Name: Cryopreservation of Whole Blood Samples for High Throughput Analysis (Video) | JoVE
Uploaded: 2024-02-23T14:40:00
Duration: 1 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Whole Blood Samples for High Throughput Analysis at JoVE.com

लेखक अपने तकनीकी समर्थन के लिए एल पीटर्स, टी थिरोन और जी डी स्मेट को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम उन सभी स्वयंसेवकों के शुक्रगुजार हैं जिन्होंने अध्ययन के लिए रक्तदान किया। इस काम को ग्रांट (T000118N) के तहत रिसर्च फाउंडेशन- फ्लैंडर्स (एफडब्ल्यूओ) द्वारा आर्थिक रूप से समर्थित किया गया था।

Examining Micronuclei Yields in Irradiated Whole Blood Samples

<ol>
	<li>Grade, M., Difilippantonio, M. J., Camps, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+chromosomal+aberrations+in+solid+tumors.">Patterns of chromosomal aberrations in solid tumors.</a> Recent Results in Cancer Research. 200, 115-142 (2015).</li><li>Jiao, Y., Cao, F., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+cell+death+and+its+mechanisms.">Radiation-induced cell death and its mechanisms.</a> Health Physics. 123 (5), 376-386 (2022).</li><li>Roederer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+architecture+of+the+human+immune+system:+a+bioresource+for+autoimmunity+and+disease+pathogenesis.">The genetic architecture of the human immune system: a bioresource for autoimmunity and disease pathogenesis.</a> Cell. 161 (2), 387-403 (2015).</li><li>Bankoglu, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cryopreservation+on+DNA+damage+and+DNA+repair+activity+in+human+blood+samples+in+the+comet+assay.">Effect of cryopreservation on DNA damage and DNA repair activity in human blood samples in the comet assay.</a> Archives of Toxicology. 95, 1831-1841 (2021).</li><li>Zijno, A., Saini, F., Crebelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+cryopreserved+isolated+lymphocytes+for+the+analysis+of+micronuclei+with+the+cytokinesis-block+method.">Suitability of cryopreserved isolated lymphocytes for the analysis of micronuclei with the cytokinesis-block method.</a> Mutagenesis. 22, 311-315 (2007).</li><li>Sioen, S., Cloet, K., Vral, A., Baeyens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytokinesis-block+micronucleus+assay+on+human+isolated+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells.">The cytokinesis-block micronucleus assay on human isolated fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells.</a> Journal of Personalized Medicine. 10 (3), 125 (2020).</li><li>Cheng, L., Wang, L. E., Spitz, M. R., Wei, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserving+whole+blood+for+functional+assays+using+viable+lymphocytes+in+molecular+epidemiology+studies.">Cryopreserving whole blood for functional assays using viable lymphocytes in molecular epidemiology studies.</a> Cancer Letters. 166 (2), 155-163 (2001).</li><li>Beyls, E., Baeyens, A., Vral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytokinesis-block+micronucleus+assay+for+cryopreserved+whole+blood.">The cytokinesis-block micronucleus assay for cryopreserved whole blood.</a> International Journal of Radiation Biology. 97 (9), 1252-1260 (2021).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li><li>Ramachandran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+thawing+of+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+use+in+high-throughput+human+immune+monitoring+studies.">Optimal thawing of cryopreserved peripheral blood mononuclear cells for use in high-throughput human immune monitoring studies.</a> Cells. 1 (3), 313-324 (2012).</li><li>H&#248;nge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., M&#248;ller, B. K., Erikstrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+recovery+of+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+flow+cytometry.">Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry.</a> PLoS One. 12 (11), e0187440-e0187517 (2017).</li><li>Alam, I., Goldeck, D., Larbi, A., Pawelec, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+lymphocyte+subset+analysis+using+material+from+frozen+whole+blood.">Flow cytometric lymphocyte subset analysis using material from frozen whole blood.</a> Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 33 (2), 128-139 (2012).</li><li>Langenski&#246;ld, C., Mellgren, K., Abrahamsson, J., Bemark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+blood+cell+subtype+concentrations+from+frozen+whole+blood+samples+using+TruCount+beads.">Determination of blood cell subtype concentrations from frozen whole blood samples using TruCount beads.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 94B, 660-666 (2018).</li><li>Braudeau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+and+reliable+whole+blood+freezing+method+for+flow+cytometry+immuno-phenotyping+and+functional+analyses.">An easy and reliable whole blood freezing method for flow cytometry immuno-phenotyping and functional analyses.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 100 (6), 652-665 (2021).</li><li>Thierens, H., Vral, A., De Ridder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+dosimetry+using+the+micronucleus+assay+for+lymphocytes:+interindividual+differences+in+dose+response.">Biological dosimetry using the micronucleus assay for lymphocytes: interindividual differences in dose response.</a> Health Physics. 61 (5), 623-630 (1991).</li><li>Vral, A., Fenech, M., Thierens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+micronucleus+assay+as+a+biological+dosimeter+of+in+vivo+ionising+radiation+exposure.">The micronucleus assay as a biological dosimeter of in vivo ionising radiation exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 11-17 (2011).</li><li>Vral, A., Thierens, H., Baeyens, A., De Ridder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+micronucleus+and+G2-phase+assays+for+human+blood+lymphocytes+as+biomarkers+of+individual+sensitivity+to+ionizing+radiation:+limitations+imposed+by+intraindividual+variability.">The micronucleus and G2-phase assays for human blood lymphocytes as biomarkers of individual sensitivity to ionizing radiation: limitations imposed by intraindividual variability.</a> Radiation Research. 157 (4), 472-477 (2002).</li><li>Pajic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inter-individual+variability+in+the+response+of+human+peripheral+blood+lymphocytes+to+ionizing+radiation:+comparison+of+the+dicentric+and+micronucleus+assays.">Inter-individual variability in the response of human peripheral blood lymphocytes to ionizing radiation: comparison of the dicentric and micronucleus assays.</a> Radiation and Environmental Biophysics. 54, 317-325 (2015).</li><li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+inter-laboratory+variation+in+the+scoring+of+micronuclei+and+nucleoplasmic+bridges+in+binucleated+human+lymphocytes:+results+of+an+international+slide-scoring+exercise+by+the+HUMN+project.">Intra- and inter-laboratory variation in the scoring of micronuclei and nucleoplasmic bridges in binucleated human lymphocytes: results of an international slide-scoring exercise by the HUMN project.</a> Mutation Research. 534 (1-2), 45-64 (2003).</li><li>Miszczyk, J., Rawoj&#263;, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+culturing+technique+on+human+peripheral+blood+lymphocytes+response+to+proton+and+X-ray+radiation.">Effects of culturing technique on human peripheral blood lymphocytes response to proton and X-ray radiation.</a> International Journal of Radiation Biology. 96 (4), 424-433 (2020).</li></ol>

