Name: an experimental study on colorado potato beetle hibernation under natural conditions
Uploaded: 2023-11-17T13:00:00
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Agradecemos aos nossos colegas Vladimir Shilo, Vera Morozovа, Ulyana Rotskaya, Olga Polenogova e Oksana Tomilova por sua ajuda na organização e execução dos procedimentos de campo e laboratório.
A pesquisa foi apoiada pela Fundação Russa de Ciência, projeto No. 22-14-00309.

1. Descrição das gaiolas para hibernação
NOTA: Dependendo dos objetivos do experimento, o número de gaiolas varia. Utilizar pelo menos três gaiolas por data de amostragem. Para estimar o número de besouros que surgirão, prepare pelo menos três gaiolas adicionais, que não serão retiradas do solo até a primavera.
<ol><li>Use gaiolas feitas de uma estrutura rígida de madeira com um tamanho de 25 × 25 × 40 cm (L × W × H).</li>
	<li>Para construir uma armação p...

<ol>
	<li>Alyokhin, A., Benkovskaya, G., Udalov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorado+potato+beetle.">Colorado potato beetle.</a> Insect Pests of Potato. , 29-43 (2022).</li><li>Alyokhin, A., Kryukov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecology+of+a+potato+field.">Ecology of a potato field.</a> Insect Pests of Potato. , 451-462 (2022).</li><li>Lee Jr, R. E., Costanzo, J. P., Kaufman, P. E., Lee, M. R., Wyman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-nucleating+active+bacteria+reduce+the+cold-hardiness+of+the+freeze-intolerant+Colorado+potato+beetle+(Coleoptera:+Chrysomelidae).">Ice-nucleating active bacteria reduce the cold-hardiness of the freeze-intolerant Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> Journal of Economic Entomology. 87 (2), 377-381 (1994).</li><li>Ushatinskaja, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diapause+of+insects+and+its+modifications.">Diapause of insects and its modifications.</a> Journal of General Biology. 34, 194-215 (1973).</li><li>Zheng, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+soil+moisture+on+overwintering+pupae+in+Spodopteraexigua+(Lepidoptera:+Noctuidae).">Effect of soil moisture on overwintering pupae in Spodopteraexigua (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Applied Entomology and Zoology. 48, 365-371 (2013).</li><li>Hiiesaar, K., Metspalu, L., J&#245;udu, J., J&#245;gar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-wintering+of+the+Colorado+potato+beetle+(Leptinotarsa+decemlineata+Say)+in+field+conditions+and+factors+affecting+its+population+density+in+Estonia.">Over-wintering of the Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata Say) in field conditions and factors affecting its population density in Estonia.</a> Agronomy Research. 4 (1), 21-30 (2006).</li><li>Yocum, G. D., Rinehart, J. P., Chirumamilla-Chapara, A., Larson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+gene+expression+patterns+during+the+initiation+and+maintenance+phases+of+diapause+in+the+Colorado+potato+beetle,+Leptinotarsa+decemlineata.">Characterization of gene expression patterns during the initiation and maintenance phases of diapause in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata.</a> Journal of Insect Physiology. 55 (1), 32-39 (2009).</li><li>Yocum, G. D., Buckner, J. S., Fatland, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+internal+and+external+lipids+of+nondiapausing+and+diapause+initiation+phase+adult+Colorado+potato+beetles,+Leptinotarsa+decemlineata.">A comparison of internal and external lipids of nondiapausing and diapause initiation phase adult Colorado potato beetles, Leptinotarsa decemlineata.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 159 (3), 163-170 (2011).</li><li>Nikonorov, Y. M., Syrtlanova, L. A., Kitaev, K. A., Benkovskaya, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+activity+of+genes+involved+in+diapause+regulation+in+the+Colorado+Potato+beetle+and+its+change+under+a+fipronil+impact.">Transcription activity of genes involved in diapause regulation in the Colorado Potato beetle and its change under a fipronil impact.</a> Russian Journal of Genetics: Applied Research. 8, 80-86 (2018).</li><li>Govaere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+and+proteome+analyses+to+investigate+the+molecular+underpinnings+of+cold+response+in+the+Colorado+potato+beetle,+Leptinotarsa+decemlineata.">Transcriptome and proteome analyses to investigate the molecular underpinnings of cold response in the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata.</a> Cryobiology. 88, 54-63 (2019).</li><li>Lehmann, P., Westberg, M., Tang, P., Lindstr&#246;m, L., K&#228;kel&#228;, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diapause+lipidomes+of+three+closely+related+beetle+species+reveal+mechanisms+for+tolerating+energetic+and+cold+stress+in+high-latitude+seasonal+environments.">The diapause lipidomes of three closely related beetle species reveal mechanisms for tolerating energetic and cold stress in high-latitude seasonal environments.