Name: تسليط الضوء على المؤلف: التطورات في تكنولوجيا الجسيمات النانوية لتوصيل الأدوية والعلاج المناعي
Uploaded: 2023-11-10T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device at JoVE.com

تم تلقي التمويل من قسم فيشيل للهندسة الحيوية (KM) ، و T32 GM080201 (MA) ، وزمالة Vogel الصيفية الممنوحة (MA) ، ومؤسسة LAM (KM) ، وجمعية الرئة الأمريكية (KM). يود المؤلفون أن يشكروا ميشيل كالوزينسكي على المساعدة في التحرير.

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية UMD (IACUC). تم استخدام الأنسجة من إناث الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 7 إلى 9 أسابيع لهذه الدراسات. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).
1. التفكك اليدوي
ملاحظة: هذه الخط?...

تفكك الأنسجة الميكانيكية الأنزيمية شبه الآلية لتحليل الخلية الواحدة

<ol>
	<li>Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+dissociation+for+single-cell+and+single-nuclei+RNA+sequencing+for+low+amounts+of+input+material.">Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material.</a> Frontiers in Zoology. 19 (1), 27 (2022).</li><li>Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+murine+hepatic+stellate+cells.">Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells.</a> Fibrosis: Methods and Protocols. , 7113-7118 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+endothelial+cells+from+juvenile+nasopharyngeal+angiofibroma.">The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).</li><li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+rna+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies.">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022 (2022).</li><li>McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tissue+dissociation+for+rapid+extraction+of+viable+cells.">Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells.</a> Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).</li><li>Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric-field+facilitated+rapid+and+efficient+dissociation+of+tissues+into+viable+single+cells.">Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10728 (2022).</li><li>Maisel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-lymphangiogenic+VEGFR-3+signaling+modulates+memory+T+cell+responses+in+allergic+airway+inflammation.">Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation.</a> Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).</li><li>Karmakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+to+determine+the+utility+of+automated+tissue+dissociator+for+flowcytometry+based+evaluation+of+hematolymphoid+tumor+tissue+biopsies.">A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies.</a> Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).</li><li>Montanari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated-mechanical+procedure+compared+to+gentle+enzymatic+tissue+dissociation+in+cell+function+studies.">Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies.</a> Biomolecules. 12 (5), 701 (2022).</li><li>Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carpal+tunnel+syndrome:+a+review+of+literature.">Carpal tunnel syndrome: a review of literature.</a> Cureus. 12 (3), e7333 (2020).</li></ol>

تم تصميم هذا الجهاز لسهولة التجميع في إعداد البحث لتوفير معلقات أحادية الخلية من الأنسجة الكاملة لتحليل الخلية الواحدة لاحقا. الميزات ، على الرغم من أنها أساسية ، كافية لتلبية احتياجات الباحثين في البيئات الأكاديمية وخارجها. تتمثل إحدى الفوائد الرئيسية لاستخدام هذا الجهاز في قدرته على ت...

