Name: biobanking of human aqueous and vitreous liquid biopsies for molecular analyses
Uploaded: 2023-09-11T14:00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biobanking of Human Aqueous and Vitreous Liquid Biopsies for Molecular Analyses at JoVE.com

VBM得到了NIH资助（R01EY031952，R01EY031360，R01EY030151和P30EY026877），斯坦福视盘玻璃疣中心和美国纽约预防失明研究的支持。JW和DR由美国玻璃体视网膜手术基金会支持。DR由灵北基金会赞助的DARE奖学金支持。

该协议遵循美国斯坦福大学人类受试者研究机构审查委员会（IRB）的指导方针。
注意：本协议是合格眼科外科医生的指南。在眼内恶性肿瘤的情况下，不能排除房水或玻璃体液活检情况下的眼外肿瘤播种。然而，经玻璃体脉络膜肿瘤活检的眼外延伸和眼眶受累的风险极低，这是以安全性增强的方式进行的，并仔细考虑进入部位6。该方案不包括视网膜母细胞瘤或具有高转移风险的肿瘤，并且可能禁忌。
1. 样品采集前
<ol><li>机构审查委员会批准
	<ol><li>在实验开始前获得当地IRB的批准，并相应地进行样品收集。</li>
	</ol></li>
	<li>研究人群
	<ol><li>纳入标准：包括在该机构接受眼内手术的所有患者（0 - 99 岁），该机构将提供足够数量的房水或玻璃体液体，超过适当的诊断测试所需的量，以评估患者的病情和希望参与的患者。</li>
		<li>排除标准：排除拒绝参加的患者和孕妇。</li>
	</ol></li>
</ol>
<ol start="3"><li>知情同意
	<ol><li>按照IRB批准的方案获得每位患者的书面知情同意。</li>
		<li>将签名的同意存档到安全的数据库中。</li>
		<li>如本协议所述，培训相关人员（外科医生、实验室技术人员、手术室 （OR） 工作人员、科学家）。</li>
		<li>设置示例管理数据库。使用 REDCap 作为符合 HIPAA 标准的基于 Web 的样本数据库，旨在支持研究的数据捕获5. 注意：本文介绍如何使用 REDCap 提供的基于 Web 的界面来设计表单、定义字段、设置分支逻辑和应用数据验证规则，而无需广泛的编程知识。或者，其他软件，例如标准电子表格应用程序，也可能是合适的。</li>
		<li>确保冷却箱、干冰、样品采集注射器和冷冻管的可用性（见 材料表）。使用带有永久蚀刻在小瓶上的条形码的冷冻管。这消除了在小瓶上添加患者标识符的需要，以及在冷冻条件下丢失标签的可能性。</li>
		<li>在预定手术前至少 24 小时通知外科医生和实验室技术人员，他们将在手术前至少 24 小时帮助采集样本。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 在手术室采集手术标本
<ol><li>移动手术室实验室界面（莫利）
	<ol><li>在手术室建立MORLI。MORLI包括一个平坦的实验室工作台表面，一台带有条形码扫描仪的计算机/平板电脑，可以访问REDCap数据库，以及一个带干冰的冷却箱（见 材料表）。 注意：干冰非常冷。处理干冰时始终戴手套，避免触摸干冰。</li>
	</ol></li>
	<li>在手术室中制备样品采集
	<ol><li>登录MORLI上的计算机/平板电脑并打开REDCap数据库。</li>
		<li>检查患者是否已签署知情同意书，并与外科医生确认。提醒他/她需要未稀释的样品。</li>
		<li>戴手套。获取适当数量的条形码冷冻管（房水为 0.5 mL，玻璃体样品为 1.9 mL），并将其放置在易于接近的地方。</li>
	</ol></li>