</a> Frontiers in Physiology. 11, 576617 (2020).</li><li>Lebenzon, J. E., Torson, A. S., Sinclair, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diapause+differentially+modulates+the+transcriptomes+of+fat+body+and+flight+muscle+in+the+Colorado+potato+beetle.">Diapause differentially modulates the transcriptomes of fat body and flight muscle in the Colorado potato beetle.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 40, 100906 (2021).</li><li>Lashomb, J. H., Ng, Y. S., Ghidiu, G., Green, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+of+spring+emergence+by+the+Colorado+potato+beetle,+Leptinotarsa+decemlineata+(Say)+(Coleoptera:+Chrysomelidae),+in+New+Jersey.">Description of spring emergence by the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Say) (Coleoptera: Chrysomelidae), in New Jersey.</a> Environmental entomology. 13 (3), 907-910 (1984).</li><li>Cantwell, G. E., Cantelo, W. W., Schroder, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Beauveria+bassiana+on+underground+stages+of+the+Colorado+potato+beetle,+Leptinotarsa+decemlineata+(Coleoptera:+Chrysomelidae).">Effect of Beauveria bassiana on underground stages of the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> The Great Lakes Entomologist. 19 (2), 6 (1986).</li><li>Fedorko, A., Bajan, C., Kmitowa, K., Wojciehowska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+the+use+of+selected+microorganisms+to+control+the+Colorado+beetle+during+hibernation.">Effectiveness of the use of selected microorganisms to control the Colorado beetle during hibernation.</a> Ecological Studies. 3 (2), 127-134 (1977).</li><li>Gaugler, R., Costa, S. D., Lashomb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+efficacy+of+Beauveria+bassiana+soil+inoculations.">Stability and efficacy of Beauveria bassiana soil inoculations.</a> Environmental Entomology. 18 (3), 412-417 (1989).</li><li>Bajan, C., Kmitowa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+entomopathogenic+fungi+to+the+natural+winter+reduction+of+Colorado+beetle+adults.">Contribution of entomopathogenic fungi to the natural winter reduction of Colorado beetle adults.</a> Polish Ecological Studies. 3 (2), 107-114 (1977).</li><li>Milner, M., Kung, K. S., Wyman, J. A., Feldman, J., Nordheim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+overwintering+mortality+of+Colorado+potato+beetle+(Coleoptera:+Chrysomelidae)+by+manipulating+the+temperature+of+its+diapause+habitat.">Enhancing overwintering mortality of Colorado potato beetle (Coleoptera: Chrysomelidae) by manipulating the temperature of its diapause habitat.</a> Journal of Economic Entomology. 85 (5), 1701-1708 (1992).</li><li>Do&#287;an, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+calcium+signaling+proteins+from+the+fat+body+of+the+Colorado+Potato+Beetle,+Leptinotarsa+decemlineata+(Coleoptera:+Chrysomelidae):+Implications+for+diapause+and+lipid+metabolism.">Characterization of calcium signaling proteins from the fat body of the Colorado Potato Beetle, Leptinotarsa decemlineata (Coleoptera: Chrysomelidae): Implications for diapause and lipid metabolism.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 133, 103549 (2021).</li><li>Benkovskaya, G. V., Udalov, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorado+potato+beetle+investigations+in+the+south+Urals.">Colorado potato beetle investigations in the south Urals.</a> Nova Science Publishers. , (2011).</li><li>Short, C. A., Hahn, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+enough+for+the+winter?+Does+nutritional+status+affect+diapause.">Fat enough for the winter? Does nutritional status affect diapause.</a> Journal of Insect Physiology. , 104488 (2023).</li><li>McDonald, J. R., Bale, J. S., Walters, K. F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-temperature+mortality+and+overwintering+of+the+western+flower+thrips+Frankliniella+occidentalis+(Thysanoptera:+Thripidae).">Low-temperature mortality and overwintering of the western flower thrips Frankliniella occidentalis (Thysanoptera: Thripidae).</a> Bulletin of Entomological Research. 87 (5), 497-505 (1997).</li></ol>

Este estudo mostra que o método proposto para o estudo da sobreinverno de CECs permite obter um número suficiente de insetos em diferentes períodos de hibernação. O sucesso da técnica apresentada depende de vários fatores independentes, sendo o mais importante das condições climáticas. Em um inverno frio e sem neve, o solo pode congelar até toda a profundidade da gaiola. Nesse caso, o risco de morte de todos os besouros aumenta significativamente18. A sobrevivência do besouro depende d...

