Name: Author Spotlight: Reprogramming Cancer Cells to iPSCs to Study Disease Progression and Treatment Targets
Uploaded: 2024-02-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency at JoVE.com

A.S and J.K would like to thank Cancer Research UK and OHSU for funding (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S is supported by an MRC career development award (MR/N024028/1). A.A is funded by a Ph.D. scholarship (Scholarship ref. 1078107040) from King Abdulaziz City for Science and Technology. J.K is funded by MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) and Knight CEDAR grant (68182-933-000, 68182-939-000). We thank Prof Keisuke Kaji for kindly providing the reprogramming vector pSIN4-EF1a-O2S and pSIN4-CMV-K2M. For the purpose of open access, the author has applied a Creative Commons Attribution (CC BY) licence to any Author Accepted Manuscript version arising from this submission.

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية من قبل مجلس المراجعة المؤسسية OHSU. تم تنفيذ جميع الطرق وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة. تم تنفيذ جميع الأعمال الحيوانية لأورام PDX بموافقة لجنة استخدام ورعاية المؤسسية (IACUC) التابعة ل OHSU. تم اختبار هذا البروتوكول في خلايا PDAC الأولية من xe...

Reprogramming PDAC and Pancreatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells

To facilitate the use of iPSC reprogramming for studying cancer progression, a robust protocol has been established for reprogramming pancreatic cancer cells. Reprogramming cancer cells into pluripotency has proven to be very challenging thus far, as only a few studies have successfully generated iPSCs from cancer cells32,36,37,38,39,<sup class="xre...