	<li>房水活检的收集 注意：将人体组织样本视为生物危害性材料，这需要适当的预防措施，例如实验室外套和手套，以确保相关人员的安全。 注意：以下步骤只能由训练有素的眼科医生执行。房水活检可以在白内障手术开始时获得，白内障手术是全球最常见的手术之一。 注意：根据手术室的标准护理协议保持无菌区域。与患者麻醉相关的术前程序遵循前房和玻璃体视网膜手术的标准护理步骤。<ol><li>准备并悬垂眼睛进行手术，并放置无菌眼睑窥器，以获得最佳无菌区域的可视化效果。</li>
		<li>使用手术显微镜使用连接到 1 mL 注射器的 30-32 G 针头进行垂直于角膜缘的前房穿刺术。在此过程中，使用棉尖或小镊子稳定眼睛。 注意：确保针头和注射器已锁定，并且注射器中没有压力（通过移动柱塞）。确保针尖保持在中前房的外周虹膜上，以避免损伤眼内结构。在白内障手术的情况下，获得液体活检的针头也可以通过为白内障手术创建的穿刺者之一进入前房。</li>
		<li>在通过显微镜直接可视化的情况下，使用 1 mL 注射器手动吸出约 100 μL 未稀释的房水。用外科医生的非惯用手或训练有素的助手移动注射器柱塞，而无需移动针头。 注意：获得少于 100 μL 的房水，以防前房塌陷。</li>
		<li>小心地从前房取出针头。 注意：在有晶状体眼睛中，将针保持在虹膜上以避免接触晶状体。眼球上的正压会增加反流。在拔出针头之前松开棉尖有助于减少回流。</li>
		<li>拉回柱塞，看看空气和收集的流体是如何移动的。</li>
		<li>将注射器注入冷冻管。额外的空气清除注射器的死角。</li>
		<li>使用冷冻管上的条形码将样本扫描到手术室计算机上的REDCap表格（更多详细信息见步骤3.1至3.9）。</li>
		<li>立即将冷冻管转移到冷却箱中的干冰中。</li>
		<li>继续为患者安排的手术（例如，如前所述7 的白内障手术）。</li>
	</ol></li>
	<li>玻璃体液体活检的采集 注意：以下步骤只能由训练有素的玻璃体视网膜外科医生执行。玻璃体液体活检可在玻璃体切除术开始时进行8.由于目标是收集未稀释的玻璃体样品，因此玻璃体切除术切割机不会灌注液体1。 注意：根据手术室的标准护理协议保持无菌区域。与患者麻醉相关的术前程序遵循前房和玻璃体视网膜手术的标准护理步骤。<ol><li>准备并悬垂眼睛进行手术，并放置无菌眼睑窥器，以获得最佳无菌区域的可视化效果。</li>
		<li>按照标准护理程序，使用 23、25 或 27 G 套管进行菌核切除术。插入输液插管并目视确认玻璃体腔中的适当位置。</li>
		<li>在玻璃体腔中，无需输注即可激活玻璃体切割器以收集未稀释的玻璃体样品。使用连接到玻璃体挤出插管的注射器手动吸出 0.5 至 1.0 mL 玻璃体1.</li>
		<li>从眼睛上取下玻璃体切割器并打开液体输注。</li>
		<li>将管内剩余的液体吸入注射器中。</li>
		<li>断开注射器。</li>
		<li>按照第2.3节（步骤2.3.5至步骤2.3.9）中对房水样品的描述处理样品。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 在手术室中处理样本并将样本添加到数据库中
<ol><li>要求实验室技术人员取出准备好的冷冻管（房水为 0.5 mL，玻璃体样本为 1.9 mL），并在不接触任何无菌手术室设备的情况下步行到外科医生处。</li>
	<li>请实验室技术人员打开冷冻管。</li>
	<li>将注射器直接卸载到冷冻管中。</li>
	<li>请实验室技术人员立即回顾冷冻管。</li>
	<li>请实验室技术人员走回MORLI，并立即将样品转移到冷却箱（-80°C）中的干冰上。合上盒子的盖子。</li>
	<li>打开新的示例收集表单。在表格的相应字段中输入以下信息：病例外科医生、收集地点和日期、患者标识符号和其他基本信息，例如年龄、性别、右眼或左眼、诊断、术前病史（自由文本）、有关程序的信息（例如，手术类型）以及有关样本的信息，例如收集的样本数量， 样品类型（房水、玻璃体）和其他细节，如体积。使用条形码扫描仪添加管条形码。</li>