O besouro da batata Colorado Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) é uma importante praga de plantas Solanaceae, predominantemente batata Solanum tuberosum L. A distribuição geográfica desta espécie é de mais de 16 milhões de km2 e se expande constantemente1. A CEC tem diapausa facultativa de inverno, e a hibernação é obrigatória na zona temperada. A diapausa é induzida por um fotoperíodo de dias curtos e modulada pela temperatura1. Estes besouros passam o inverno na fase adulta, escavando-se no solo. Com o aumento das latitudes, a duração do período de hibernação se estende. Na zona temperada, especialmente nos territórios setentrionais de sua distribuição, o inverno dura até 9 meses: de agosto-setembro até maio-junho (Noskov et al., observações pessoais). Durante esse período, a CEC - assim como qualquer outro inseto da zona temperada - é exposta a condições desfavoráveis de inverno e deve aumentar sua tolerância ao frio. Ao mesmo tempo, o contato dos besouros com o solo aumenta o risco de infecção por vários microrganismos oportunistas e patogênicos2. Portanto, esses besouros precisam manter um certo nível de atividade do sistema imunológico durante a hibernação, o que também é energeticamente caro. No entanto, mesmo que o inseto sobreviva a uma infecção, a doença pode reduzir sua rusticidade ao frio3. Deve-se notar que a baixa temperatura não é a única razão para a mortalidade de inverno da CEC. Um papel importante também é desempenhado pela falta de oxigênio e, em algumas condições, pode ser o principal fator de mortalidade no inverno 4,5.
Sabe-se que a mortalidade natural de inverno da CEC pode ser muito alta, chegando a 100% em solos franco-argilosos6. Assim, o inverno excessivo é um dos períodos mais cruciais no ciclo de vida da CEC. No entanto, dados sobre fisiologia, atividade do sistema imunológico, sobrevida e outros parâmetros da hibernação da CEC em condições naturais ainda são limitados. Há estudos sobre a expressão gênica diferencial e vários parâmetros fisiológicos em adultos com CEC durante a diapausa e em resposta ao choque frio 7,8,9,10,11,12; no entanto, essas análises têm sido realizadas principalmente por indução de diapausa ou estresse ao frio em condições de laboratório, sem flutuações naturais de temperatura, umidade e carga de patógenos nativos. No entanto, pesquisas sobre a fisiologia desses besouros coletados por escavação do solo em condições naturais são importantes. Diferentes aspectos da superinvernada da CEC em condições naturais foram ativamente estudados nas décadas de 1970-1980 13,14,15,16,17,18. Por outro lado, esses estudos não envolveram escavação da CEC do solo no inverno. Além disso, uma técnica de hibernação controlada da CEC e uma descrição das gaiolas não são fornecidas em detalhes. Assim, é necessária investigação sobre a fisiologia da invernada das CECs em ambientes naturais19.
O objetivo deste estudo foi desenvolver e testar um método de hibernação controlada de adultos com CEC em condições naturais. O método proposto permite obter um número desejado de indivíduos com CEC para ensaios microbiológicos, imunológicos e outros durante a hibernação em condições de campo de clima continental. Este método pode ser adaptado e aplicado a outras espécies de insetos que passam o inverno em solo sob neve.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar-agar bacteriological purified</td>
			<td>diaGene</td>
			<td>1806.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bile Esculin Agar</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>M972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endo Agar&#160;</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>M029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose monohydrate-D</td>
			<td>PanReac Applichem</td>
			<td>143140.1000&#934;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactic acid&#160;</td>
			<td>PanReac Applichem</td>
			<td>141034.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani liquid medium</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>G009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical centrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>SCT-15ML-25-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>FBIS SRCAMB</td>
			<td>M<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65862/65862eq01v2.jpg" style="margin: auto;" />030/O61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Medigen</td>
			<td>PBS500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperatutre and humidity datalogger Ecklerk-M-11</td>
			<td>Relsib</td>
			<td></td>
			<td>Waterproof datalogger</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an experimental study on colorado potato beetle hibernation under natural conditions