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

सीबीएमएन परख के आवेदन के लिए संशोधित प्रोटोकॉल थोक में रक्त के नमूनों को स्टोर करने का एक अपेक्षाकृत आसान और सुविधाजनक तरीका है। प्रक्रिया सभी मिनट लेकिन महत्वपूर्ण विवरणों की रूपरेखा तैयार करती है जिन्हें क्रायोप्रिजर्वेशन और सीबीएमएन परख के दौरान ध्यान रखने की आवश्यकता होती है। अन्य लैब प्रोटोकॉल सामान्य रूप से फ्रीजिंग मिश्रण में 10% DMSO का उपयोग करते हैं, जबकि हमारे फ्रीजिंग मिश्रण में 80% FCS7 के साथ 20% DMSO होता है। चूंकि यह ठंड मिश्रण पूरे रक्त के नमूने में समान मात्रा में जोड़ा जाता है, अंतिम एकाग्रता भी 10% डीएमएसओ है। सेल जीवित रहने की दर में सुधार करने और कोशिका विभाजन को प्रोत्साहित करने के लिए, हम पूर्ण संस्कृति माध्यम (सीआरपीएमआई) में 1% सोडियम पाइरूवेट और 0.1% बीटा-मर्कैप्टोथेनॉल जोड़ते हैं। यह हमारे शोध समूह 6,8 द्वारा स्थापित सेल संस्कृति प्रोटोकॉल के अनुसार है.
हालांकि विगलन करते समय सेल क्लंपिंग की समस्या को इस प्रोटोकॉल में पूरी तरह से हल नहीं किया जा सका, सेल अलगाव अन्य पारंपरिक प्रोटोकॉल से बेहतर था। विगलन के बाद कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करने के लिए संस्कृति मीडिया के लगातार, अचानक जोड़ के बजाय, हमने बेहतर परिणाम प्राप्त किए जब धोने के चरणों के दौरान प्रीवार्म्ड पीबीएस (37 डिग्री सेल्सियस) को ड्रॉपवाइज जोड़ा गया था। यह सुधार सेलुलर तनाव को कम करने में मदद करता है और कोशिकाओं की एक सिद्ध उच्च वसूली के साथ क्लंपिंग को कम करता है। इसके अलावा, आरपीएमआई पर पीबीएस का उपयोग किए जाने पर सेल व्यवहार्यता में कोई स्पष्ट अंतर नहीं देखा जा सकता है। यह क्रायोप्रिजर्वेशन अवधि (1 वर्ष तक) की लंबाई एमएन पैदावार को प्रभावित नहीं करेगी, दोनों विकिरणित और गैर-विकिरणित नमूनों 6,8 में, समूह द्वारा मान्य किया गया है। अध्ययनों से पता चलता है कि पीबीएमसी की अच्छी सेल व्यवहार्यता और प्रसार कम तापमान (तरल नाइट्रोजन) पर क्रमिक ठंड के साथ प्राप्त किया जा सकता है, इसके बाद10,11 विगलन करते समय प्रीवार्म्ड माध्यम के क्रमिक जोड़ के बाद। शोधकर्ताओं ने दिखाया है कि पिघले हुए पूरे रक्त में टी-लिम्फोसाइटों की उप-आबादी पिघले हुए पीबीएमसी12 में देखी गई लोगों के बराबर है। इसके अलावा, यह साबित होता है कि क्रायोप्रेज़र्व्ड पूरे रक्त के नमूनों से बरामद सेल उपप्रकार ताजा पूरे रक्त के नमूनों13,14में देखे गए लोगों के समान हैं।
यदि हम रिपोर्ट में प्राप्त सांकेतिक परिणामों की जांच करते हैं, तो हम देखते हैं कि खुराक के साथ रैखिक द्विघात वृद्धि (चित्रा 3) रैखिक ऊर्जा हस्तांतरण (एलईटी) प्रेरित माइक्रोन्यूक्लिआई15,16 पर अन्य साहित्य रिपोर्टों के साथ समझौते में है। क्रायोप्रेज़र्ड पूरे रक्त के नमूनों (तालिका 1) में देखी गई एमएन पैदावार में परिवर्तनशीलता ताजा पूरे रक्त संस्कृतियों 8,17,18 के लिए रिपोर्ट की गई सीमा में है। यहाँ विस्तार से वर्णित प्रोटोकॉल 20 स्वस्थ स्वयंसेवकों8 के ताजा और cryopreserved पूरे रक्त पर मान्य किया गया था. परमाणु विभाजन सूचकांक (एनडीआई), जो उस रिपोर्ट8 में मनाया सेल प्रसार का एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है, ताजा पूरे रक्त19,20 के लिए सुझाए गए एक के साथ समझौते में था। एक साथ लिया, पूरे रक्त और संशोधित micronucleus परख के cryopreservation के इस अनुकूलित प्रोटोकॉल एक बेहतर सेल उपज प्रदान करता है और इसलिए, रेडियोसंवेदनशीलता आकलन के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन की सिफारिश की है. चूंकि प्रोटोकॉल की प्रजनन क्षमता पहले से ही8 मान्य किया गया है, इसलिए बड़े पैमाने पर और बहु-केंद्र अध्ययनों में प्रयोज्यता का सुझाव दिया गया है।