	<li>单击 提交/下一步。</li>
	<li>如果收集了任何其他样本，请重复步骤 3.1 到 3.7。</li>
	<li>保护所有示例后，单击“ 保存并提交” REDCap 示例收集“表单。然后注销数据库和计算机/平板电脑。</li>
</ol>4. 将冷冻管转移到储存室
<ol><li>将冷却箱中的干冰样品从手术室运输到实验室，并将其放在实验室计算机旁边的实验室工作台上。</li>
	<li>使用您的登录ID和密码在实验室计算机上登录REDCap。</li>
	<li>戴手套。取收集到的样本之一，并将冷冻管的条形码扫描到数据库中（更多详细信息见第5节）。立即将样品放回干冰上。</li>
	<li>获得第二个装满干冰的容器。</li>
	<li>从-80°C冰箱中获取冷冻管架。将其放入干冰上的第二个容器中。 注意：0.5 mL 体液水管需要一个 96 规格的架子，1.9 mL 玻璃体液管需要一个 48 规格的架子。</li>
	<li>将机架的条形码扫描到数据库（更多详细信息见第 5 节）。</li>
	<li>将样品转移到架上。</li>
	<li>将样品瓶在架子中的位置添加到数据库中（更多详细信息见第5节）。</li>
	<li>单击 保存并提交。</li>
	<li>将装有小瓶的架子在干冰上运送到冰箱中，以在-80°C下储存。 使用坐标系将架子添加到冰箱中的特定位置。这将允许以后轻松检索样品进行下游分析。</li>
</ol>5. 样品存储表格
<ol><li>为在输入表单阶段收集的每个样品填写存储表格。单击 空圆圈 或样品存储下的“+”以创建并打开新的 存储 表单。</li>
	<li>在 “记录存档日期”下输入此表单的填写日期。</li>
	<li>扫描或键入试管 条形码下的试管条形码。立即将样品放回干冰上。</li>
	<li>选择是将样品移出还是将样品放入内部生物储存库。</li>
	<li>验证是否已从患者处获得书面知情同意，并选中“验证同意 合规性 ”下的框，然后在 “同意验证者”下输入您的姓名。</li>
	<li>为架子中的冷冻管选择一个空闲且合适的位置。将这个位置的冷冻管转移到架子上（例如，位置A1）。将架子放在干冰上。</li>
	<li>在“位置”阶段，输入以下信息：冰箱下冰箱的位置、样品存放在货架下的货架号、盒子条形码下的盒子条形码、逐行（管位置（行））和列（管位置（列））中的试管位置。 注意：或者，也可以在“箱子标签”下输入箱子标签，这可能有助于在冰箱中找到 箱子。</li>
	<li>在 “使用情况 ”部分下，输入以下信息：示例用于的项目的名称（项目名称）、以下类别之一的样本体积：完整、部分、接近空或空（样本体积），以及 存储注释下的存储注释（如果适用）。 注意：上次访问表单的日期、时间和用户会自动填充，以确保可以根据需要查看和审核监管链。</li>
	<li>通过单击“完成？”下的“完成”来确认表单已完成。</li>
	<li>单击“ 保存并退出表单”。这将带您回到患者概述。</li>
	<li>对于收集的每个试管，通过单击样品存储下的“+”生成另一个 样品收集表。然后重复步骤 5.1 到 5.10。</li>
	<li>单击 保存并退出 以填写表单并注销数据库和计算机/平板电脑。</li>
	<li>将样品架（在干冰上）转移到冰箱的预定位置。</li>
</ol>6. 提取手术标本进行下游分析
注意：标本通常在分析之前存档数年。条形码冷冻管和可搜索的REDCap数据库系统可以轻松查找和定位每个样品以进行下游分析。
<ol><li>通过使用数据库的搜索功能识别实验感兴趣的样本。这将允许从20至40岁的糖尿病视网膜病变患者中发现例如所有房水样本。</li>
	<li>获取感兴趣的冷冻管的位置（冰箱、搁架/架子、样品架、样品架内的坐标）。将它们写下来，打印出来，或在移动计算机/平板电脑上提供，以方便在冰箱中查找样品。</li>
	<li>将示例标记为在数据库中使用。</li>
	<li>单击 保存并退出 以填写表单并注销 REDCap 和计算机/平板电脑。</li>
</ol>