Uma das principais pragas da batata Solanum tuberosum L. na zona temperada é o inseto besouro da batata Colorado (CEC). A maioria dos estudos sobre a imunidade e as doenças da CEC é realizada durante a fase de alimentação ativa. No entanto, há menos estudos sobre estágios de repouso, embora esses besouros passem a maior parte de seu ciclo de vida em um estado de diapausa (hibernação) de inverno. Neste trabalho, um método para investigar a hibernação da CEC em condições naturais foi desenvolvido e testado, oferecendo a oportunidade de coletar um número suficiente de indivíduos no inverno. Neste artigo, avaliou-se a sobrevida da CEC e identificaram-se agentes infecciosos em diferentes estágios de hibernação. A mortalidade da CEC aumentou durante a hibernação, atingindo um máximo em abril-maio. Fungos entomopatogênicos (Beauveria, Isaria e Lecanicillium) e bactérias Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas e Serratia foram isolados dos insetos mortos. A taxa de sobrevivência dos besouros durante todo o período de hibernação foi de 61%. Não foram encontrados besouros congelados ou dessecados, indicando o sucesso do método apresentado.

Os resultados abaixo sobre CECs durante o inverno mostram temperatura, sobrevivência e infecções do solo.
Dinâmica da temperatura do solo. Temperaturas abaixo de zero nas gaiolas a 30 cm de profundidade foram registradas do final de novembro ao início de abril (Figura 1). A temperatura média nesse período foi de menos 3,3 ± 0,1 °C (média ± erro padrão). A menor temperatura registrada foi de -7,9 °C em meados de fevereiro.
<p cl...

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An Experimental Study on Colorado Potato Beetle Hibernation Under Natural Conditions

Aqui apresentamos um método para estudar a hibernação de besouros da batata Colorado sob as condições naturais da zona temperada, bem como uma técnica para coletar besouros no inverno. Este método permite obter um número desejado de indivíduos invernantes para várias análises em qualquer estágio de hibernação.

Estudo experimental da hibernação do besouro da batata Colorado em condições naturais

One of the major pests of potato Solanum tuberosum L. in the temperate zone is the insect Colorado potato beetle (CPB). Most studies on the immunity and ...

