Name: Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-11-10T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de King Abdullah University of Science and Technology door middel van kernfinanciering en de National Term Grand Challenge (NTGC) aan SMH.

1. Taq-polymerase-expressie en -zuivering
<ol><li>Construeer een plasmide met een splitsbare hexa-histidine-tag aan de C-terminus van het enzym.</li>
	<li>Transformeer 50 ng van de expressievector in E. coli BL21-(DE3)-stam volgens het standaardprotocol38.</li>
	<li>Inoculeer de getransformeerde cellen in vier kolven van 6 l met elk 2 l 2YT-mediabouillon bij 37 °C en schud bij 170 omw/min totdat de OD 600 van 0,8 of celnummer 6,4 x10,8 is bereikt.</li>
	<li>...

Multiplex RT-qPCR Assay for Respiratory Virus Detection

Er is wereldwijd een zware economische last voor het gezondheidszorgsysteem als gevolg van de hoge infectie- en sterftecijfers als gevolg van de verspreiding van veel voorkomende respiratoire virussen zoals SARS-CoV-2, Influenza A/B en MERS-CoV-varianten 12,19,20. Gemotiveerd door het verantwoordelijkheidsgevoel om deze last te verlichten, realiseerden we ons de noodzaak van een snelle, nauwkeurige en toegankelijke diagnostische...