أصبح تحليل الخلية الواحدة سريعا أمرا بالغ الأهمية للاكتشافات الطبية الحيوية الجديدة ، سواء لتطبيقات مثل قياس التدفق الخلوي ، وتحديد أنواع الخلايا المختلفة ، أو تسلسل الخلية الواحدة ، أو لتحديد الاختلافات الجينومية أو النسخية بين الخلايا1. يتطلب إجراء عمليات عزل الخلايا هذه من الأنسجة ذات الأهمية فرم الأنسجة المقطعة ودفعها عبر مصفاة خلايا دقيقة لتصفية النسيج الضام من الخلايا المرغوبة (الشكل 1 أ). يتطلب عزل أنواع الخلايا الملتصقة ، مثل الخلايا المتغصنة أو الضامة ، أو الخلايا من الأنسجة الليفية بشكل خاص ، خطوات فصل ميكانيكية أو إنزيمية إضافية2،3،4. تتم هذه العملية يدويا بشكل عام ، مما يجعلها تستغرق وقتا طويلا وعرضة لتقلب المستخدم عند تقييم إنتاجية الخلايا وصلاحية العينة. لذلك ، من الأهمية بمكان تقديم خيارات قابلة للتخصيص لتفكك الأنسجة الآلي. في حين بذلت بعض المحاولات لتصميم مثل هذه الأنظمة ، فإن الخيارات الحالية لا يمكن الوصول إليها دائما بسهولة ، لا سيما في المختبرات الأكاديمية والإعدادات ذات الموارد المنخفضة ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى الطبيعة الباهظة التكلفة لهذه الأجهزة5. علاوة على ذلك ، لا تكون هذه الأجهزة قابلة للتخصيص دائما وفقا للاحتياجات الفردية لمجموعة البحث6.
هنا ، تم تصميم جهاز فك الأنسجة لأتمتة هضم الأنسجة الكاملة أو قطع الأنسجة في معلقات أحادية الخلية بمساعدة الإنزيمات الهاضمة والاضطراب الميكانيكي. يمكن تجميع هذا الجهاز بسهولة في المختبر ، ووضعه في غرف التدفئة أو التبريد لتنظيم درجة الحرارة ، وتخصيصه للعدد المطلوب من الأنسجة لفصلها ، وبرمجته ببروتوكولات التفكك المطلوبة. يمكن أن يؤدي الاستخدام الواسع لهذا الجهاز إلى تحسين إمكانية استنساخ بروتوكولات استخراج الخلايا بشكل كبير وتوفير بديل موفر للوقت للتفكك اليدوي.
يسمح التصميم بالهضم المتزامن لما يصل إلى 12 منديلا من خلال عملية آلية. يتكون الجهاز من 12 محركا فرديا سلكيا بالتوازي ويتم تشغيله بواسطة قابس حائط قياسي من خلال محول AC / DC مع قرص جهد قابل للتعديل للتحكم في دوران / سرعة المحركات. تقوم المحركات بتحويل مسمار سداسي يتناسب بشكل مريح مع الجزء العلوي من الأنابيب C. يتم تثبيت الأنابيب C في مكانها عن طريق الشد لأسفل على لوحة أكريليك تغلق على جانبي اللوحة العلوية حيث يتم تأمين المحركات (الشكل 1 ب). نظرا لأن المحركات سلكية بالتوازي ، يجب ألا تختلف سرعتها عند أي جهد معين كثيرا ، ولكن الحمل (عدد الأنابيب C المثبتة على الجهاز) سيؤثر على السرعة حتى عندما يظل الجهد ثابتا. لقياس الدورات في الدقيقة (rpm) ، تم دمج مقياس سرعة الدوران باستخدام مستشعر تأثير القاعة ومغناطيس ثابت على أحد أعمدة المحرك (الشكل التكميلي 1). يتم توفير ملفات CAD لبناء صفائف المحركات في ملف الترميز التكميلي 1. كما يشتمل على مفتاح قابل للبرمجة لعكس اتجاه الدوران عن طريق عكس الشحنات الموجبة / السالبة التي يتم تسليمها إلى المحركات. تم دمج كل هذه الميزات باستخدام برنامج مشفر (برنامج Arduino IDE ، انظر جدول المواد) على Arduino Nano (ملف الترميز التكميلي 2). باستخدام الأزرار المتصلة ولوحة LCD (الشكل التكميلي 2) ، من الممكن إنشاء وتشغيل بروتوكولات محفوظة ومخصصة ، وعكس اتجاه الدوران تلقائيا في أوقات محددة من البروتوكول ، وضبط السرعة باستخدام الجهد (الشكل التكميلي 3) ، وعرض سرعة المحرك الحالية والوقت المتبقي لإكمال بروتوكول مبرمج (الشكل التكميلي 4).
بالنسبة للدراسة الحالية ، تم تحضير معلقات أحادية الخلية باستخدام كل من تفكك الأنسجة الأنزيمية الميكانيكية مع هذا الجهاز وتفكك الأنسجة الأنزيمية اليدوية لتحديد الاختلافات ، إن وجدت ، في الخلايا المستعادة للتطبيقات النهائية. تم تقييم الاستعدادات الخلوية على أساس إجمالي غلة الخلايا لكل نسيج والنسبة المئوية لصلاحية الخلية. تم استخدام قياس التدفق الخلوي لمقارنة الاختلافات المحتملة في تعبير علامة السطح. تم تحليل البيانات باستخدام الرسوم البيانية وبرامج التحليل الإحصائي. تم استخدام اختبارات Welch t غير المزاوجة لمقارنة أزواج من العينات أو المجموعات ، مع أحجام العينات n > 4 الفئران التي تمثل 2 تجربة تكرار. يمكن العثور على تعليمات مفصلة لتصنيع وتجميع هذا الجهاز في الملف التكميلي 1. يتم سرد المواد اللازمة لهذا البروتوكول في جدول المواد.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#188; inch acrylic sheet&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Acrylic Mega Store</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#189; inch acrylic sheet 12&#34; x 12&#34;</td>
			<td>SimbaLux</td>
			<td>SL-AS13-12x12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 G stainless steel wire (for tension arms)</td>
			<td>Everbilt</td>
			<td>1000847413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 G electrical wire (stranded)</td>
			<td>Best Connections</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x 3 mm magnet&#160;&#160;</td>
			<td>SU-CRO0587</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)</td>
			<td>AEDIKO</td>
			<td>AE06233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Rated Torque: 2.2 Kg.cm 
			Reduction Ratio: 1:22 
			Rated Current: 0.1 A 
			D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24&#34; x 0.55&#34;) (D x L) 
			Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46&#34; x 0.98&#34;) (D x L) 
			Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43&#34; x 1.31&#34;) (D x L) 
			Mounting Hole Size: M3 (not included)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/C Power Adapter with variable voltage controller&#160;&#160; (5 Amps, 3-12 volts)</td>
			<td>Mo-gu</td>
			<td>J19091-2-MG-US</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer</td>
			<td>Walfront</td>
			<td>1A</td>
			<td>(power adapter for powering Arduino Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano&#160;&#160; (Lafvin)</td>
			<td>LAFVIN</td>
			<td>8541582500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons&#160;</td>
			<td>Awpeye</td>
			<td>Push-button</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 4</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS4 LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided foam tape</td>
			<td>SANKA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided prototyping circuit board</td>
			<td>deyue</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical solder and soldering iron</td>
			<td>LDK</td>
			<td>1002P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>03429NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad, La Jolla, CA</td>
			<td></td>
			<td>Graphing and statistical analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches</td>
			<td>SunFounder</td>
			<td>43237-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12</td>
			<td>Uxcell</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12</td>
			<td>FAS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumper wires (for Arduino Nano)</td>
			<td>ELEGOO</td>
			<td>EL-CP-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD screen</td>
			<td>JANSANE</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12</td>
			<td>Shenzhen 
			Baishichuangyou 
			Technology co.Ltd</td>
			<td>310luosditaozhuang</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36</td>
			<td>Still Awake</td>
			<td>a52400001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick disconnect terminal connectors</td>
			<td>IEUYO</td>
			<td>22010064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>46232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Shenzhen 
			Weiyapuhua 
			Technology</td>
			<td>60-026-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanical dissociation of tissues for single cell analysis using a motorized device

