senimpingement – Murine Explantation-modell för att studera mekanobiologi

Den experimentella murina explanteringsplattformen i bakbenen i kombination med det vävnadsodlingsprotokoll som beskrivs i denna studie ger en lämplig modell för att studera mekanobiologin för impingementdriven fibrobroskbildning vid akillesseninsättningen. Användbarheten av denna explantationsmodell demonstreras av de representativa resultaten, som indikerar bibehållande av cellviabilitet samtidigt med betydande och rumsligt heterogen förändring i toluidinblå färgning efter 7 dagars statisk impingement. Dessa...

En mängd senor, inklusive akillessenan och rotatorkuffsenorna, upplever benpåverkan på grund av normal anatomisk positionering1,2,3,4. Klämning av senan genererar trycktöjning riktad tvärs mot den längsgående fiberaxeln5,6,7. Regioner med senpåverkan visar en unik fibrobroskfenotyp där krympta, runda celler (fibrokondrocyter) är inbäddade i ett oorganiserat kollagennätverk med markant ökat innehåll av glykosaminoglykan (GAG)2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Tidigare studier tyder på att den olikartade mekaniska miljön som produceras av senimpingement upprätthåller denna GAG-rika matris genom att driva avsättningen av stora aggregerande proteoglykaner, framför allt aggrekan, även om de underliggande mekanismerna är oklara1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Medan fibrobrosk är ett normalt inslag i påverkade regioner av friska senor, är avvikande proteoglykanmetabolism i samband med överdriven fibrobroskbildning ett kännetecken för tendinopati, en vanlig och försvagande sjukdom som oproportionerligt uppträder i kroniskt påverkade senor1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Följaktligen är senimpingement kliniskt erkänt som en viktig yttre faktor som driver flera av de vanligaste tendinopatierna, inklusive rotatorkuffsjukdom och insertionell akillestendinopati (IAT)50,51,52. För närvarande är behandlingen av tendinopati ineffektiv. Till exempel behöver cirka 47 % av patienterna med IAT kirurgiskt ingrepp efter misslyckad konservativ behandling, med varierande postoperativa resultat53,54,55,56. Trots det uppenbara sambandet mellan impingement och tendinopati är de mekanobiologiska mekanismerna genom vilka celler i impingerade senor känner av och svarar på sin mekaniska miljö dåligt beskrivna, vilket fördunklar förståelsen av tendinopatipatogenesen och resulterar i otillräcklig behandling.
Explantationsmodeller är användbara verktyg i studiet av senmekanobiologi57,58. Som ett första steg mot att förstå mekanobiologin bakom senimpingement har flera tidigare studier undersökt cellulär respons efter applicering av enkel enaxlig kompression på celler eller exciderade senexplantationer 27,29,30,31,32,33,34,39. Celler in vitro saknar dock extracellulära och pericellulära matriser som underlättar stamöverföring, binder viktiga tillväxtfaktorer och cytokiner som frigörs genom mekanisk deformation och tillhandahåller substrat för fokala adhesionskomplex som spelar en roll i mekanotransduktion57,59. Dessutom misslyckas både in vitro- och excised-explantationsstudier med att rekapitulera den fleraxliga mekaniska töjningsmiljön som genereras av senimpingement in vivo, vilket beror på anatomiska egenskaper hos det inträngda området 5,6. I samband med den inträngda akillesseninsättningen inkluderar detta omgivande vävnader som retrocalcaneal bursa och Kagers fettkudde 60,61,62,63. Omvänt tillåter in vivo-modeller av senpåverkan 25,28,36,37,38,64,65,66 minimal kontroll över storleken och frekvensen av belastning som appliceras direkt på senan, vilket är en välkänd begränsning av in vivo-modeller för att studera senans mekanobiologi57,58,67,68,69,70. Med tanke på utmaningarna med att mäta senbelastning in vivo är den interna töjningsmiljön som genereras i dessa modeller ofta dåligt karakteriserad.