يعد سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC) أحد أكثر الأورام الخبيثة فتكا ، ولا يزال التشخيص المبكر يمثل تحديا بسبب الطبيعة الخالية من الأعراض للمرض. يتم تشخيص غالبية مرضى PDAC في المرحلة النقيلية المتقدمة عندما تتوفر خيارات علاج محدودة للغاية 1,2. ويرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود مؤشرات حيوية موثوقة للمراحل المبكرة ، مثل تلك التي يمكن اكتشافها بسهولة كبروتينات يتم إطلاقها في مجرى الدم.
يمكن أن ينتشر PDAC في وقت مبكر جدا أثناء تقدمه ، وقد تم ربط التشخيص الأفضل بالكشف المبكر عن السرطان عندما يكون PDAC موضعيا في البنكرياس3. ومع ذلك ، يتم تشخيص أقل من عشر مرضى PDAC بتشخيص إيجابي ، مما يسمح بالاستئصال الجراحي. ومع ذلك ، فإن أولئك القلائل الذين يعانون من أورام قابلة للاستئصال معرضون أيضا لتكرار الورم في غضون 12 شهرا4.
في العقود الخمسة الماضية ، تم إجراء تحسينات ملحوظة في التقنيات الجراحية ورعاية المرضى وطرق العلاج 5,6. ومع ذلك ، فإن معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات في مرضى PDAC الذين تم استئصالهم جراحيا بالكاد ارتفع إلى 17٪. ومع ذلك ، لا يزال هذا أفضل من ذلك في المرضى غير المستأصلين ، والذي ظل دون تغيير تقريبا (0.9٪) 4,7. العلاج الكيميائي هو العلاج البديل الوحيد الآخر PDAC. ومع ذلك ، فإن هذا الخيار محدود للغاية لأن الغالبية العظمى من مرضى PDAC يظهرون مقاومة قوية لأدوية العلاج الكيميائي مثل Gemcitabine 7,8. الأدوية الأخرى ، مثل Erlotinib ، متاحة فقط لمجموعة صغيرة من مرضى PDAC الذين يعانون من طفرات محددة ، ومعظمهم يظهرون مقاومة Erlotinib9. الآثار الجانبية الضارة المرتبطة بالعلاج الكيميائي في معظم مرضى PDAC هي عيب آخر لهذا العلاج10. في الآونة الأخيرة ، أظهرت الاستراتيجيات الواعدة أن مثبطات نقاط التفتيش المناعية (ICIs) ومثبطات كيناز الجزيئات الصغيرة (SMKIs) يمكن أن تكون فعالة في علاج PDAC ، لكن الاستجابات الدائمة لهذه العلاجات المستهدفة لا تزال تقتصر على أقلية من المرضى11,12. بشكل عام ، يمكن أن يمهد اكتشاف المؤشرات الحيوية المبكرة الخاصة ب PDAC طرقا جديدة للتشخيص والعلاج المبكرين.
يتطور PDAC من آفات السلائف داخل البنكرياس داخل الظهارة (PanIN) التي تنتج عن التكاثر الظهاري للقناة البنكرياسية غير الغازية13,14. في حين أن تكوين PanIN يبدأ بواسطة طفرات جينية مسرطنة مثل KRAS ، هناك حاجة إلى تغييرات جينية وجينية إضافية للتقدم إلى PDAC. من المتوقع أن يستغرق تقدم PanIN خلال المراحل المختلفة إلى PDAC الغازية حوالي 10 سنوات13،15،16،17. يوفر هذا الإطار الزمني فرصة رائعة للاستفادة من التشخيص المبكر ل PDAC. لذلك ، تم إجراء بحث مكثف لإنشاء نماذج حيوانية للورم xenograft ومزارع عضوية لدراسة تقدم PDAC18،19،20،21. كانت هذه النماذج مفيدة جدا لدراسة المراحل الغازية من PDAC ، على الرغم من عدم الانتقال من مراحل PanIN المبكرة. لذلك ، من المهم تطوير نماذج تجريبية يمكنها تلخيص التقدم المبكر لمراحل PanIN لتمكين اكتشاف المؤشرات الحيوية للكشف المبكر.
إن إعادة برمجة الخلايا الجسدية إلى خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات (iPSCs) باستخدام عوامل النسخ الأربعة OCT4 و SOX2 و KLF4 و c-MYC (OSKM) قد أوضحت مدى اللدونة الخلوية22. تم توثيق لدونة الخلايا السرطانية جيدا ، وتم استخدام إعادة برمجة الخلايا السرطانية البشرية إلى iPSCs بنجاح لإعادة الخلايا إلى حالتها الخلوية الأصلية ، وإزالة العديد من الإهانات اللاجينية التي تراكمت أثناء تطور السرطان23،24،25،26،27،28،29. وبالتالي ، فإن إمكانية استخدام استراتيجية إعادة البرمجة هذه للتلاعب بهوية الخلايا السرطانية قد قدمت وعدا كبيرا في علاج السرطان30,31. في الواقع ، لقد أظهرنا سابقا أن تمايز iPSCs المشتقة من PDACs يمكن أن يلخص تقدم PDAC خلال مراحل PanIN المبكرة32. من خلال تحديد الجينات والمسارات الخاصة بالمراحل المبكرة إلى المتوسطة من PDAC ، تم تحديد المؤشرات الحيوية المرشحة التي يمكن استخدامها سريريا لتشخيص PDAC المبكر32,33. ومع ذلك ، أظهرت المؤشرات الحيوية المكتشفة باستخدام خط iPSC واحد تغطية محدودة في غالبية مرضى PDAC32. أدت تحديات توليد خطوط iPSC من مرضى PDAC الآخرين إلى إيقاف القدرة على اكتشاف مؤشرات حيوية أكثر موثوقية. ويرجع ذلك إلى العديد من العوامل التقنية ، بما في ذلك عدم تجانس توصيل OSKM ، حيث احتوى جزء صغير فقط من خلايا PDAC الأولية البشرية على جميع العوامل الأربعة واستجاب بنجاح لإعادة البرمجة. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لإعادة برمجة خلايا PDAC الأولية باستخدام توصيل فيروسي مزدوج أكثر كفاءة واتساقا ل OSKM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31350010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>330613</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Pituitary Extract (BPE)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13028014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BxPc3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1687</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>C8052-1MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, Type I solution from rat tail</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>C3867</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Completed Defined K-SFM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;10744-019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS3516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning syringe filters</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS431231</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS430599</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day Impex&#160;Virkon Disinfectant Virucidal Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12328667</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>D8537</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10270-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene HD Transfection Reagent&#160;</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>&#160;E2312</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, Type B, 2% in H2O</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>G1393-100ML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>G5154</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF Recombinant Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>100-18B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7)</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECA001-FP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMEF feeder cells&#160;</td>
			<td>iXcells Biotechnologies</td>
			<td>10MU-001-1V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte Serum Free Media (KSFM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17005-042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10829018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut serum Replacement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030-024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HP 0.45 &#956;M syringe Filter Unit (Sterile)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>SLHP033RS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDG&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>187440</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)&#160;</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>H9268-5G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-CMV-K2M&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>21164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF2-O2S&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>21162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>12260</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pWPT-GFP&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>12255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (ATCC modification)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1049101</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodym Pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11360-039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringes for Single Use (60 mL)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15899152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reprogramming pancreatic ductal adenocarcinoma to pluripotency