De pandemie van de aanhoudende coronavirusziekte 2019 (COVID-19) wordt veroorzaakt door het nieuwe coronavirus dat bekend staat als het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. Vanwege de sterke besmettelijkheid van SAR-CoV-2 en het vermogen tot snelle overdracht, ontstond de COVID-19-pandemie in Wuhan City, China, en verspreidde zich snel over de hele wereld. Dit leidde uiteindelijk tot het begin van tekenen van ademnood en zelfs de dood 2,3,4. COVID-19 is in meer dan 213 landen uitgeroepen tot pandemie, waarbij een sterke toename van het aantal bevestigde gevallen wordt verwacht, zoals blijkt uit de artikelen die door verschillende onderzoeken zijn gepubliceerd 3,5. COVID-19 wordt voornamelijk overgedragen door kleine ademhalingsdruppeltjes die geïnfecteerde personen in het milieu afgeven en vervolgens worden blootgesteld aan kwetsbare personen door inademing of nauw contact met besmette oppervlakken. Wanneer deze druppeltjes in contact komen met het slijmvlies van de ogen, mond of neus, kan een persoon besmet raken6. Uit statistieken van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) blijkt dat er wereldwijd meer dan 76 miljoen bevestigde gevallen van de pandemie zijn geweest, met maar liefst 7 miljoen doden7. Zo classificeerden de Verenigde Naties de pandemie veroorzaakt door de ziekte COVID-19 als een ramp vanwege de directe impact op het leven van miljarden mensen over de hele wereld en had verstrekkende economische, ecologische en sociale gevolgen.
Initiatieven op het gebied van de volksgezondheid, waaronder grondige tests, vroege opsporing, contactopsporing en isolatie van gevallen, blijken allemaal cruciaal te zijn om deze pandemie onder controle te houden 8,9,10,11. De wintermaanden zullen de circulatie van andere respiratoire virussen zoals Influenza A en B met COVID-19-achtige symptomen verhogen, waardoor het moeilijk wordt om COVID-19-gevallen in een vroeg stadium te identificeren, op te sporen en te isoleren. Elk jaar begint de uitbraak van influenza A en B in de late herfst of begin januari met een voorspelbare seizoensgebondenheid12. Talrijke epidemiologische kenmerken worden gedeeld door SARS-CoV-2- en influenzavirussen. Bovendien delen ze overeenkomsten in de vatbare populaties, waaronder kinderen, ouderen, immuungecompromitteerden en personen met chronische comorbiditeiten zoals astma, chronische obstructieve longziekte, hart- en nierfalen of diabetes12,13. Deze virussen delen niet alleen kwetsbare populaties, maar ook transmissieroutes van contact en ademhalingsdruppeltjes14. Verwacht wordt dat patiënten waarschijnlijk meer dan één van deze respiratoire virussen kunnen oplopen naarmate het griepseizoennadert 14. Daarvoor moet de screening van SARS-CoV-2 en de influenzavirussen worden uitgevoerd op symptomatische patiënten voordat ze worden geïsoleerd. Het uitvoeren van afzonderlijke tests voor de drie virussen (SARS-CoV-2, Influenza A en Influenza B) is niet mogelijk vanwege het wereldwijde gebrek aan middelen voor nucleïnezuurextractie en diagnostiek. Om ze allemaal in één reactie te screenen, moet een methode of test worden ontwikkeld.
Middle East respiratory syndrome (MERS)-CoV is een familielid van het menselijke coronavirus (CoV). De eerste isolaten van het MERS-CoV-virus waren afkomstig van een gehospitaliseerde patiënt in Saoedi-Arabië die in september 2012 was overleden als gevolg van acute ademhalingsproblemen. Er zijn aanwijzingen dat dromedariskamelen een prominente reservoirgastheer voor MERS-CoV zijn. Het is bewezen dat virussen van geïnfecteerde dromedariskamelen zoönotisch zijn en dus mensen kunnen infecteren16,17. Mensen die met dit virus zijn besmet, kunnen het via nauw contact naar anderen verspreiden18. Op 26 januari 2018 waren er 2143 laboratoriumbevestigde gevallen van MERS-CoV-infectie, waaronder 750 sterfgevallen wereldwijd. De meest typische MERS-CoV-symptomen zijn hoesten, koorts en kortademigheid. Er is ook gemeld dat MERS-CoV-infecties symptomen van longontsteking, diarree en gastro-intestinale misselijkheid vertonen20. Momenteel is er geen commercieel vaccin of specifieke behandeling voor MERS-CoV beschikbaar. Daarom is een snelle en nauwkeurige diagnose essentieel om de wijdverbreide MERS-CoV-uitbraken te voorkomen en MERS-CoV te onderscheiden van de ziekte SARS-CoV-2.
Tot op heden zijn er veel benaderingen voorgesteld om deze virussen te detecteren, zoals multiplex RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas12 26,27, CRISPR/Cas928 en CRISPR/Cas329, laterale flow-immunoassay30, op papier gebaseerde biomoleculaire sensoren31, SHERLOCK-testen in één pot32, DNA-aptameer 33, lusgemedieerde isotherme versterking (LAMP)19,34, enz. Elk van de bovengenoemde methoden heeft unieke voor- en nadelen op het gebied van gevoeligheid en specificiteit. Van deze methoden is de op nucleïnezuuramplificatie gebaseerde test: multiplex qRT-PCR, de meest voorkomende en wordt beschouwd als de gouden standaard voor de diagnose van SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en MERS-CoV.
In deze studie hebben we verschillende primercombinaties en sondes ontworpen en beoordeeld voor de effectieve, nauwkeurige en gelijktijdige detectie van SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en SARS-CoV-2, MERS-CoV met behulp van standaard twist synthetische virale RNA's. De gemultiplexte tests die zijn ontwikkeld voor MERS-CoV- of SARS-CoV-2-doelgenen worden aanbevolen door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO). Deze genen coderen over het algemeen voor eiwitten en complexen die bijdragen aan de vorming van een replicatie/transcriptiecomplex (RTC)35, zoals het gebied binnen het open leesframe 1a (ORF1a) dat wordt gebruikt voor de MERS-CoV-test. Bovendien worden structurele eiwitten gecodeerd door de genen die worden gebruikt in diagnostische tests, zoals het stroomopwaartse gebied van het envelopgen (upE) en het nucleocapside-gen (N) die worden gebruikt voor respectievelijk MERS-CoV- en SARS-Cov-2-assays35,36. We gebruikten de interne R3T eenstaps RT-qPCR-kit om de RT-qPCR voor de detectie van virussen vast te stellen37. Virusdetectie, gevoeligheid, specificiteit en dynamisch bereik van onze R3T one-step RT-qPCR kit en primersets werden getest en geëvalueerd met behulp van 10-voudige seriële verdunningen van de standaard twist synthetische RNA's. De laagste praktische detectielimiet was ongeveer 10 transcriptiekopieën per reactie. Als gevolg hiervan kunnen de interne R3T-eenstaps RT-qPCR-kit en primer-/sondesets met succes worden gebruikt en geïmplementeerd voor routinematige gelijktijdige diagnose van SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en SARS-CoV-2, MERS-CoV.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#956;m filter cups</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>291-4545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Tris-Glycine SDS running buffer</td>
			<td>Novex</td>
			<td>LC2675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culturing plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A701-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>61-238-RH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1152-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Biotin, 98+%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A14207.60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10Bac competent cells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10361012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>68100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase/Rnase Free Distilled Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3) competent cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C600003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)</td>
			<td>Expression Systems</td>
			<td>96-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A38400-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene (transfection reagent)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8896-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H1N1) synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza A (H3N2)&#160; synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Influenza B synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I3481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6876-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>13152-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MERS-CoV synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>103015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>10310855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini- PROTEAN TGX Precast Gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-3712-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-5248-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A32955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein marker</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA</td>
			<td>Twist Bioscience</td>
			<td>102024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 insect cells</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A35243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-1Kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTrap XT 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29401323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB02200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base Molecular Biology Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>22676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1379-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>B1690</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of multiplex real-time rt-qpcr assays for the detection of sars-cov-2, influenza a/b, and mers-cov