I detta manuskript presenterar vi en anpassad experimentell plattform som återskapar impingement av akillesseninsättningen på calcaneus i hela murina bakbensexplantor som, när de paras ihop med detta vävnadsodlingsprotokoll, bibehåller livskraften under 7 dagar i explanteringskultur och möjliggör studier av de biologiska följderna av senimpingement. Plattformen är byggd på en 3D-printad polymjölksyrabas (PLA) som utgör grunden för fastsättning av handtagen och 3D-printad PLA-volymreduceringsinsats. Greppen används för att klämma fast det övre benet och knäet proximalt mot akillessenan med den kaudala aspekten av bakbenet vänd uppåt, vilket gör att akillessenan kan avbildas ovanifrån med hjälp av en ultraljudssond eller inverterat mikroskop (Figur 1A). Volymreduceringsinsatsen glider längs ett spår på basen och minskar den erforderliga volymen vävnadsodlingsmedia. En flätad lina lindad runt baktassen dras ut ur plattformen med hjälp av basdesignen och en 3D-printad PLA-klämma. Genom att dra i snöret blir baktassen dorsalflexerad och akillessenan stöts mot calcaneus, vilket resulterar i förhöjd tvärgående trycktöjning 5,6 (Figur 1A). Plattformen är innesluten i ett akrylbad som håller bakbensexplantorna nedsänkta i vävnadsodlingsmedia. Genom att fästa det spända snöret på utsidan av badet med tejp bibehålls fotledens dorsalflexion för att producera statisk impingement av akillesseninsättningen. CAD-filer för 3D-utskrivna komponenter tillhandahålls i flera format (tilläggsfil 1), vilket möjliggör import till en rad kommersiella och kostnadsfria CAD-program med öppen källkod för modifiering för att passa experimentella behov. Om tillgång till 3D-skrivare inte är tillgänglig för tillverkning kan CAD-filer tillhandahållas till 3D-utskriftstjänster online som skriver ut och skickar delarna till låg kostnad.
Viktigt är att triceps surae-Achilles muskulotendinösa komplex spänner över både knä- och fotlederna 71,72,73. Följaktligen påverkas dragbelastningen i akillessenan av knäböjningen. Knäförlängning sätter hälsenan under spänning, medan knäböjning minskar spänningen. Genom att först sträcka ut knäet och sedan passivt dorsiflexa fotleden kan kompressionsspänningar vid den inträngande insättningen överlagras på dragspänningar. Omvänt, genom att passivt dorsiflexera fotleden med knäet böjt, minskar dragbelastningen och tryckbelastningen kvarstår. I det nuvarande protokollet undersöks tre sådana villkor. 1) Vid statisk impingement är foten dorsalflexerad till < 110° i förhållande till skenbenet för att påverka insättningen, med knäet böjt för att minska spänningen. 2) För baslinjespänningsgruppen är fotleden utsträckt över 145° dorsalflexion med knäet utsträckt, vilket genererar övervägande dragbelastning vid insättningen. 3) För den obelastade gruppen odlas explantat i en petriskål med knä och fotled i neutrala positioner i frånvaro av externt applicerad belastning. Vinklarna som nämns ovan är fotografiskt uppmätta i förhållande till ett koordinatsystem där foten och skenbenet är parallella i en vinkel på 180° och vinkelräta i en vinkel på 90°.
Viktiga steg i protokollet inkluderar: 1) dissektion av bakbensexplantor och försiktigt avlägsnande av huden och plantarissenan; 2) explanteringsodling efter 48 timmars förbehandling med dexametason, 3) vävnadssnittning och histologisk färgning; och 4) färgbildsanalys för att bedöma fibrobroskbildning. Efter dissektion förbehandlas varje explantat av bakbenen i 48 timmar i odlingssubstrat kompletterat med dexametason74. Kontralaterala lemmar från varje mus tilldelas separata experimentgrupper för parvis jämförelse, vilket hjälper till att kontrollera biologisk variabilitet. Efter förbehandlingen placeras explantaten i plattformar enligt beskrivningen ovan och odlas i ytterligare 7 dagar (figur 1B). Ytterligare jämförelser görs med en förbehandlad grupp (dag 0) där explantat avlägsnas omedelbart efter 48 timmars förbehandling.
Efter explantationsodling trimmas bakbenen ner, formalin fixeras, avkalkas och bäddas in i paraffin. Seriell snittning i sagittal orientering ger visualisering av akillessenan från den myoendentinösa övergången till calcanealinsättningen samtidigt som sektionsdjupet kan spåras genom hela senan. Terminal deoxinukleotidyltransferas (TdT)-medierad dUTP X-nick labeling (TUNEL) används för att visualisera DNA-skador sekundärt till apoptos och bedöma viabilitet. Toluidinblå histologi och anpassad färgbildsanalys utförs för att kvantifiera förändringar i GAG-färgning. Toluidinblåfärgade vävnadssnitt används sedan för SHG-avbildning för att karakterisera förändringar i collagefiberorganisationen (Figur 1B).
De tillhandahållna representativa resultaten tyder på förändrad histologisk färgning av den GAG-rika matrisen och desorganisation av det extracellulära kollagennätverket som genereras av 7 dagars statisk impingement i modellen. Denna modell kan användas för att utforska molekylära mekanismer som ligger till grund för impingement-driven fibrobroskförändring.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorbent underpads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82020-845</td>
			<td>For benchtop dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic bath</td>
			<td>Source One</td>
