Name: Auteur in de schijnwerpers: Vooruitgang in nanodeeltjestechnologie voor medicijnafgifte en immunotherapie
Uploaded: 2023-11-10T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device at JoVE.com

Financiering werd ontvangen van het Fischell Department of Bioengineering (KM), T32 GM080201 (MA), Vogel Endowed Summer Fellowship (MA), LAM Foundation (KM) en American Lung Association (KM). De auteurs willen Michele Kaluzienski bedanken voor zijn hulp bij het redigeren.

Dit protocol is goedgekeurd door de UMD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Voor deze onderzoeken werden weefsels van 7 tot 9 weken oude vrouwelijke C57BL/6J-muizen gebruikt. De dieren zijn afkomstig van een commerciële bron (zie Materiaaltabel).
1. Handmatige dissociatie
OPMERKING: Deze stap is een bewerking van Maisel K. et al.7.
<ol><li>Verwijder ontleed weefsel en plaats het in koude c...

Semi-geautomatiseerde mechanisch-enzymatische weefseldissociatie voor analyse van één cel

<ol>
	<li>Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+dissociation+for+single-cell+and+single-nuclei+RNA+sequencing+for+low+amounts+of+input+material.">Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material.</a> Frontiers in Zoology. 19 (1), 27 (2022).</li><li>Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+murine+hepatic+stellate+cells.">Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells.</a> Fibrosis: Methods and Protocols. , 7113-7118 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+endothelial+cells+from+juvenile+nasopharyngeal+angiofibroma.">The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).</li><li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+rna+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies.">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022 (2022).</li><li>McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tissue+dissociation+for+rapid+extraction+of+viable+cells.">Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells.</a> Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).</li><li>Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric-field+facilitated+rapid+and+efficient+dissociation+of+tissues+into+viable+single+cells.">Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10728 (2022).</li><li>Maisel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-lymphangiogenic+VEGFR-3+signaling+modulates+memory+T+cell+responses+in+allergic+airway+inflammation.">Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation.</a> Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).</li><li>Karmakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+to+determine+the+utility+of+automated+tissue+dissociator+for+flowcytometry+based+evaluation+of+hematolymphoid+tumor+tissue+biopsies.">A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies.</a> Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).</li><li>Montanari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated-mechanical+procedure+compared+to+gentle+enzymatic+tissue+dissociation+in+cell+function+studies.">Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies.</a> Biomolecules. 12 (5), 701 (2022).</li><li>Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carpal+tunnel+syndrome:+a+review+of+literature.">Carpal tunnel syndrome: a review of literature.</a> Cureus. 12 (3), e7333 (2020).</li></ol>

Dit apparaat is ontworpen voor eenvoudige montage in de onderzoeksomgeving om eencellige suspensies uit hele weefsels te leveren voor daaropvolgende analyse van één cel. De functies, hoewel eenvoudig, zijn voldoende om te voldoen aan de behoeften van onderzoekers in academische omgevingen en daarbuiten. Een belangrijk voordeel van het gebruik van dit apparaat is het potentieel om de bereiding van eencellige suspensies te verbeteren door de variabiliteit te verminderen. Bovendien zou de mogelijkheid om 12+ monsters tege...