أصبحت القدرة على عزل الخلايا المفردة وإعدادها لتحليل عينات الأنسجة أمرا بالغ الأهمية للاكتشافات والأبحاث الطبية الحيوية الجديدة. تستغرق البروتوكولات اليدوية لعمليات عزل الخلية الواحدة وقتا طويلا للغاية وعرضة لتنوع المستخدم. البروتوكولات الميكانيكية الآلية قادرة على تقليل وقت المعالجة وتنوع العينات ولكن لا يمكن الوصول إليها بسهولة أو فعالة من حيث التكلفة في إعدادات البحث منخفضة الموارد. تم تصميم الجهاز الموصوف هنا لتفكك الأنسجة شبه الآلي باستخدام المواد المتاحة تجاريا كبديل منخفض التكلفة للمختبرات الأكاديمية. تم توفير تعليمات لتصنيع وتجميع وتشغيل تصميم الجهاز. ينتج بروتوكول التفكك بشكل موثوق معلقات أحادية الخلية مع إنتاجية خلايا مماثلة وصلاحية عينة للمستحضرات اليدوية عبر أنسجة الفئران المتعددة. يوفر البروتوكول القدرة على معالجة ما يصل إلى 12 عينة من الأنسجة في وقت واحد لكل جهاز ، مما يجعل الدراسات التي تتطلب أحجام عينات كبيرة أكثر قابلية للإدارة. يسمح البرنامج المصاحب أيضا بتخصيص بروتوكول الجهاز لاستيعاب الأنسجة المختلفة والقيود التجريبية.