<ol>
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作者没有什么可透露的。

来自患者的手术标本允许对活人2,3,4,14的疾病进行直接分子表征，并且可能有助于克服不能完全概括人类疾病的细胞和动物疾病模型的局限性15,16。人体组织的分子分析可以改善新药靶点的选择，并可能有助于提高临床试验和药物批准的成功率17。此外，这种方法提供了个性化医疗的潜力，因为获得的组织保留了每个人独特的基因组、表观基因组、代谢、糖组和蛋白质组指纹2,18,19。
高质量且一致的样品质量是所有分子分析应用的基础。先前的研究表明，样品回收后立即冷冻并避免重复冻融循环对于高样品质量至关重要9,20。在-70°C下长期储存数年不会显着影响蛋白质组学谱9的完整性。标准化协议是减少偏差和提高科学数据可比性的重要基础，特别是当几个人（外科医生、技术人员和其他人）或不同的机构参与采样过程时。除了样品质量外，样品的注释是另一个需要标准化的重要因素，以便将分子发现与临床数据相关联。我们的方案依赖于三个基本原则来实现这一点：1）眼科医生对房水和玻璃体液活检的标准化采样程序，2）实验室人员在手术室中立即处理和快速冷冻样本，以及3）基于Web的数据库中每个样本的元数据注释，使研究人员能够快速找到样本以供以后的实验。
除了玻璃体标本20外，该工作流程还建立了用于分子分析的房水液体活检的标准化集合。房水是眼睛前房中一种高度接近的复杂液体，不仅反映眼前部的眼部疾病，还反映眼睛后段的眼部疾病，包括视网膜疾病18,21。除了可以收集大量房水样本的事实之外，例如在白内障手术期间，这是全球最常进行的手术之一，这些特征使其成为人眼液体活检的有趣来源。在该工作流程中建立的每个样本的标准化元数据注释也可以允许蛋白质组数据与前瞻性临床随访数据相关联。这为确定新的预后生物标志物提供了令人兴奋的机会，这可能有助于估计未来患者的预后。
然而，人体手术标本的分子分析也具有重要的局限性。例如，复杂的实验操作通常只能在动物和细胞模型中进行。一种解决方案可能是将动物或细胞模型的分子谱与人类疾病的分子谱进行比较。该策略可以识别重叠的蛋白质生物标志物和治疗靶点，这些标志物和治疗靶点可以在动物或细胞模型中进行验证，以确定与人类疾病相关并可能在临床试验中取得成功的最有希望的候选药物4,16。
总之，我们的工作流程在手术室和研究实验室之间建立了一个实用的接口，允许标准化和高通量地收集、注释和存储用于分子下游分析的高质量手术标本，为未来的转化研究提供了宝贵的基础。