Single-cell analyse is snel cruciaal geworden voor nieuwe biomedische ontdekkingen, of het nu gaat om toepassingen zoals flowcytometrie, het identificeren van verschillende celtypen, single-cell sequencing, of voor het identificeren van genomische of transcriptomische variaties tussen cellen. Om dergelijke celisolaties uit weefsels van belang uit te voeren, moeten ontlede weefsels worden gehakt en door een fijne celzeef worden geduwd om bindweefsel uit de gewenste cellen te filteren (Figuur 1A). Het isoleren van aanhangende celtypen, zoals dendritische cellen of macrofagen, of cellen uit bijzonder vezelige weefsels, vereist aanvullende mechanische of enzymatische scheidingsstappen 2,3,4. Dit proces wordt over het algemeen handmatig uitgevoerd, waardoor het zeer tijdrovend is en vatbaar voor gebruikersvariabiliteit bij het beoordelen van de celopbrengst en de levensvatbaarheid van het monster. Daarom is het van cruciaal belang om aanpasbare opties voor geautomatiseerde weefseldissociatie te introduceren. Hoewel er enkele pogingen zijn ondernomen om dergelijke systemen te ontwerpen, zijn de bestaande opties niet altijd gemakkelijk toegankelijk, met name in academische laboratoria en omgevingen met minder middelen, grotendeels vanwege de onbetaalbare aard van deze apparaten5. Bovendien zijn deze apparaten niet altijd aanpasbaar aan de individuele behoeften van een onderzoeksgroep6.
Hier werd een weefseldissociatorapparaat ontworpen om de vertering van hele weefsels of weefselstukken in eencellige suspensies te automatiseren met behulp van spijsverteringsenzymen en mechanische verstoring. Dit apparaat kan eenvoudig in het laboratorium worden geassembleerd, in verwarmings- of koelkamers worden geplaatst voor temperatuurregeling, aangepast aan het vereiste aantal te dissociëren weefsels en worden geprogrammeerd met de gewenste dissociatieprotocollen. Het brede gebruik van dit apparaat zou de reproduceerbaarheid van celextractieprotocollen aanzienlijk kunnen verbeteren en een tijdbesparend alternatief kunnen bieden voor handmatige dissociatie.
Het ontwerp maakt de gelijktijdige vertering van maximaal 12 weefsels mogelijk via een geautomatiseerd proces. Het apparaat bestaat uit 12 afzonderlijke motoren die parallel zijn aangesloten en worden gevoed door een standaard stopcontact via een AC/DC-adapter met een instelbare spanningsknop om de rotatie/snelheid van de motoren te regelen. De motoren draaien een zeskantbout die precies in de bovenkant van de C-buizen past. De C-buizen worden op hun plaats gehouden door neerwaartse spanning op een acrylplaat die aan weerszijden wordt vergrendeld aan de bovenplaat waar de motoren zijn vastgezet (Figuur 1B). Omdat de motoren parallel zijn aangesloten, zou hun snelheid bij een bepaalde spanning niet veel moeten variëren, maar de belasting (het aantal C-buizen dat op het apparaat is gemonteerd) zal de snelheid beïnvloeden, zelfs als de spanning constant wordt gehouden. Voor het meten van omwentelingen per minuut (rpm) is een toerenteller ingebouwd met behulp van een hall-effectsensor en een vaste magneet op een van de motorassen (aanvullende figuur 1). De CAD-bestanden voor het bouwen van motorarrays zijn te vinden in aanvullend coderingsbestand 1. Ook inbegrepen is een programmeerbare schakelaar om de draairichting om te keren door de positieve/negatieve ladingen die aan de motoren worden geleverd om te keren. Al deze functies zijn geïntegreerd met behulp van gecodeerde software (Arduino IDE-software, zie Tabel met materialen) op een Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Met behulp van aangesloten knoppen en een LCD-paneel (aanvullende afbeelding 2) is het mogelijk om opgeslagen en aangepaste protocollen te maken en uit te voeren, automatisch de draairichting om te keren op bepaalde tijden van een protocol, de snelheid aan te passen met behulp van de spanning (aanvullende afbeelding 3) en het huidige motortoerental en de resterende tijd weer te geven om een geprogrammeerd protocol te voltooien (aanvullende afbeelding 4).
Voor de huidige studie werden eencellige suspensies bereid met behulp van zowel mechanisch-enzymatische weefseldissociatie met dit apparaat als manueel-enzymatische weefseldissociatie om eventuele verschillen te bepalen in cellen die zijn teruggewonnen voor stroomafwaartse toepassingen. De celpreparaten werden geëvalueerd op basis van de totale celopbrengst per weefsel en het percentage cellevensvatbaarheid. Flowcytometrie werd gebruikt om potentiële verschillen in expressie van oppervlaktemarkers te vergelijken. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van grafische en statistische analysesoftware. Ongepaarde Welch t-tests werden gebruikt om paren van monsters of groepen te vergelijken, waarbij steekproefgroottes n > 4 muizen 2 gerepliceerde experimenten vertegenwoordigden. Gedetailleerde instructies voor de fabricage en montage van dit apparaat zijn te vinden in Aanvullend bestand 1. Materialen die nodig zijn voor dit protocol staan vermeld in de Tabel met materialen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#188; inch acrylic sheet&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Acrylic Mega Store</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#189; inch acrylic sheet 12&#34; x 12&#34;</td>
			<td>SimbaLux</td>
			<td>SL-AS13-12x12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 G stainless steel wire (for tension arms)</td>
			<td>Everbilt</td>
			<td>1000847413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 G electrical wire (stranded)</td>
			<td>Best Connections</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x 3 mm magnet&#160;&#160;</td>
			<td>SU-CRO0587</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)</td>
			<td>AEDIKO</td>
			<td>AE06233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Rated Torque: 2.2 Kg.cm 
			Reduction Ratio: 1:22 
			Rated Current: 0.1 A 
			D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24&#34; x 0.55&#34;) (D x L) 
			Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46&#34; x 0.98&#34;) (D x L) 
			Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43&#34; x 1.31&#34;) (D x L) 
			Mounting Hole Size: M3 (not included)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/C Power Adapter with variable voltage controller&#160;&#160; (5 Amps, 3-12 volts)</td>
			<td>Mo-gu</td>
			<td>J19091-2-MG-US</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer</td>
			<td>Walfront</td>
			<td>1A</td>
			<td>(power adapter for powering Arduino Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano&#160;&#160; (Lafvin)</td>
			<td>LAFVIN</td>
			<td>8541582500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons&#160;</td>
			<td>Awpeye</td>
			<td>Push-button</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 4</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS4 LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided foam tape</td>
			<td>SANKA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided prototyping circuit board</td>
			<td>deyue</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical solder and soldering iron</td>
			<td>LDK</td>
			<td>1002P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>03429NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad, La Jolla, CA</td>
			<td></td>
			<td>Graphing and statistical analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches</td>
			<td>SunFounder</td>
			<td>43237-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12</td>
			<td>Uxcell</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12</td>
			<td>FAS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumper wires (for Arduino Nano)</td>
			<td>ELEGOO</td>
			<td>EL-CP-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD screen</td>
			<td>JANSANE</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12</td>
			<td>Shenzhen 
			Baishichuangyou 
			Technology co.Ltd</td>
			<td>310luosditaozhuang</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36</td>
			<td>Still Awake</td>
			<td>a52400001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick disconnect terminal connectors</td>
			<td>IEUYO</td>
			<td>22010064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>46232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Shenzhen 
			Weiyapuhua 
			Technology</td>
			<td>60-026-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanical dissociation of tissues for single cell analysis using a motorized device