			<td>X001G46CB1</td>
			<td>Contains the explant platform submerged in culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-361-20</td>
			<td>Used as secondary containment, holds two platforms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided line</td>
			<td>KastKing</td>
			<td>30lb test</td>
			<td>Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-541-034</td>
			<td>Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal XYL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>8312-4</td>
			<td>Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>MP Biomedical LLC</td>
			<td>194561</td>
			<td>CAS#50-02-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>D12345</td>
			<td>CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch Brand</td>
			<td>34-8724-5195-9</td>
			<td>To attach sandpaper to Grip platens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (1X DMEM)</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher</td>
			<td>11965092</td>
			<td>high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA tetrasodium salt dihydrate</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>J15700.A1</td>
			<td>CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 proof</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>T038181000</td>
			<td>CAS#64-17-5, 1 L supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam biopsy pads</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801000</td>
			<td>Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, #SS Standard Inox</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11203-23</td>
			<td>Straight, smooth, fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Micro-Adson 4.75&#34;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-820-073</td>
			<td>Straight, fine tips with serrated teeth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Garnet Sandpaper, 50-D Grit</td>
			<td>Norton</td>
			<td>M600060 01518</td>
			<td>Or other coarse grit sandpaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38S-500</td>
			<td>CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grips</td>
			<td>ADMET</td>
			<td>GV-100NT-A4</td>
			<td>Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histobond Adhesive Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16005-108</td>
			<td>Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12156792910</td>
			<td>TUNEL assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling tape</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15-959</td>
			<td>Or any other labeling tape of preference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544-100G</td>
			<td>CAS#50-81-7, for culture media formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered formalin, 10%</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3800600</td>
			<td>For sample fixation, 5 gallon supply</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7741-1CS</td>
			<td>100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (100X)</td>
			<td>Gibco by ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament</td>
			<td>Hatchbox</td>
			<td>-</td>
			<td>Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Processing cassettes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3802631</td>
			<td>For fixation, decalcification and paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>P36931</td>
			<td>Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1700-50</td>
			<td>CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, Fine</td>
			<td>FST</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>Straight, sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Staining Set, 12-place</td>
			<td>Mercedes Scientific&#160;</td>
			<td>MER 1011</td>
			<td>Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate, anhydrous</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>A1318430</td>
			<td>CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-964</td>
			<td>For paraffin sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue O</td>
			<td>Thermo Scientific Chemicals</td>
			<td>348601000</td>
			<td>CAS#92-31-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volume Reduction Insert</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>3D printed from CAD files provided as Supplementary Files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3803665</td>
			<td>4 gallon supply for histological staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine hind limb explant model for studying the mechanobiology of achilles tendon impingement