人眼液体活检的分子分析可以捕获局部富集的液体，其中包含来自高度专业化的眼组织中的分子，例如DNA，RNA，蛋白质，聚糖和代谢物。从人眼后房玻璃体进行的液体活检被证明是一种普遍安全的手术1。它们允许对活人的眼部疾病进行分子表征，并提供识别新的诊断和治疗策略的潜力2,3,4。眼前房水具有更高的手术可及性，并且可以大量获得，例如，在白内障手术期间，这是最常进行的手术之一。然而，到目前为止，还没有用于分子下游分析（包括蛋白质组学、代谢组学和糖组学）的人房房水和玻璃体液活检的收集、注释和生物样本库的标准化方案。
在这里，我们开发了一种协议，用于收集和生物库的高质量液体活检，用于接受眼科手术的患者的分子分析。移动手术室实验室接口（MORLI）使研究人员能够立即将收集的样品在手术室（OR）的干冰上-80°C的条形码冷冻管中快速冷冻。该程序可确保下游分子分析的高质量和一致性。除了出色的样品质量外，生物样本库中样品的准确注释也至关重要。使用符合 HIPAA（健康保险流通与责任法案）的基于 Web 的 REDCap（研究电子数据采集）数据库5，我们的工作流程允许存储每个样本的详细元数据，包括年龄、性别、疾病、疾病阶段、样本类型和手术的独特特征。这将允许准确的未来搜索能力，例如，来自特定疾病或特定患者群体的样本。此外，使用笛卡尔网格系统存档冰箱中每个样品的确切位置，从而为下游实验提供高效的样品检索。我们展示了DNA、蛋白质、聚糖和代谢物分析的示例。
我们的工作流程代表了手术室和研究实验室之间的实际和有效的联系，并为转化研究提供了宝贵的基础。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5ml Tri-coded Tube, 96-format, External Thread</td>
			<td>Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA</td>
			<td>68-0703-12</td>
			<td>used for aqueous humor samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>surgical grade, whatever available in hospital</td>
			<td>-</td>
			<td>for aqueous humor biopsies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.9ml Tri-coded Tube, 48-format, External Thread</td>
			<td>Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA</td>
			<td>65-7643</td>
			<td>used for vitreous samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe</td>
			<td>surgical grade, whatever available in hospital</td>
			<td>-</td>
			<td>for vitreous biopsies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-32-gauge needle</td>
			<td>surgical grade, whatever available in hospital</td>
			<td>-</td>
			<td>for aqueous humor biopsies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary electrophoresis coupled with Fourier transformed mass spectrometry (CE-FTMS)</td>
			<td>Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japan</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constellation vitrectomy system with 23-, 25-, or 27-gauge trocar cannula system</td>
			<td>Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>for vitreous biopsies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling box</td>
			<td>Standard styrofoam box, whatever available in lab</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td>Whatever available in lab</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handsfree Standard Range Scanner Kit with Shielded USB Cable</td>
			<td>Zebra Symbol&#160;</td>
			<td>DS9208-SR4NNU21Z</td>
			<td>Barcode scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Glycosylation Antibody Array L3&#160;</td>
			<td>RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA</td>
			<td>GAH-GCM-L3</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac mini</td>
			<td>Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaboAnalyst software</td>
			<td>Pang et al., 2021, PMID: 34019663</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for 0.5ml tubes, 96-Format</td>
			<td>Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA</td>
			<td>66-51026</td>
			<td>for aqueous humor samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for 1.9ml tubes, 48-Format</td>
			<td>Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA</td>
			<td>65-9451</td>
			<td>for vitreous samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REDCap browser-based sample database</td>
			<td>REDCap Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biobanking of human aqueous and vitreous liquid biopsies for molecular analyses

转化研究的一个关键挑战是在手术室（OR）和研究实验室的患者护理之间建立可行且有效的接口。在这里，我们开发了一种方案，用于从接受眼科手术的患者的房水和玻璃体中获取高质量的液体活检以进行分子分析。在该工作流程中，配备计算机、条形码扫描仪和实验室仪器（包括机载冷库）的移动手术室实验室接口 （MORLI） 推车用于获取和存档人类生物样本。基于网络的数据隐私兼容数据库可以在每个样品的整个生命周期内对其进行注释，笛卡尔坐标系允许跟踪存储中的每个条形码样品，从而能够快速准确地检索样品以进行下游分析。人体组织样本的分子表征不仅是一种诊断工具（例如，区分感染性眼内炎和其他非感染性眼内炎症），而且还代表了转化研究的重要组成部分，允许识别新的药物靶点，开发新的诊断工具和个性化治疗。