Het kunnen isoleren en voorbereiden van afzonderlijke cellen voor de analyse van weefselmonsters is snel cruciaal geworden voor nieuwe biomedische ontdekkingen en onderzoek. Handmatige protocollen voor eencellige isolaties zijn zeer tijdrovend en vatbaar voor gebruikersvariabiliteit. Geautomatiseerde mechanische protocollen zijn in staat om de verwerkingstijd en de variabiliteit van monsters te verminderen, maar zijn niet gemakkelijk toegankelijk of kosteneffectief in onderzoeksomgevingen met minder middelen. Het hier beschreven apparaat is ontworpen voor semi-geautomatiseerde weefseldissociatie met behulp van in de handel verkrijgbare materialen als een goedkoop alternatief voor academische laboratoria. Er zijn instructies gegeven voor het vervaardigen, monteren en bedienen van het apparaatontwerp. Het dissociatieprotocol produceert op betrouwbare wijze eencellige suspensies met vergelijkbare celopbrengsten en levensvatbaarheid van monsters als handmatige preparaten in meerdere muizenweefsels. Het protocol biedt de mogelijkheid om tot 12 weefselmonsters tegelijk per apparaat te verwerken, waardoor onderzoeken die grote steekproefgroottes vereisen, beter beheersbaar worden. De bijbehorende software maakt het ook mogelijk om het apparaatprotocol aan te passen aan verschillende weefsels en experimentele beperkingen.