O besouro da batata Colorado é uma das pragas mais sérias da batata na zona temperada. Estudos da imunidade e patogênese desta praga são realizados principalmente na fase ativa. No entanto, na zona temperada, esta praga passa a maior parte do seu ciclo de vida em estado de hibernação.Neste estudo, apresentamos um método para hibernação de besouro de batata Colorado e uma técnica para coleta de besouros no inverno. A principal vantagem deste método é que ele permite obter qualquer número de indivíduos durante o inverno para análise do vírus em qualquer período de hibernação. Use gaiolas feitas de uma estrutura rígida de madeira com um tamanho de 25 por 25 por 40 centímetros.Para construir uma armação para a gaiola, use ripas de madeira com pelo menos dois centímetros de espessura e quatro centímetros de largura. Cubra o interior da gaiola com uma malha de aço inoxidável com um tamanho não superior a cinco por três milímetros. Fixe a malha com um grampeador de madeira.Forre o interior da gaiola com um geotêxtil sintético preto com uma densidade de 60 gramas por metro quadrado. Fixe firmemente um tubo de tecido sintético translúcido respirável, com aproximadamente 60 centímetros de altura no topo da gaiola. Atravesse e fixe duas cordas fortes no fundo da gaiola para retirá-la do solo quando necessário.Cavar um buraco no solo a 40 centímetros de profundidade. Coloque grama seca ou feno no buraco. Coloque a gaiola dentro de modo que o feno ou grama seca fique entre as paredes da gaiola e o solo.Encha as gaiolas com terra do mesmo campo de batata onde os insetos são coletados. Instale registradores de dados de temperatura e umidade à prova d'água nas gaiolas nas profundidades necessárias. Plantar mudas de batata dentro da gaiola três a quatro semanas antes da introdução do besouro e regá-las moderadamente.Fixe um tubo de tecido sintético verticalmente a um bastão de qualquer material instalado na parte externa da gaiola. Coletar manualmente besouros adultos nos campos de batata livres de pesticidas no final da vegetação de batata. Mantenha os besouros coletados em baldes plásticos de 20 litros contendo tampos de batata para alimentar os insetos antes de colocar nas gaiolas.Cubra os baldes com um tecido respirável. Coloque no máximo 200 indivíduos dos besouros sobre as plantas de batata cobertas pela malha de tecido sintético. Quando as tampas de batata forem consumidas, adicione as frescas colocadas em um pote plástico contendo água e troque as tampas de batata diariamente depois.Uma vez que todos os besouros escavados no solo para passar o inverno, desamarre o tubo de tecido sintético do bastão e deite o tecido para baixo. Remova a neve acima da superfície da gaiola. Solte a gaiola de cada lado com uma pá forte.Puxe a gaiola para fora do solo usando cordas. Traga a gaiola para o laboratório. Retire o solo da gaiola em pequenas porções, quebre cuidadosamente grandes pedaços de terra e isole besouros usando pinças.Separe besouros vivos de cadáveres. Os besouros vivos e saudáveis compactam o solo ao seu redor formando uma cavidade de ar, o chamado berço, e, portanto, são facilmente separados do solo. Os besouros mortos por fungos são mumificados ou têm micélio visível na superfície.Os insetos em decomposição bacteriana são escuros. Peneire o solo através de uma peneira para garantir que todos os besouros estejam isolados e não danificados. Coloque cadáveres com sintomas de infecção fúngica ou decomposição bacteriana em um tubo Falcon estéril individual para identificação futura.Armazene besouros vivos em uma geladeira a uma temperatura de 2 graus Celsius até a análise em recipientes ventilados fechados contendo uma bola de algodão úmida. Para coletar hemolinfa, faça uma punção na parte lateral do abdome sob a aorta com uma agulha de insulina. Para isolar o intestino, corte a cápsula da cabeça, esprema todo o conteúdo em uma placa de Petri com tampão fosfato.Separe o intestino e limpe-o da gordura e dos vasos de Malpighi. Separe uma seção desejada do intestino, como o intestino anterior, médio ou posterior. Para isolar o corpo gorduroso, separe-o dos outros tecidos após o isolamento do intestino.Para isolar fungos entomopatogênicos dos cadáveres, coloque os cadáveres mumificados em uma câmara de umidade estéril. Use conídios aéreos ou escleródios do conteúdo interno dos besouros para plaquear em ágar Sabouraud dextrose com ácido láctico a 0,4%. Isolar bactérias dos cadáveres com sintomas de decaimento bacteriano.Corte a cabeça de um besouro, esprema o conteúdo interno e colete em tubos para posterior revestimento em meios para bactérias. Temperaturas abaixo de zero nas gaiolas, a uma profundidade de 30 centímetros, foram registradas do final de novembro ao início de abril. A temperatura média nesse período foi de 3,3 a 0,1 graus Celsius.A menor temperatura registrada foi de 7,9 graus Celsius em meados de fevereiro. A mortalidade dos insetos aumentou durante a hibernação e atingiu um máximo na primavera antes da emergência. O número inicial de besouros foi de 2.000, dos quais 1.470 indivíduos sobreviveram.Assim, a taxa de sobrevivência dos besouros durante a hibernação foi de 61%Uma análise de 530 cadáveres mostrou que durante o período de hibernação 53% deles foram caracterizados por sintomas de decomposição bacteriana e 25% foram caracterizados por sintomas de infecção fúngica. Beauveria dominou entre as culturas isoladas de fungos entomopatogênicos. Metarhizium, Cordyceps e Lecanicillium foram muito menos comuns.Dentre as bactérias isoladas dos cadáveres com sintomas de decomposição bacteriana, foram identificadas espécies pertencentes aos gêneros Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas, Serratia, Rahnella e Glutamicibacter. Usando este método pode resolver o problema de obter besouros de batata Colorado do campo no inverno. Ele permite obter tantos indivíduos quanto você precisa com a baixa taxa de mortalidade dos insetos.O estudo de vários aspectos da hibernação dos besouros é importante tanto do ponto de vista fundamental quanto aplicado para melhorar a abordagem no controle desta praga. E, claro, essa técnica pode ser adaptada para outras espécies de insetos que passam o inverno no solo.

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