收集的液体活检标本可以进行各种分子分析，包括DNA、蛋白质、聚糖和代谢物的分析。之前已经表明，在-70°C下长期储存数年不会显着影响蛋白质组学谱9的完整性。REDCap数据库可以简单快速地检索样品。该数据库可以搜索来自特定患者组的样本，例如，所有糖尿病视网膜病变患者。然后，数据库将提供管子的条形码和存储位置。到目前为止，我们已经收集并存档了 1,000 多份液体活检。该数据库使我们能够快速找到用于下游分析3,10的样品，并帮助执行以下实验。
一名 17 岁女性因视网膜和视神经炎症就诊。她免疫功能低下，担心感染。从她的右眼收集房水并送去进行DNAPCR分析。结果为巨细胞病毒阳性，单纯疱疹病毒和弓形虫病阴性。这些发现表明，房水活检可以帮助区分感染性和非感染性眼内炎症，这对于选择合适的治疗方法至关重要。
液相色谱-质谱法能够对蛋白质组进行无偏和半定量分析。在接受玻璃体切除术的患者玻璃体的液体活检中，该技术能够识别484种独特的蛋白质，包括补体C3（C3），光学素（OPTC）和II型胶原蛋白Alpha 1（COL2A1）（图1A）。
使用糖蛋白组学多重ELISA分析三种玻璃体液体活检（见 材料表）11。该测定检测了500种人类蛋白质的糖基化谱，捕获了多种生物途径，例如代谢，免疫反应，细胞粘附和肌动蛋白组织（图1B）。
使用毛细管电泳与傅里叶变换质谱法12（见材料表）的代谢组学筛选在三种房水液体活检样品中鉴定了292种不同的代谢物。途径分析（见材料表）13确定了多种代谢途径，包括氨基酸代谢、尿素循环和肉碱合成（图1C）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65804/65804fig01.jpg"> 图1：代表性结果 。 （A）使用液相色谱和串联质谱（LC-MS/MS）对人玻璃体液进行蛋白质组学分析，在单个液体活检中鉴定出484种独特的蛋白质。蛋白质水平根据光谱计数显示和排名。代表性蛋白质以蓝色突出显示。（B）糖蛋白组学多重ELISA在三个玻璃体液体活检中检测到500种独特蛋白质的糖基化水平。STRING蛋白质相互作用分析确定了蛋白质相互作用的簇（显示了至少具有10种蛋白质的簇）。显示了每个集群最显着的富集途径。（C）使用质谱法进行代谢组学分析，在三种房水液体活检中鉴定出292种不同的代谢物。每个点代表一个样本。条的高度对应于代谢物的平均数量，误差条代表标准偏差。右侧面板显示了显著丰富的途径。显示了检测到的代谢物（分子）的数量以及每个途径（分母）中的代谢物总数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65804/65804fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>

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Biobanking of Human Aqueous and Vitreous Liquid Biopsies for Molecular Analyses

该协议提供了一个集成的生物存储库平台，用于高质量人房水和玻璃体液体活检的标准化收集、注释和生物库，用于分子下游分析，包括蛋白质组学、代谢组学和糖组学。

用于分子分析的人水和玻璃体液体活检的生物样本库

A critical challenge in translational research is establishing a viable and efficient interface between patient care in the operating room (OR) and the ...