Senpåverkan på ben genererar en multiaxiell mekanisk töjningsmiljö med markant förhöjd tvärgående trycktöjning, vilket framkallar en lokaliserad fibrobroskfenotyp som kännetecknas av ackumulering av glykosaminoglykan (GAG)-rik matris och ombyggnad av kollagennätverket. Medan fibrobrosk är ett normalt inslag i inträngda regioner av friska senor, är överskott av GAG-avsättning och desorganisation av kollagennätverket kännetecknande drag för tendinopati. Följaktligen är impingement kliniskt erkänd som en viktig yttre faktor vid initiering och progression av tendinopati. Ändå är den mekanobiologi som ligger till grund för senimpingement fortfarande understuderad. Tidigare försök att klarlägga det cellulära svaret på senimpingement har tillämpat enaxlig kompression på celler och exciderat senexplantation in vitro. Isolerade celler saknar dock en tredimensionell extracellulär miljö som är avgörande för mekanosvaret, och både in vitro - och excuterade explanteringsstudier misslyckas med att rekapitulera den fleraxliga töjningsmiljön som genereras av senimpingement in vivo, vilket beror på anatomiska egenskaper hos den inträngda regionen. Dessutom saknar in vivo-modeller av senimpingement kontroll över den mekaniska töjningsmiljön. För att övervinna dessa begränsningar presenterar vi en ny modell för explantation av bakbenen hos möss som är lämplig för att studera mekanobiologin vid impingement av akillessenor. Denna modell bibehåller akillessenan in situ för att bevara den lokala anatomin och reproducerar den multiaxiella töjningsmiljön som genereras av ingrepp i akillessenan på calcaneus under passivt applicerad fotledsdorsalflexion samtidigt som cellerna behålls i sin ursprungliga miljö. Vi beskriver ett vävnadsodlingsprotokoll som är integrerat i denna modell och presenterar data som fastställer bibehållen explantationsviabilitet under 7 dagar. De representativa resultaten visar förbättrad histologisk GAG-färgning och minskad kollagenfiberinriktning sekundärt till impingement, vilket tyder på förhöjd fibrobroskbildning. Denna modell kan enkelt anpassas för att undersöka olika mekaniska belastningsregimer och möjliggör manipulering av molekylära vägar av intresse för att identifiera mekanismer som medierar fenotypisk förändring i akillessenan som svar på impingement.