Single-cell analysis has rapidly become crucial for new biomedical discoveries, whether for applications such as flow cytometry, identifying different cell types, single-cell sequencing, or for identifying genomic or transcriptomic variations between cells1. Performing such cell isolations from tissues of interest&#160;requires mincing dissected tissues and pushing them through a fine cell strainer to filter out connective tissue from the desired cells (Figure 1A). Isolating adherent cell types, such as dendritic cells or macrophages, or cells from particularly fibrous tissues, requires additional mechanical or enzymatic separation steps2,3,4. This process is generally done manually, making it highly time-consuming and prone to user variability when assessing cell yields and sample viability. Therefore, it is crucial to introduce customizable options for automated tissue dissociation. While some attempts have been made to design such systems, the existing options are not always readily accessible, particularly in academic labs and lower-resource settings, largely due to the cost-prohibitive nature of these devices5. Furthermore, these devices are not always customizable to the individual needs of a research group6.
Here, a tissue dissociator device was designed to automate the digestion of whole tissues or tissue pieces into single-cell suspensions with the aid of digestive enzymes and mechanical disruption. This device can be easily assembled in the lab, placed into heating or cooling chambers for temperature regulation, customized for the required number of tissues to dissociate, and programmed with the desired dissociation protocols. The broad use of this device could significantly improve the reproducibility of cell extraction protocols and provide a time-saving alternative to manual dissociation.
The design allows for the simultaneous digestion of up to 12 tissues through an automated process. The device is composed of 12 individual motors wired in parallel and powered by a standard wall plug through an AC/DC adapter with an adjustable voltage dial to control the rotation/speed of the motors. The motors turn a hex bolt that fits snugly into the top of the C-tubes. The C-tubes are held in place by downward tension on an acrylic plate that latches on either side to the top plate where the motors are secured (Figure 1B). Because the motors are wired in parallel, their speed at any given voltage should not vary much, but the load (the number of C-tubes mounted on the device) will affect speed even when the voltage is kept constant. To measure rotations per minute (rpm), a tachometer has been incorporated using a hall effect sensor and a fixed magnet on one of the motor shafts (Supplementary Figure 1). The CAD files for building motor arrays are provided in Supplementary Coding File 1. Also included is a programmable switch to reverse the direction of rotation by reversing the positive/negative charges delivered to the motors. All of these features are integrated using coded software (Arduino IDE software, see Table of Materials) on an Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Using connected buttons and an LCD panel (Supplementary Figure 2), it is possible to create and run saved and custom protocols, automatically reverse the rotational direction at specified times of a protocol, adjust speed using the voltage (Supplementary Figure 3), and display the current motor speed and time left to complete a programmed protocol (Supplementary Figure 4).
For the present study, single-cell suspensions were prepared using both mechanical-enzymatic tissue dissociation with this device and manual-enzymatic tissue dissociation to determine differences, if any, in cells recovered for downstream applications. The cell preparations were evaluated based on total cell yields per tissue and&#160;percent cell viability. Flow&#160;cytometry was used to compare potential differences in surface marker expression. Data were analyzed using graphing and statistical analysis software. Unpaired Welch t-tests were used to compare pairs of samples or groups, with sample sizes n &#62; 4 mice representing 2 replicate experiments. Detailed instructions for the fabrication and assembly of this device can be found in Supplementary File 1. Materials needed for this protocol are listed in the Table of Materials.