Het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) dat de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) veroorzaakt, vormt een ernstige bedreiging voor de volksgezondheid in het algemeen. Tijdens griepseizoenen kan de verspreiding van SARS-CoV-2 en andere respiratoire virussen een bevolkingsbrede last van luchtwegaandoeningen veroorzaken die moeilijk te beheersen is. Daarvoor zullen de respiratoire virussen SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en Middle East respiratory syndrome (MERS-CoV) in de komende herfst- en winterseizoenen zorgvuldig in de gaten moeten worden gehouden, met name in het geval van SARS-CoV-2, Influenza A en Influenza B, die vergelijkbare epidemiologische factoren delen, zoals vatbare populaties, wijze van overdracht en klinische syndromen. Zonder doelwitspecifieke tests kan het een uitdaging zijn om onderscheid te maken tussen gevallen van deze virussen vanwege hun overeenkomsten. Dienovereenkomstig zal een gevoelige en gerichte multiplextest die gemakkelijk onderscheid kan maken tussen deze virale doelwitten nuttig zijn voor beroepsbeoefenaren in de gezondheidszorg. In deze studie ontwikkelden we een real-time reverse transcriptase-PCR-gebaseerde assay met behulp van een in-house ontwikkelde R3T eenstaps RT-qPCR-kit voor gelijktijdige detectie van SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en SARS-CoV-2, MERS-CoV. Met slechts 10 kopieën van hun synthetische RNA's kunnen we met succes SARS-CoV-2-, Influenza A-, Influenza B- en MERS-CoV-doelen tegelijkertijd identificeren met 100% specificiteit. Deze test blijkt nauwkeurig, betrouwbaar, eenvoudig, gevoelig en specifiek te zijn. De ontwikkelde methode kan worden gebruikt als een geoptimaliseerde SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B en SARS-CoV-2, MERS-CoV diagnostische test in ziekenhuizen, medische centra en diagnostische laboratoria, evenals voor onderzoeksdoeleinden.

Development of Multiplex Real-Time RT-qPCR Assays for the Detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and MERS-CoV

In de afgelopen jaren is er aanzienlijke vooruitgang geboekt in de diagnostische benadering voor het detecteren van veel voorkomende respiratoire virussen met behulp van PCR-benaderingen 21,22,23,24,25. Ondanks deze vooruitgang is de multiplex-benadering, die het mogelijk maakt om meerdere virussen in één test te detecteren, echter niet op grote schaal geïm...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses at JoVE.com

Advancements in Multiplex Detection of Respiratory Viruses (Video) | JoVE

We presenteren twee op sondes gebaseerde in-house eenstaps RT-qPCR-kits voor veel voorkomende respiratoire virussen. De eerste test is voor SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 en H3N2) en Influenza B. De tweede is voor SARS-Cov-2 (N) en MERS (UpE en ORF1a). Deze testen kunnen met succes worden geïmplementeerd in elk gespecialiseerd laboratorium.

Ontwikkeling van multiplex real-time RT-qPCR-assays voor de detectie van SARS-CoV-2, influenza A/B en MERS-CoV

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) that causes Coronavirus disease 2019 (COVID-19) is a serious threat to the general ...