A multitude of tendons, including the Achilles tendon and rotator cuff tendons, experience bony impingement due to normal anatomical positioning1,2,3,4. Tendon impingement generates compressive strain directed transversely to the longitudinal fiber axis5,6,7. Regions of tendon impingement demonstrate a unique fibrocartilage phenotype in which shrunken, round cells (fibrochondrocytes) are embedded within a disorganized collagen network with markedly increased glycosaminoglycan (GAG) content2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Prior studies suggest the disparate mechanical environment produced by tendon impingement sustains this GAG-rich matrix by driving the deposition of large aggregating proteoglycans, most notably aggrecan, although the underlying mechanisms are unclear1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. While fibrocartilage is a normal feature in impinged regions of healthy tendons, aberrant proteoglycan metabolism associated with excessive fibrocartilage formation is a hallmark feature of tendinopathy, a common and debilitating disease that disproportionately emerges in chronically impinged tendons1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. Accordingly, tendon impingement is clinically recognized as an important extrinsic factor driving several of the most common tendinopathies, including rotator cuff disease and insertional Achilles tendinopathy (IAT)50,51,52. Currently, treatment of tendinopathy is inefficient. For example, approximately 47% of patients with IAT require surgical intervention after failed conservative management, with variable postoperative outcomes53,54,55,56. Despite the apparent relationship between impingement and tendinopathy, the mechanobiological mechanisms by which cells in impinged tendon sense and respond to their mechanical environment are poorly described, which obscures understanding of tendinopathy pathogenesis and results in inadequate treatment.
Explant models are useful tools in the study of tendon mechanobiology57,58. As a first step towards understanding the mechanobiology of tendon impingement, several prior studies have explored cellular response following the application of simple uniaxial compression to cells or excised tendon explants27,29,30,31,32,33,34,39. However, cells in vitro lack extracellular and pericellular matrices that facilitate strain transfer, sequester important growth factors and cytokines released by mechanical deformation, and provide substrate for focal adhesion complexes that play a role in mechanotransduction57,59. Additionally, both in vitro and excised explant studies fail to recapitulate the multiaxial mechanical strain environment generated by tendon impingement in vivo, which depends on anatomical features of the impinged region5,6. In the context of the impinged Achilles tendon insertion, this includes surrounding tissues such as the retrocalcaneal bursa and Kager&#39;s fat pad60,61,62,63. Conversely, in vivo models of tendon impingement25,28,36,37,38,64,65,66 allow minimal control over the magnitude and frequency of load applied directly to the tendon, which is a well-recognized limitation of in vivo models for studying tendon mechanobiology57,58,67,68,69,70. Given challenges in measuring tendon strain in vivo, the internal strain environment generated within these models is often poorly characterized.
In this manuscript, we present a custom experimental platform that recreates impingement of the Achilles tendon insertion upon the calcaneus within whole murine hind limb explants that, when paired with this tissue culture protocol, maintains viability over 7 days in explant culture and allows for study of the biologic sequelae of tendon impingement. The platform is built upon a 3D printed polylactic acid (PLA) base that provides the foundation for the attachment of the grips and 3D printed PLA volume reduction insert. The grips are used to clamp the upper leg and knee proximal to the Achilles myotendinous junction with the caudal aspect of the hind limb facing upward, allowing the Achilles tendon to be imaged from above using an ultrasound probe or inverted microscope (Figure 1A). The volume reduction insert&#160;slides along a track on the base and reduces the required volume of tissue culture media. A braided line wrapped around the hind paw is routed out of the platform utilizing the base design and a 3D printed PLA clip. By pulling on the string, the hind paw is dorsiflexed, and the Achilles tendon insertion is impinged against the calcaneus, resulting in elevated transverse compressive strain5,6 (Figure 1A). The platform is contained within an acrylic bath that maintains the hind limb explants submerged in tissue culture media. Securing the taut string to the outside of the bath with adhesive tape maintains ankle dorsiflexion to produce static impingement of the Achilles tendon insertion. CAD files for 3D printed components are provided in multiple formats (Supplementary File 1), allowing import into a range of commercial and free, open-source CAD software for modification to suit experimental needs. If access to 3D printers is not available for fabrication, CAD files can be provided to online 3D printing services that will print and ship the parts at low cost.
Importantly, the triceps surae-Achilles musculotendinous complex spans both the knee and ankle joints71,72,73. Consequently, tensile strain in the Achilles tendon is influenced by knee flexion. Knee extension places the Achilles tendon under tension, whereas knee flexion reduces tension. By first extending the knee and then passively dorsiflexing the ankle, compressive strains at the impinged insertion can be superimposed upon tensile strains. Conversely, by passively dorsiflexing the ankle with the knee flexed, tensile strain is reduced, and compressive strain remains. The current protocol explores three such conditions. 1) For static impingement, the foot is dorsiflexed to &#60; 110&#176; with respect to the tibia to impinge the insertion, with the knee flexed to reduce tension. 2) For the baseline tension group, the ankle is extended above 145&#176; of dorsiflexion with the knee extended, generating predominately tensile strain at the insertion. 3) For the unloaded group, explants are cultured in a Petri dish with the knee and ankle in neutral positions in the absence of externally applied load. The angles referred to above are photographically measured relative to a coordinate system where the foot and tibia are parallel at an angle of 180&#176; and perpendicular at an angle of 90&#176;.
Key steps of the protocol include 1) dissection of hind limb explants and careful removal of the skin and plantaris tendon; 2) explant culture following a 48 h dexamethasone pretreatment; 3) tissue sectioning and histological staining; and 4) color image analysis to assess fibrocartilage formation. Following dissection, each hind limb explant is pretreated for 48 h in culture media&#160;supplemented with dexamethasone74. Contralateral limbs from each mouse are assigned to separate experimental groups for pairwise comparison, which helps control biological variability. After pretreatment, explants are positioned into platforms as described above and cultured for 7 more days (Figure 1B). Additional comparisons are made to a pretreated (day 0) group in which explants are removed immediately following the 48 h pretreatment.
After explant culture, hind limbs are trimmed down, formalin fixed, decalcified and embedded in paraffin. Serial sectioning in sagittal orientation provides visualization of the Achilles tendon from the myotendinous junction to the calcaneal insertion while allowing section depth to be tracked through the entire tendon. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP X-nick labeling (TUNEL) is used to visualize DNA damage secondary to apoptosis and assess viability. Toluidine blue histology and custom color image analysis are performed to quantify changes in GAG staining. Toluidine blue stained tissue sections are then used for SHG imaging to characterize alterations in collage fiber organization (Figure 1B).
The provided representative results suggest altered histological staining of the GAG-rich matrix and disorganization of the extracellular collagen network generated by 7 days of static impingement within the model. This model can be utilized to explore molecular mechanisms underlying impingement-driven fibrocartilaginous change.