人眼液体活检的分子分析可以捕获来自高度专业化的眼组织含有数千种不同分子的局部富集液体。它们允许对活人的眼部疾病进行分子表征，并具有进一步确定新型诊断和治疗策略的潜力。在这里，我们开发了用于在眼内手术期间高质量房水和玻璃体液体活检的标准化收集和生物库的方案。该协议的一部分是基于网络的数据隐私合规数据库，用于在其生命周期内注释每个样品，并使用坐标系来跟踪每个条形码样本在存储中的位置，从而能够为下游实验（如蛋白质、聚糖和代谢物分析）提供高效的样品检索。使用手术显微镜使用连接到 1 ml 注射器的 30 至 32 号针头进行垂直于角膜缘的前房穿刺术。在此过程中，棉签可用于稳定眼睛。确保针尖保持在中前房的周边虹膜上，以避免损伤眼内结构。在通过显微镜直接观察的情况下，使用一毫升注射器手动吸出约一百微升未稀释的房水。然后小心地将针头从前房中取出。在有晶眼中，将针保持在虹膜上以避免接触晶状体。眼球上的正压会增加反流。在拔出针头之前松开棉尖有助于减少回流。拉回水管工，看看空气和收集的液体是如何移动的。将注射器注入冷冻瓶中。额外的空气清除注射器死区。在这里，您可以看到永久蚀刻在小瓶上的条形码。然后使用条形码将样本扫描到手术室计算机上的REDCap表格。冷冻瓶将立即转移到冷却箱中的干冰上。玻璃体液体活检可在玻璃体切除术开始时由训练有素的玻璃体视网膜外科医生进行。请注意，玻璃体切除术切割机不会灌注液体。在玻璃体腔中，无需输注即可激活玻璃体切割器以收集未稀释的玻璃体样品。使用连接到玻璃体挤出套管的注射器手动吸出0.5至1ml玻璃体。然后按照我们演示的准确肱骨标本对样品进行处理。此视频是在调查视图中 REDCap 中完成的示例收集表单的演练。一旦患者在临床研究协调员的协助下完成电子同意书，就会填充此表格。它可以在患者获得电子同意的同一设备上访问，也可以使用任何其他批准的设备访问。可以在此处访问已完成的电子同意书的副本，以便验证签名。然后，协调员填写其他相关部分，包括同意类型，并在此蓝色部分中填写有关病例本身的详细信息，例如病例外科医生，手术地点，收集日期以及其他相关信息。在下一个绿色患者部分中，我们有患者人口统计数据，包括样本MRN，患者的名字和姓氏，他们的性别，出生日期以及自动计算年龄，受影响眼睛的偏侧性和诊断类别。此窗体具有分支逻辑，因此当选中复选框时，它会影响其下方复选框的外观。在这种情况下，这是一个前段和视网膜病例。所以首先，填充诊断视网膜框。协调员已选择这是一个黄斑孔，并且前节诊断框也已填充。在这种情况下，看起来像是白内障。术前历史记录表单也填充为自由文本框。在这里，可以复制和粘贴来自 EMR 的信息，或者可以输入有关术前历史记录的新信息以供将来参考。接下来，在这个红色部分中，我们有程序框。在这种情况下，看起来像是扁平玻璃体切除术与phaco IOL一起选择的。此处未填充的任何复选框都可以使用遍布整个表单的其他框以自由文本形式输入。有关案件本身的相关细节也已完成。最后，在这个黄金部分，我们有一个收集区。此处输入了收集标本的协调员的姓名以及正在使用的标本管数量。同样，使用分支逻辑，我们能够收集案例所需的任意数量的样本。在这种情况下，收集了两个样本，看起来像玻璃体核心和前房液体样本。这些样品中的每一个的条形码都已在此处扫描并记录到表格中。最后，还有一个示例收集笔记部分，协调员可以在其中输入相关详细信息，包括抽取流体的体积和质量。在最终文件上传部分，任何相关的照片、视频或文档都可以上传到表单本身并链接。最后，一旦一切都完成，协调员可以单击下一步提交，并保存表格并存储所有相关信息，从而将样本与患者成功连接。将干冰上的样品从手术室运送到实验室。在实验室计算机上登录到 REDCap。取一个收集的样本并将条形码扫描到数据库中。现在，需要第二个装有干冰的容器和一个用于冷冻瓶的架子。样品架的条形码也将被扫描到数据库中，样品被转移到样品架上。样品瓶在架子中的位置被添加到数据库中，条目被保存和关闭。然后将装有小瓶的架子在干冰上运输到冰箱，在零下80摄氏度下储存。使用坐标系将架子添加到冰箱中的特定位置。这将允许稍后轻松检索样品以进行下游分析。此视频是示例存储窗体的演练。在这里，我们看到患者概述记录。此绿色圆圈表示样本收集输入表单已完成。此空圆圈表示必须填写存储表单。对于在输入表单阶段收集的每个样品，必须填写存储表格。单击此圆圈将带我们进入第一个样品存储表单。在这里，我们可以看到已经生成了PID，并且MRN已被屏蔽。该信息仍然可以访问，并且可以通过单击输入表单中的绿色圆圈来访问上一页。在此页面完成后，将在此处生成样本快照。在收集说明下，我们看到信息已从条目表单中自动导入。接下来，在记录存档日期下，我们可以输入完成此表单的日期。在标本管条形码下，我们扫描或重新输入正在存档的管子的条形码。此标本快照正在实时更新。在本节中，我们可以选择是否正在转移样本。在这里，我们输入该相关信息。为了这个例子，我们将指出这是一个进入内部生物存储库存储的示例。在验证下，研究协调员可以返回并验证电子同意书或纸质同意书是否已成功完成并在协议范围内完成。输入完成此验证的人员的姓名，并使用此下拉列表，验证器将此处的条形码与刚刚键入的内容进行匹配。这确保了准确性。接下来，在这个位置阶段，我们看到将要储存样品的冰箱。我们可以指示将存储样品的架子，并记录可以扫描或输入的盒子条形码。