इसकी खोज के बाद से, आयनकारी विकिरण (आईआर) का उपयोग जीवित प्राणियों पर इसके प्रतिकूल प्रभावों के कारण शोधकर्ताओं के बीच बहस का विषय रहा है। हानिकारक प्रभाव आमतौर पर डीएनए क्षति जैसे डबल-स्ट्रैंडेड ब्रेक (डीएसबी) द्वारा प्रकट होता है, और इन डीएसबी की मरम्मत में विफलता से गुणसूत्र विपथन और उत्परिवर्तन होते हैं, जो कैंसर 1,2 की महत्वपूर्ण पहचान हैं। इस तरह के गुणसूत्र विपथन की जांच साइटोजेनिक परख जैसे साइटोकिन्सिस-ब्लॉक माइक्रोन्यूक्लियस (सीबीएमएन) परख द्वारा की जा सकती है। माइक्रोन्यूक्लिआई क्रोमोसोमल टुकड़े को पीछे छोड़ रहे हैं जिन्हें बेटी नाभिक में शामिल नहीं किया जा सकता है और इसलिए, माइटोसिस के दौरान पीछे छोड़ दिया जाता है।
सीबीएमएन आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली, विश्वसनीय साइटोजेनेटिक तकनीक है जो विवो या इन विट्रो आयनीकरण विकिरण के संपर्क में आने वाले व्यक्तियों में गुणसूत्र क्षति का आकलन करती है। सीबीएमएन परख में या तो ताजा पूरे रक्त या पृथक परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) का उपयोग किया जा सकता है। ताजा संपूर्ण रक्त ज्यादातर पसंद की जैविक सामग्री है क्योंकि पीबीएमसी का अलगाव और प्रसंस्करण समय लेने वाला हो सकता है और सीरम प्लाज्मा के नुकसान के साथ होता है जो सेल अस्तित्व और विकास के लिए सहायक माध्यम के रूप में कार्य करता है। एक अच्छा द्विकेंद्रक कोशिका उपज प्राप्त करने के लिए, ताजा पूरे रक्त को संग्रह के तुरंत बाद संसाधित किया जाना चाहिए। हालांकि, समय की कमी के दौरान तत्काल प्रसंस्करण की आवश्यकता तार्किक रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकती है। इसके अलावा, जब कई नमूनों को एक विस्तारित अवधि में प्राप्त किया जाना चाहिए या प्रसंस्करण केंद्रों से दूर बिंदुओं पर एकत्र किया जाना चाहिए, तो ताजा रक्त के नमूनों का भंडारण एक सीमित कारक 3,4 हो सकता है।
इसके अलावा, एक ही व्यक्ति/रोगी में बार-बार एमएन विश्लेषण की अनुमति देने के लिए, रक्त के नमूनों को फ्रीज करना फायदेमंद होगा। सीबीएमएन परख के बाद के आवेदन के लिए लिम्फोसाइटों को स्टोर करने का एक तरीका पृथक पीबीएमसी 5,6 को फ्रीज करना है। हालाँकि, इस तकनीक को PBMC को जमे हुए होने से पहले कई प्रसंस्करण चरणों की आवश्यकता होती है। इसलिए, पूरे रक्त का क्रायोप्रिजर्वेशन पृथक पीबीएमसी के क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए एक सरल और समय-कुशल विकल्प का प्रतिनिधित्व करेगा। साइटोजेनेटिक परख या परख के लिए जमे हुए पूरे रक्त के उपयोग के बारे में बहुत कम जानकारी उपलब्ध है जिसके लिए लिम्फोसाइटों के प्रसार की आवश्यकता होती है। केवल एक पेपर मेटाफ़ेज़ विश्लेषण7 के लिए क्रायोप्रेज़र्ड पूरे रक्त के उपयोग की रिपोर्ट करता है।
चूंकि पूरे रक्त का क्रायोप्रिजर्वेशन बायोमॉनिटरिंग, बायोडोसिमेट्री और रेडियोसेंसिटिविटी मूल्यांकन के क्षेत्र में कई फायदे प्रदान करेगा, इसलिए हमारे समूह ने पूरे रक्त के लिए एक क्रायोप्रेज़र्वेशन प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया जो सीबीएमएन परख8 के आवेदन की अनुमति देता है। हमने दिखाया कि क्रायोप्रेज़र्ड पूरे रक्त संस्कृतियों में मौजूद लिम्फोसाइट्स कम से कम 1 वर्ष के लिए अपनी जीनोमिक अखंडता और प्रसार क्षमता बनाए रखते हैं। इस विधि पत्र में, हम क्रायोप्रेज़र्वेशन प्रक्रिया और सीबीएमएन परख प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करते हैं, जिसे बेयल्स एट अल 8 द्वारा अनुकूलित किया गया था, और 30 स्वस्थ व्यक्तियों के जमे हुए रक्त के नमूनों के लिए प्राप्त निष्कर्षों की रिपोर्ट करते हैं। CBMN परख के लिए, रक्त संस्कृतियों को क्रायोप्रेज़र्व्ड पूरे रक्त नमूनों के लिम्फोसाइटों में MN प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए 0.5, 1, और 2 Gy की खुराक के साथ इन विट्रो में विकिरणित किया गया था।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell suspension plate&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96% alcohol</td>