تسليط الضوء على المؤلف: التطورات في تكنولوجيا الجسيمات النانوية لتوصيل الأدوية والعلاج المناعي

التفكك الميكانيكي للأنسجة لتحليل الخلية المفردة باستخدام جهاز آلي

Our lab develops nanoparticles as tools to study biological barriers and to overcome these barriers at mucosal surfaces to improve drug delivery and immunotherapy. One of the most notable developments is the COVID-19 vaccines by Pfizer, BioNTech, and Moderna that use lipid nanoparticle formulations to deliver mRNA for vaccination. There are a lot of ongoing efforts to improve immunotherapies like vaccines and cancer treatments using nanoparticles, as these formulations could improve target delivery to immune cells and reduce the systemic side effects of immunotherapies.Single cell analysis is an essential component of immunology in biomedical research, one of the most common techniques being flow cytometry. Performing such cell isolations from tissues of interest requires reliable tissue dissociation. Making laboratory research more accessible without compromising quality and accuracy can be challenging.Automating processes makes technical and labor intensive steps easier to learn and allows trainees to gain experience doing more sophisticated analyses without affecting the reliability of results. The main advantage of this protocol and the accompanying device design is its customizability and cost effectiveness. The ability to process up to 12 tissues simultaneously reduces processing times.This low cost alternative makes this technology more accessible in lower resourced research settings.

يمكن لهذا البروتوكول الميكانيكي شبه الآلي تكرار نتائج التجارب التي تمت فيها معالجة الخلايا يدويا. تظهر معلقات الخلايا المحضرة باستخدام هذا الجهاز وعن طريق التفكك اليدوي إنتاجية خلايا مماثلة وصلاحية عينة عبر رئة الفأر والكلى وأنسجة القلب (الشكل 2 أ ، ب). لم تتأثر م...

Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device at JoVE.com

يتم توفير بروتوكول عام للتفكك الميكانيكي الأنزيمي وشبه الآلي المشترك للأنسجة لتوليد معلقات أحادية الخلية للتحليلات النهائية ، مثل قياس التدفق الخلوي. يتم تضمين تعليمات لتصنيع وتجميع وتشغيل الجهاز الميكانيكي منخفض التكلفة الذي تم تطويره لهذا البروتوكول.

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. ...

يطور مختبرنا الجسيمات النانوية كأدوات لدراسة الحواجز البيولوجية والتغلب على هذه الحواجز على الأسطح المخاطية لتحسين توصيل الأدوية والعلاج المناعي. أحد أبرز التطورات هو لقاحات COVID-19 من قبل Pfizer و BioNTech و Moderna التي تستخدم تركيبات الجسيمات النانوية الدهنية لتوصيل mRNA للتطعيم. هناك الكثير من الجهود الجارية لتحسين العلاجات المناعية مثل اللقاحات وعلاجات السرطان باستخدام الجسيمات النانوية ، حيث يمكن لهذه التركيبات تحسين التوصيل المستهدف للخلايا المناعية وتقليل الآثار الجانبية الجهازية للعلاجات المناعية.يعد تحليل الخلية الواحدة مكونا أساسيا في علم المناعة في الأبحاث الطبية الحيوية ، ومن أكثر التقنيات شيوعا قياس التدفق الخلوي. يتطلب إجراء مثل هذه العزلات الخلوية من الأنسجة ذات الأهمية تفككا موثوقا للأنسجة. قد يكون تسهيل الوصول إلى الأبحاث المختبرية دون المساس بالجودة والدقة أمرا صعبا.تجعل أتمتة العمليات الخطوات الفنية وكثيفة العمالة أسهل في التعلم وتسمح للمتدربين باكتساب الخبرة في إجراء تحليلات أكثر تعقيدا دون التأثير على موثوقية النتائج. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول وتصميم الجهاز المصاحب هي قابليته للتخصيص وفعالية التكلفة. القدرة على معالجة ما يصل إلى 12 منديلا في وقت واحد تقلل من أوقات المعالجة.هذا البديل منخفض التكلفة يجعل هذه التكنولوجيا أكثر سهولة في إعدادات البحث ذات الموارد المنخفضة.