也可以在此处输入盒子标签，标签可以放在盒子上以便进一步匹配。然后记录行和列的两个位置。这可确保每个条形码都与盒子内的一个位置相关联，该位置被记录下来，以便将来检索。在此用法部分下，我们可以输入我们的项目名称或从下拉框中选择一个。记录标本体积。在这里，日期和时间以及上次访问此表单的用户会自动填充，以确保可以根据需要查看和审核的监管链。存档表单的人员在此处输入其姓名，并在此处注明可能与他们希望在此输入表单中记录的内容一致的任何相关注释以供存储。最后，还有另一个部分要上传文件，完成所有这些操作后，可以通过单击“保存并退出”来填写并提交此表单，这将我们带回患者概述。对于必须填写的每个附加表格，对于必须存储的每个试管，我们可以单击此加号按钮返回样品存储表格并生成另一条记录。此概述提供了对该患者记录生成的条目表单以及任何后续存储表单的访问。通过这种方式，在 REDCap 中具有后端访问权限或其他给定权限的任何人都可以轻松检索和访问它。收集的液体活检可以进行各种分子分析，包括蛋白质组学、糖组学和代谢组学。REDCap数据库可以简单快速地检索样本，例如，通过搜索特定疾病患者的样本。这是一例17岁的女性患者，她免疫功能低下，表现为视网膜和视神经炎症。由于担心感染，进行了房水液体活检并送去进行DNAPCR分析。结果对CMV呈阳性，对HSV和弓形虫病呈阴性，对于区分感染性和非感染性眼内炎症以及选择合适的治疗方法至关重要。液相色谱质谱法能够对蛋白质组进行无偏和半定量分析。在接受玻璃体切除术的患者玻璃体的液体活检中，该技术能够识别484种独特的蛋白质，包括补体C3，视蛋白和2型胶原蛋白。使用糖蛋白组学多重分析仪分析了三种玻璃体液体活检。该测定检测了500种人类蛋白质的糖基化谱，捕获了多种生物途径，如代谢、免疫反应、细胞粘附和肌动蛋白组织。我们还使用一种特殊形式的质谱分析了房水液体活检的代谢组学谱。我们在三种水性人液活检中鉴定了292种不同的代谢物。通路分析确定了多种代谢途径，包括氨基酸代谢、尿周期和肉碱合成。总之，我们的工作流程在手术室和研究实验室之间建立了一个实用的接口，允许标准化和高通量的采集、注释和存储高质量的手术标本。这些样品可用于分子下游分析，包括蛋白质组学、糖组学和代谢组学研究。我们的实验方案为未来的转化研究提供了宝贵的基础。

Research

JoVE Journal

Medicine

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

人类蛋白质组分析玻璃体元素剖析

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions ...

科研

医学

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

小鼠呼吸道上皮细胞和实验香烟烟雾暴露在空气分离液界面

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

在免疫缺陷小鼠的建立和传播人类视网膜母细胞瘤肿瘤

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

在皮肤癌变细胞群分析

Cancer development is  a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor  cells, immune cells, fibroblasts and endothelial ...

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

三维成像伤害表皮内神经纤维在人体皮肤活检

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

人类前列腺癌转移的原位小鼠模型

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

丰富的人力细胞系化疗耐药性卵巢癌干细胞

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

人掌腱膜挛缩的<em&gt;离体</em&gt;文化为肌成纤维细胞的研究和细胞外基质相互作用

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Whole Vitreous Humor Dissection for Vitreodynamic Analysis

全玻璃体液清扫Vitreodynamic分析

The authors propose an effective technique to isolate whole, intact vitreous core and cortex from post mortem enucleated porcine eyes. While previous ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

小鼠加速动脉硬化的诱导："电线损伤"模型

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...