Single-cell analysis has rapidly become crucial for new biomedical discoveries, whether for applications such as flow cytometry, identifying different cell types, single-cell sequencing, or for identifying genomic or transcriptomic variations between cells1. Performing such cell isolations from tissues of interest&#160;requires mincing dissected tissues and pushing them through a fine cell strainer to filter out connective tissue from the desired cells (Figure 1A). Isolating adherent cell types, such as dendritic cells or macrophages, or cells from particularly fibrous tissues, requires additional mechanical or enzymatic separation steps2,3,4. This process is generally done manually, making it highly time-consuming and prone to user variability when assessing cell yields and sample viability. Therefore, it is crucial to introduce customizable options for automated tissue dissociation. While some attempts have been made to design such systems, the existing options are not always readily accessible, particularly in academic labs and lower-resource settings, largely due to the cost-prohibitive nature of these devices5. Furthermore, these devices are not always customizable to the individual needs of a research group6.
Here, a tissue dissociator device was designed to automate the digestion of whole tissues or tissue pieces into single-cell suspensions with the aid of digestive enzymes and mechanical disruption. This device can be easily assembled in the lab, placed into heating or cooling chambers for temperature regulation, customized for the required number of tissues to dissociate, and programmed with the desired dissociation protocols. The broad use of this device could significantly improve the reproducibility of cell extraction protocols and provide a time-saving alternative to manual dissociation.
The design allows for the simultaneous digestion of up to 12 tissues through an automated process. The device is composed of 12 individual motors wired in parallel and powered by a standard wall plug through an AC/DC adapter with an adjustable voltage dial to control the rotation/speed of the motors. The motors turn a hex bolt that fits snugly into the top of the C-tubes. The C-tubes are held in place by downward tension on an acrylic plate that latches on either side to the top plate where the motors are secured (Figure 1B). Because the motors are wired in parallel, their speed at any given voltage should not vary much, but the load (the number of C-tubes mounted on the device) will affect speed even when the voltage is kept constant. To measure rotations per minute (rpm), a tachometer has been incorporated using a hall effect sensor and a fixed magnet on one of the motor shafts (Supplementary Figure 1). The CAD files for building motor arrays are provided in Supplementary Coding File 1. Also included is a programmable switch to reverse the direction of rotation by reversing the positive/negative charges delivered to the motors. All of these features are integrated using coded software (Arduino IDE software, see Table of Materials) on an Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Using connected buttons and an LCD panel (Supplementary Figure 2), it is possible to create and run saved and custom protocols, automatically reverse the rotational direction at specified times of a protocol, adjust speed using the voltage (Supplementary Figure 3), and display the current motor speed and time left to complete a programmed protocol (Supplementary Figure 4).
For the present study, single-cell suspensions were prepared using both mechanical-enzymatic tissue dissociation with this device and manual-enzymatic tissue dissociation to determine differences, if any, in cells recovered for downstream applications. The cell preparations were evaluated based on total cell yields per tissue and&#160;percent cell viability. Flow&#160;cytometry was used to compare potential differences in surface marker expression. Data were analyzed using graphing and statistical analysis software. Unpaired Welch t-tests were used to compare pairs of samples or groups, with sample sizes n &#62; 4 mice representing 2 replicate experiments. Detailed instructions for the fabrication and assembly of this device can be found in Supplementary File 1. Materials needed for this protocol are listed in the Table of Materials.

Auteur in de schijnwerpers: Vooruitgang in nanodeeltjestechnologie voor medicijnafgifte en immunotherapie

Mechanische dissociatie van weefsels voor analyse van één cel met behulp van een gemotoriseerd apparaat

Our lab develops nanoparticles as tools to study biological barriers and to overcome these barriers at mucosal surfaces to improve drug delivery and immunotherapy. One of the most notable developments is the COVID-19 vaccines by Pfizer, BioNTech, and Moderna that use lipid nanoparticle formulations to deliver mRNA for vaccination. There are a lot of ongoing efforts to improve immunotherapies like vaccines and cancer treatments using nanoparticles, as these formulations could improve target delivery to immune cells and reduce the systemic side effects of immunotherapies.Single cell analysis is an essential component of immunology in biomedical research, one of the most common techniques being flow cytometry. Performing such cell isolations from tissues of interest requires reliable tissue dissociation. Making laboratory research more accessible without compromising quality and accuracy can be challenging.Automating processes makes technical and labor intensive steps easier to learn and allows trainees to gain experience doing more sophisticated analyses without affecting the reliability of results. The main advantage of this protocol and the accompanying device design is its customizability and cost effectiveness. The ability to process up to 12 tissues simultaneously reduces processing times.This low cost alternative makes this technology more accessible in lower resourced research settings.