			<td>ChemLab</td>
			<td>CL00.1807.2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck life science</td>
			<td>8,18,75,52,500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine orange</td>
			<td>Merck life science</td>
			<td>235474-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck life science</td>
			<td>C5670-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover slips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1365</td>
			<td>22 x 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryobox (Mr.Frosty)</td>
			<td>Nalgene, Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials 2ml</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A04573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochalsin B&#160;</td>
			<td>Merck life science</td>
			<td>C6762-10</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td>
			<td>Merck life science</td>
			<td>D4540-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Thermo Fischer scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Methanol/acetic acid/ringer in a ratio of 4:1:5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Methanol/acetic acid in a ratio of 4:1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GURR buffer</td>
			<td>Thermo Fischer scientific</td>
			<td>10582013</td>
			<td>phosphate buffer (pH 6.8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck life science</td>
			<td>1,04,93,60,250</td>
			<td>75 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck life science</td>
			<td>1,04,87,30,250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Li-heparin tubes</td>
			<td>BD Life sciences</td>
			<td>367526-LH170 I.U.</td>
			<td>BD Vacutainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>fisher scinetific</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO2</td>
			<td>Merck life science</td>
			<td>10,65,80,500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck life science</td>
			<td>S7653-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Object slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MENZAA00000112E04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fischer scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10,000 U/mL + 10,000 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytohemagglutinin (PHA-M)</td>
			<td>Thermo Fischer scientific</td>
			<td>10576-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>contains NaCl, KCl, CaCl2 dissolved in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Thermo Fischer scientific</td>
			<td>52400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon rubber adhesive sealent</td>
			<td>collall</td>
			<td>CF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fischer scientific</td>
			<td>11360039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile warm PBS (37 &#176;C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>contains NaCl,&#160; Na2HPO2, KH2PO4 dissolved in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fischer scientific</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the micronucleus assay on cryopreserved whole blood