Författare Spotlight: Att reda ut mekanobiologin för senimpingement - En multiaxial murin bakbens explantationsmodell 

Murin bakbensexplantationsmodell för att studera mekanobiologin vid impingement av akillessenan

We study the mechanobiology underlying tendon impingement and the process by which this unique mechanical demand drives localized fiber cartilage formation in health and disease. Here we seek to characterize matrix for modeling relative to spatially heterogeneous patterns of multiaxial mechanical strain, generated by impingement and to identify molecular mechanisms mediating this response. In vitro models for studying impingement mechanobiology have applied simple compression to isolated tendon cells or artificial uniaxial compression to partial and whole tendon explants.Established animal models of tendon impingement, manipulating external source of tendon impingement in vivo most often surgically and explore biology following resuming physical activity. In vitro models present significant limitations as isolated cells lack their three dimensional extracellular environment, crucial to mechano-response. While excised explant models circumvent this limitation, both fail to recreate multiaxial strain patterns generated by impingement in vivo.Conversely, animal models offer limited ability to measure or control internal tissue strains. Our Murine Hind Limb Explant Model for studying impingement mechanobiology maintains cells within their extracellular environment and preserves local anatomy of the impinged achilles tendon insertion in situ, allowing controlled prescription of impingement through passively applied joint motion to recreate multiaxial patterns of tissue strain that are measurable and well-characterized.

Representativa bilder av TUNEL-färgade vävnadssnitt visar minimala apoptotiska kärnor i akillessenans kropp efter 7 dagars explanteringsodling i experimentgrupperna (Figur 2A). Kvantifiering av dessa bilder ger belägg för att vävnadsodlingsprotokollet bibehåller upp till 78 % livsduglighet i genomsnitt i akillessenan efter 7 dagars explanteringsodling under belastningsförhållanden (Figur 2B).
Kvalitativt uppskattas förbättr...

Watch this Scientific Journal Video about Unraveling the Mechanobiology of Tendon Impingement – A Multiaxial Murine Hind Limb Explant Model at JoVE.com

Vi presenterar en anpassad experimentell plattform och vävnadsodlingsprotokoll som återskapar fibrobroskförändring som drivs av impingement av akillesseninsättningen i murina bakbensexplantor med bibehållen cellviabilitet, vilket ger en modell som är lämplig för att utforska mekanobiologin för senimpingement.

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a ...