تم تحقيق توليد الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) باستخدام عوامل النسخ من أي نوع من الخلايا المتمايزة تقريبا وأثبتت قيمتها العالية للبحث والتطبيقات السريرية. ومن المثير للاهتمام ، أن إعادة برمجة iPSC للخلايا السرطانية ، مثل سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC) ، قد ثبت أنها تعيد النمط الظاهري ل PDAC الغازي وتتجاوز الجينوم السرطاني. يمكن أن يلخص تمايز iPSCs المشتقة من PDAC تطور PDAC من سلائف الأورام داخل الظهارة البنكرياسية المبكرة (PanIN) ، مما يكشف عن التغيرات الجزيئية والخلوية التي تحدث مبكرا أثناء تطور PDAC. لذلك ، يمكن استخدام iPSCs المشتقة من PDAC لنمذجة المراحل المبكرة من PDAC لاكتشاف علامات التشخيص المبكرة الكشف. هذا مهم بشكل خاص لمرضى PDAC ، الذين يتم تشخيصهم عادة في المراحل النقيلية المتأخرة بسبب نقص المؤشرات الحيوية الموثوقة لمراحل PanIN السابقة. ومع ذلك ، فإن إعادة برمجة خطوط الخلايا السرطانية ، بما في ذلك PDAC ، إلى تعدد القدرات لا يزال يمثل تحديا وكثيف العمالة ومتغيرا للغاية بين الخطوط المختلفة. هنا ، نصف بروتوكولا أكثر اتساقا لتوليد iPSCs من خطوط خلايا PDAC البشرية المختلفة باستخدام ناقلات الفيروسات العدسية bicistronic . خطوط iPSC الناتجة مستقرة ، ولا تظهر أي اعتماد على التعبير الخارجي لعوامل إعادة البرمجة أو الأدوية المحرضة. بشكل عام ، يسهل هذا البروتوكول توليد مجموعة واسعة من iPSCs المشتقة من PDAC ، وهو أمر ضروري لاكتشاف المؤشرات الحيوية المبكرة الأكثر تحديدا وتمثيلا لحالات PDAC.

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

يتم عرض الصور التمثيلية التي تعرض مورفولوجيا مستعمرات iPSC المشتقة من خلايا PDAC و BXPc3 و H6C7 و hFib في الشكل 1. بدأت مستعمرات PDAC-iPSC في التكون في اليوم 25 من إعادة البرمجة. تم تحديد مستعمرات iPSC القوية ذات التشكل الشبيه ب ESC الأكثر رسوخا في اليوم 40 من إعادة البرمجة (<strong...

Watch this Scientific Journal Video about Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency at JoVE.com

Author Spotlight: Reprogramming Cancer Cells to iPSCs to Study Disease Progression and Treatment Targets

يصف البروتوكول الحالي إعادة برمجة سرطان البنكرياس الغدي القنوي (PDAC) والخلايا الظهارية البنكرياسية القنية الطبيعية إلى خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات (iPSCs). نحن نقدم إجراء محسنا ومفصلا خطوة بخطوة ، من تحضير فيروس العدس إلى إنشاء خطوط iPSC مستقرة.

إعادة برمجة سرطان البنكرياس الغدي النخوي إلى تعدد القدرات

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...