इन विट्रो साइटोकिन्सिस-ब्लॉक माइक्रोन्यूक्लियस (सीबीएमएन) परख रेडियोबायोलॉजी अनुसंधान, जैविक डोसिमेट्री, जीनोटॉक्सिसिटी अध्ययन और इन विट्रो रेडियोसेंसिटिविटी परीक्षण में व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है। यह साइटोजेनेटिक विधि कोशिका विभाजन के दौरान क्रोमोसोमल टुकड़ों के परिणामस्वरूप द्विकेंद्रक कोशिकाओं में माइक्रोन्यूक्लिआई का पता लगाने पर आधारित है। ताजा पूरे रक्त के नमूने सीबीएमएन परख के लिए सबसे पसंदीदा नमूना प्रकार हैं। हालांकि, ताजा रक्त के नमूनों के साथ काम करने के नुकसान में रक्त संग्रह के बाद तत्काल प्रसंस्करण और दोहराया विश्लेषण की सीमित संख्या शामिल है जो अतिरिक्त रक्त नमूने के बिना किया जा सकता है।
चूंकि ताजा रक्त के नमूनों की आवश्यकता तार्किक रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकती है, क्रायोप्रेज़र्व्ड पूरे रक्त के नमूनों पर सीबीएमएन परख का बहुत फायदा होगा, खासकर बड़े पैमाने पर रोगी अध्ययन में। यह पत्र पूरे रक्त के नमूनों को फ्रीज करने और इन जमे हुए रक्त नमूनों पर सीबीएमएन परख करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। स्वस्थ स्वयंसेवकों से रक्त के नमूने जमे हुए हैं और अलग-अलग समय बिंदुओं पर पिघले हुए हैं और फिर, एक संशोधित माइक्रोन्यूक्लियस परख प्रोटोकॉल के अधीन हैं। परिणाम दर्शाते हैं कि यह अनुकूलित प्रक्रिया जमे हुए रक्त के नमूनों पर सीबीएमएन परख के प्रदर्शन की अनुमति देती है। वर्णित क्रायोप्रेज़र्वेशन प्रोटोकॉल अन्य साइटोजेनेटिक परखों और विभिन्न प्रकार के कार्यात्मक परख के लिए भी बहुत उपयोगी हो सकता है जिसमें लिम्फोसाइटों के प्रसार की आवश्यकता होती है।