Vi studerar mekanobiologin bakom senimpingement och den process genom vilken detta unika mekaniska krav driver lokal fiberbroskbildning i hälsa och sjukdom. Här försöker vi karakterisera matris för modellering i förhållande till rumsligt heterogena mönster av multiaxiell mekanisk töjning, genererad genom impingement och att identifiera molekylära mekanismer som medierar denna respons. In vitro-modeller för att studera impingementmekanobiologi har tillämpat enkel kompression på isolerade senceller eller artificiell enaxlig kompression på partiella och hela senexplantat.Etablerade djurmodeller för senimpingement, manipulering av extern källa till senimpingement in vivo oftast kirurgiskt och utforska biologi efter återupptagande av fysisk aktivitet. In vitro-modeller har betydande begränsningar eftersom isolerade celler saknar sin tredimensionella extracellulära miljö, som är avgörande för mekano-responsen. Även om excuterade explantmodeller kringgår denna begränsning, misslyckas båda med att återskapa fleraxliga töjningsmönster som genereras genom impingement in vivo.Omvänt erbjuder djurmodeller begränsad förmåga att mäta eller kontrollera inre vävnadsstammar. Vår Murin Hind Limb Explantation-modell för att studera impingementmekanobiologi upprätthåller celler i deras extracellulära miljö och bevarar den lokala anatomin av den inträngda akillessenan in situ, vilket möjliggör kontrollerad förskrivning av impingement genom passivt applicerad ledrörelse för att återskapa multiaxiella mönster av vävnadsbelastning som är mätbara och väl karakteriserade.

murine-hind-limb-explant-model-for-studying-mechanobiology-achilles

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a localized fibrocartilage phenotype characterized by accumulation of glycosaminoglycan (GAG)-rich matrix and remodeling of the collagen network. While fibrocartilage is a normal feature in impinged regions of healthy tendons, excess GAG deposition and disorganization of the collagen network are hallmark features of tendinopathy. Accordingly, impingement is clinically recognized as an important extrinsic factor in the initiation and progression of tendinopathy. Nevertheless, the mechanobiology underlying tendon impingement remains understudied. Prior efforts to elucidate the cellular response to tendon impingement have applied uniaxial compression to cells and excised tendon explants in vitro. However, isolated cells lack a three-dimensional extracellular environment crucial to mechanoresponse, and both in vitro and excised explant studies fail to recapitulate the multiaxial strain environment generated by tendon impingement in vivo, which depends on anatomical features of the impinged region. Moreover, in vivo models of tendon impingement lack control over the mechanical strain environment. To overcome these limitations, we present a novel murine hind limb explant model suitable for studying the mechanobiology of Achilles tendon impingement. This model maintains the Achilles tendon in situ to preserve local anatomy and reproduces the multiaxial strain environment generated by impingement of the Achilles tendon insertion upon the calcaneus during passively applied ankle dorsiflexion while retaining cells within their native environment. We describe a tissue culture protocol integral to this model and present data establishing sustained explant viability over 7 days. The representative results demonstrate enhanced histological GAG staining and decreased collagen fiber alignment secondary to impingement, suggesting elevated fibrocartilage formation. This model can easily be adapted to investigate different mechanical loading regimens and allows for the manipulation of molecular pathways of interest to identify mechanisms mediating phenotypic change in the Achilles tendon in response to impingement.

We present a custom experimental platform and tissue culture protocol that recreates fibrocartilaginous change driven by impingement of the Achilles tendon insertion in murine hind limb explants with sustained cell viability, providing a model suitable for exploring the mechanobiology of tendon impingement.

Explant Dissection to Generate Murine Hind Limb Explant Model to Study Tendon Impingement