mechanical-dissociation-tissues-for-single-cell-analysis-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. Manual protocols for single-cell isolations are highly time-consuming and prone to user variability. Automated mechanical protocols are able to reduce processing time and sample variability but aren't easily accessible or cost-effective in lower-resourced research settings. The device described here was designed for semi-automated tissue dissociation using commercially available materials as a low-cost alternative for academic laboratories. Instructions to fabricate, assemble, and operate the device design have been provided. The dissociation protocol reliably produces single-cell suspensions with comparable cell yields and sample viability to manual preparations across multiple mouse tissues. The protocol provides the ability to process up to 12 tissue samples simultaneously per device, making studies requiring large sample sizes more manageable. The accompanying software also allows for customization of the device protocol to accommodate varying tissues and experimental constraints.

A general protocol for the combined enzymatic and semi-automated mechanical dissociation of tissues to generate single-cell suspensions for downstream analyses, such as flow cytometry, is provided. Instructions for the fabrication, assembly, and operation of the low-cost mechanical device developed for this protocol are included.

Semi-Automated Mechanical Dissociation of Mouse Tissues to Generate Single-Cell Suspensions

To begin, place the dissected mouse tissue in a cold cell culture medium containing 5%FBS. Using sharp dissection scissors, chop the tissue until approximately five millimeters fragments are obtained. Transfer the chopped fragments to a C-tube and add one milliliter of cell culture media.Load the C-tube onto the motorized device and fit the tube holder plate over the D-shaped tube bottoms. Latch the tension arms into the acrylic plate to secure the tubes to the motor plate. To set a custom program on the motorized device from the main menu, press the blue button to choose custom mode.In the first custom mode menu, press the green button to specify the duration of forward rotation to 30 seconds. Then press the blue button to select the on screen value. In the second custom mode menu, press the green button to specify the duration of reverse rotation to 10 seconds.Then press the blue button to select the on screen value. In the third custom mode menu, press the red button to specify the selection loops to four times. Then press the blue button to select the on screen value.Adjust the voltage control dial to 200 RPM and start the custom program. Next, add digestion enzyme in four milliliters of cold culture media containing dissected tissues. Again, load the C-tube onto the device and repeat the custom program as demonstrated previously.After the run, transfer the device with the loaded tubes to a 37 degree Celsius incubator for 45 minutes. Next, load the C-tube onto the device and set the custom program at 50 RPM with forward rotation to 270 seconds. Reverse rotation to 30 seconds and looping nine times.Add EDTA to a five millimolar final concentration to the sample. Set the custom program at 100 RPM with forward rotation to 30 seconds. Reverse rotation to 10 seconds and looping twice.Next, pass the cell suspension through a 70 micrometer cell strainer and collect the filtrate in a 50 or 15 milliliter tube. Centrifuge the collected cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees Celsius and discard the supernatant. Re-suspend the pellet in one milliliter of red blood cell lysis buffer, and incubate for one minute.Neutralize the lysis buffer with nine milliliters of cold PBS. Again, centrifuge the cells and re-suspend the pellet in the desired buffer or media. Cell suspension prepared with motorized device and manual dissociation exhibited comparable cell viability and yields across mouse lung, kidney, and heart tissues.Immune cell populations like T-cells and dendritic cells were not significantly affected by the isolation protocol. Surface marker expression also showed similar frequencies of isolated T-cells in mean fluorescence intensity for the antigen presentation marker MHC II in dendritic cells between manual and device isolation.