The Micronucleus Assay on Cryopreserved Whole Blood

प्रोटोकॉल की प्रजनन क्षमता को मान्य करने के लिए, हमने 17 से 65 वर्ष की आयु के 30 स्वस्थ स्वयंसेवकों के क्रायोप्रेज़र्व्ड रक्त नमूनों पर एमएन परख का प्रदर्शन किया। समूह की औसत आयु 35 वर्ष है। क्रायोप्रिजर्वेशन का समय 1 सप्ताह से 154 सप्ताह तक था। पूरे रक्त कोशिका संस्कृति को विभिन्न विकिरण खुराक (0.5, 1, और 2 Gy) में उजागर करने के बाद, 1,000 बीएन कोशिकाओं में माइक्रोन्यूक्लिआई उपज की जांच माइक्रोस्कोप के तहत की गई थी। अच्छी तरह से गोल द्विकेंद्रक कोशिकाओं ( चित्रा 2 में देखा जा सकता है) क्रायोप्रेज़र्व्ड पूरे रक्त के नमूनों से स्वस्थ व्यवहार्य कोशिकाओं की एक सफल पुनर्प्राप्ति का संकेत मिलता है। ध्यान दें, लिम्फोसाइटों की विकिरण प्रतिक्रिया अल्ट्रा-कम तापमान (तरल नाइट्रोजन) पर दीर्घकालिक भंडारण के बाद स्थिर रही। यह अवलोकन ताजा रक्त के नमूनों से अपेक्षित प्रतिक्रिया के अनुरूप है।
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65855/65855fig02v2.jpg"> चित्रा 2: माइक्रोन्यूक्लिय, जैसा कि द्विकेंद्रक कोशिकाओं में देखा गया है, एक जमे हुए पूरे रक्त के नमूने से प्राप्त किया गया था जिसे 1 साल पहले क्रायोप्रेज़र्व्ड किया गया था। (ए) आवर्धन 200x, (बी) आवर्धन 400x; MNs की ओर इशारा करते हुए तीर. स्केल बार = 50 माइक्रोन. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65855/65855fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
विकिरण (0.5, 1, और 2 Gy) की बढ़ी हुई खुराक के साथ, माइक्रोन्यूक्लियस उपज में एक रैखिक-द्विघात वृद्धि देखी गई(तालिका 1 और चित्रा 3)। नकली विकिरणित नियंत्रण नमूनों (0 Gy) में MN पैदावार पृष्ठभूमि MN पैदावार का प्रतिनिधित्व करती है जो मुख्य रूप से लैगिंग गुणसूत्रों का परिणाम होती है।
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>खुराक (Gy)</td>
			<td>0</td>
			<td>0.5</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>औसत निकालना</td>
			<td>18</td>
			<td>107</td>
			<td>247</td>
			<td>601</td>
		</tr><tr><td>एसडी</td>
			<td>10.8</td>
			<td>23.9</td>
			<td>53.3</td>
			<td>101.1</td>
		</tr><tr><td>सीवी (%)</td>
			<td>59.9</td>
			<td>22.3</td>
			<td>21.6</td>
			<td>16.8</td>
		</tr><tr><td>श्रेणी</td>
			<td>5-41</td>
			<td>62-140</td>
			<td>139-324</td>
			<td>395-755</td>
		</tr></tbody></table>तालिका 1: औसत एमएन उपज के साथ भिन्नता की सीमा और गुणांक, जैसा कि 30 स्वस्थ दाताओं के क्रायोप्रेज़र्व्ड पूरे रक्त नमूनों में देखा गया है, अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता का संकेत। संक्षिप्ताक्षर: CV = भिन्नता का गुणांक; SD = मानक विचलन।
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65855/65855fig03.jpg"> चित्रा 3: माइक्रोन्यूक्लिआई पैदावार जैसा कि नियंत्रण में देखा गया है और 30 दाताओं के विकिरणित क्रायोप्रेज़र्ड पूरे रक्त के नमूने। क्रायोप्रिजर्वेशन अवधि 1 सप्ताह से 154 सप्ताह तक थी। स्कैटर प्लॉट ग्राफ व्यक्तिगत मूल्यों को दर्शाता है। समूहों में रेखाएँ समूह के माध्य ± SD का प्रतिनिधित्व करती हैं। संक्षिप्ताक्षर: MN = माइक्रोन्यूक्लिय; BN = द्विकेंद्रक। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65855/65855fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
व्यक्तियों की एमएन उपज में अंतर-वैयक्तिक भिन्नता की जांच करने के लिए, भिन्नता (सीवी) के गुणांक की गणना की गई थी ( तालिका 1 देखें)। विकिरण-प्रेरित MN के लिए, सभी खुराक (0.5, 1, और 2 Gy) के लिए 25% < एक CV प्राप्त किया गया था, जो संशोधित प्रोटोकॉल की अच्छी प्रजनन क्षमता को इंगित करता है।