To begin, transfer 70 milliliters of pre-warmed Dulbecco's Modified Eagle Medium into a Petri dish in a sterile biosafety cabinet and add dexamethasone at a concentration of 100 nano molar. Assemble the surgical tools required for the dissection, which includes smooth, straight, fine tip forceps. Straight fine tip forceps with serrated teeth and straight sharp fine scissors.To dissect hind limb explants. Locate the hip joint of a euthanized mouse positioned supine on the bench top lined with absorbent under pads. Use fine scissors to create a small incision on the skin covering the proximal and anterior aspects of the upper leg.Then use fingers to pull the incision apart to expand and pinch the exposed upper leg. Carefully pull the skin distally to de-glove the hind limb to the level of the ankle. Insert one scissor blade gently under the skin along the dorsal aspect of the foot.Then make an incision that extends towards the toes and continue pulling the skin distally until it is completely removed. Position the mouse to have a clear view of the Achilles tendon insertion onto the posterior aspect of the calcaneus near the ankle. To remove the plant terrace tendon, insert one tip of the smooth fine tip forceps between the two tendons.Pass the tip medially under the plantaris tendon. Then pull it proximally to tear through the plantaris muscle. Then using fine tip serrated forceps, grasp the detached proximal end of the plantaris tendon and pull it distally to completely remove it.At the hip joint, employ fine scissors to precisely sever through the pelvis, isolating the hind limb. Use the scissors to gently remove the remaining pelvis, revealing the femoral head. In the biosafety cabinet transfer the hind limb explant into the dish containing cell culture media and dexamethasone.Relocate the dish to the incubator and subject it to pre-treatment for 48 hours.

Explantationsdissektion för att generera murin bakbensexplantationsmodell för att studera senimpingement

Explant Culture and Platforms Loading to Study the Biologic Sequelae of Tendon Impingement

To begin, preheat an adequate amount of sterile culture media while the 48-hour dexamethasone pretreatment of murine hindlimb explant is about to complete. Once the pretreatment ends, move the pretreated explants to the biosafety cabinet. For the unloaded group, aspirate the pretreatment media and transfer the explants to fresh Petri dishes.Add 70 milliliters of culture media to each dish before returning them to the incubator. To prepare the explant platforms for the baseline tension and static impingement group, cut pieces of sandpaper to match the size of the grip platens. For the static impingement group, cut pieces of braided line and pret tie a loose overhand knot halfway along the length of the line.Tear pieces of aluminum foil to cover each acrylic bath and spray them with 70%ethanol. Transfer the prepared components to the biosafety cabinet. Arrange the components such as acrylic bath, base, volume reduction inserts, clip, and grips for platform assembly.Place platform components inside secondary containers of sufficient volume to contain any potential culture media leaks. Submerge the containers in a solution of at least 10%bleach for a minimum of one hour. Rinse the bleach solutions with tap water.After transferring the rinsed components to the biosafety cabinet, use M3 screws and compression springs to affix the platens to the grips. Securely attach the grips to the base employing an M5 screw and insert the M6 screws until they contact the platens. Enhance the platens'functionality by affixing sandpaper using double-sided tape.Close the grips to facilitate the adhesion of the sandpaper to the platens. To load a platform, fully open the grips and use forceps to carefully position the upper leg and knee between the platens. Close the grips gently to hold the limb in place.Use forceps to grasp the exposed femoral head or foot and adjust the knee flexion angle, while gradually closing the forceps to secure it in place. For the baseline tension group, extend the knee joint while closing the grips. In the case of the static impingement group, flex the knee joint while closing the grips.For the static impingement group, place the overhand knot of the string around the distal paw and tighten it securely. Route the string through a slot in the base underneath the explant and through the clip hole. Position the base into the acrylic bath and fasten the clip to the top edge of the bath.To dorsiflex the foot, pull the string until it reaches at least 110 degrees relative to the tibia. Use a permanent marker to mark the string as it exits the clip. Capture a photograph of the explant in this dorsiflexed position for future quantification of the dorsiflexion angle.Remove the base from the setup and attach the volume reduction insert by sliding it along a track on the base. Place the base back into the acrylic bath and reposition the clip on the top edge. Use the marked string as a guide.Pull it to restore the foot to its original dorsiflexion angle and secure the string to the exterior of the bath using tape to maintain a static dorsiflexed position. For the baseline tension group, once the explant is positioned between the grips, take a photograph to quantify the dorsiflexion angle. Then slide the volume reduction insert onto the base and place it into the acrylic bath.Add 125 milliliters of prewarmed culture media to each platform to submerge the explants. After covering the top of the bath with aluminum foil, place the entire setup into a secondary container. Relocate the secondary container to the incubator and culture for seven days.