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Whole Blood Samples for High Throughput Analysis at JoVE.com

Cryopreservation of Whole Blood Samples for High Throughput Analysis (Video) | JoVE

यहां हम क्रायोप्रेज़र्व्ड पूरे रक्त के नमूनों पर साइटोकिन्सिस-ब्लॉक माइक्रोन्यूक्लियस परख के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। माइक्रोन्यूक्लियस विश्लेषण के लिए पूरे रक्त के क्रायोप्रिजर्वेशन की यह अनुकूलित विधि बड़े पैमाने पर नमूने और बहु-केंद्र अध्ययनों के लिए एक विश्वसनीय तकनीक है और इसका उपयोग अन्य रक्त संबंधी परखों के लिए भी किया जा सकता है।

क्रायोप्रेज़र्व्ड होल ब्लड पर माइक्रोन्यूक्लियस परख

The in vitro cytokinesis-block micronucleus (CBMN) assay is a widely used technique in radiobiology research, biological dosimetry, genotoxicity studies, ...

हमारा शोध मुख्य रूप से स्वस्थ ऊतकों पर आयनकारी विकिरण के प्रभाव की जांच करने पर केंद्रित है। हम कैंसर वाले व्यक्तियों और डीएनए मरम्मत विकारों वाले लोगों की गुणसूत्र रेडियो संवेदनशीलता का अध्ययन कर रहे हैं। इसके अतिरिक्त, हम जैविक असमानता में शामिल हैं, जहां हम आयनकारी विकिरण के संपर्क में आने से प्रेरित डीएनए क्षति का आकलन करते हैं।हमारे क्षेत्र में अनुसंधान को आगे बढ़ाने के लिए, हम उच्च थ्रूपुट विश्लेषण के लिए स्वचालित सूक्ष्म प्रणालियों का उपयोग करते हैं। माइक्रोन्यूक्लियस परख के लिए ताजा पूरे रक्त के नमूने सबसे पसंदीदा नमूना प्रकार हैं, क्योंकि रोगी के लिए न्यूनतम असुविधा के साथ प्राप्त करना आसान है। हालांकि, समय की कमी के दौरान तत्काल प्रसंस्करण की आवश्यकता तार्किक रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकती है।पूरे रक्त के नमूनों को फ्रीज करना अतिरिक्त नमूने की आवश्यकता के बिना बार-बार विश्लेषण की अनुमति देता है। यह प्रक्रिया बड़े पैमाने पर और बहुस्तरीय अध्ययनों में रक्त के नमूनों को संग्रहीत करने का एक आसान और समय-कुशल तरीका है। पूरे रक्त के क्रायोप्रेज़र्वेशन का प्रोटोकॉल न केवल माइक्रोन्यूक्लियस परख के लिए लाभ प्रदान करेगा, बल्कि अन्य साइटोजेनेटिक परख या कार्यात्मक परख के लिए भी होगा जो लिम्फोसाइटों के प्रसार की आवश्यकता होती है।