Dit semi-geautomatiseerde mechanische protocol kan resultaten repliceren van experimenten waarbij cellen handmatig werden verwerkt. Celsuspensies die met dit apparaat en door handmatige dissociatie worden bereid, vertonen vergelijkbare celopbrengsten en levensvatbaarheid van monsters in long-, nier- en hartweefsel van muizen (Figuur 2A,B). Populaties van immuuncellen, zoals T-cellen en dendritische cellen, werden niet significant beïnvloed door een verschil in isolatieproto...

Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device at JoVE.com

Er wordt een algemeen protocol opgesteld voor de gecombineerde enzymatische en semi-geautomatiseerde mechanische dissociatie van weefsels om eencellige suspensies te genereren voor stroomafwaartse analyses, zoals flowcytometrie. Instructies voor de fabricage, montage en bediening van het goedkope mechanische apparaat dat voor dit protocol is ontwikkeld, zijn inbegrepen.

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. ...

Ons lab ontwikkelt nanodeeltjes als hulpmiddelen om biologische barrières te bestuderen en deze barrières op slijmvliesoppervlakken te overwinnen om de medicijnafgifte en immunotherapie te verbeteren. Een van de meest opvallende ontwikkelingen zijn de COVID-19-vaccins van Pfizer, BioNTech en Moderna die lipide nanodeeltjesformuleringen gebruiken om mRNA af te leveren voor vaccinatie. Er zijn veel lopende inspanningen om immunotherapieën zoals vaccins en kankerbehandelingen met behulp van nanodeeltjes te verbeteren, omdat deze formuleringen de doelafgifte aan immuuncellen kunnen verbeteren en de systemische bijwerkingen van immunotherapieën kunnen verminderen.Analyse van één cel is een essentieel onderdeel van de immunologie in biomedisch onderzoek, een van de meest voorkomende technieken is flowcytometrie. Het uitvoeren van dergelijke celisolaties van weefsels van belang vereist betrouwbare weefseldissociatie. Het kan een uitdaging zijn om laboratoriumonderzoek toegankelijker te maken zonder afbreuk te doen aan kwaliteit en nauwkeurigheid.Het automatiseren van processen maakt het gemakkelijker om technische en arbeidsintensieve stappen te leren en stelt cursisten in staat ervaring op te doen met het uitvoeren van meer geavanceerde analyses zonder de betrouwbaarheid van de resultaten aan te tasten. Het belangrijkste voordeel van dit protocol en het bijbehorende apparaatontwerp is de aanpasbaarheid en kosteneffectiviteit. De mogelijkheid om tot 12 weefsels tegelijk te verwerken, verkort de verwerkingstijden.Dit goedkope alternatief maakt deze technologie toegankelijker in onderzoeksomgevingen met minder middelen.

mechanical-dissociation-tissues-for-single-cell-analysis-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. Manual protocols for single-cell isolations are highly time-consuming and prone to user variability. Automated mechanical protocols are able to reduce processing time and sample variability but aren't easily accessible or cost-effective in lower-resourced research settings. The device described here was designed for semi-automated tissue dissociation using commercially available materials as a low-cost alternative for academic laboratories. Instructions to fabricate, assemble, and operate the device design have been provided. The dissociation protocol reliably produces single-cell suspensions with comparable cell yields and sample viability to manual preparations across multiple mouse tissues. The protocol provides the ability to process up to 12 tissue samples simultaneously per device, making studies requiring large sample sizes more manageable. The accompanying software also allows for customization of the device protocol to accommodate varying tissues and experimental constraints.

A general protocol for the combined enzymatic and semi-automated mechanical dissociation of tissues to generate single-cell suspensions for downstream analyses, such as flow cytometry, is provided. Instructions for the fabrication, assembly, and operation of the low-cost mechanical device developed for this protocol are included.

Semi-Automated Mechanical Dissociation of Mouse Tissues to Generate Single-Cell Suspensions

To begin, place the dissected mouse tissue in a cold cell culture medium containing 5%FBS. Using sharp dissection scissors, chop the tissue until approximately five millimeters fragments are obtained. Transfer the chopped fragments to a C-tube and add one milliliter of cell culture media.Load the C-tube onto the motorized device and fit the tube holder plate over the D-shaped tube bottoms. Latch the tension arms into the acrylic plate to secure the tubes to the motor plate. To set a custom program on the motorized device from the main menu, press the blue button to choose custom mode.In the first custom mode menu, press the green button to specify the duration of forward rotation to 30 seconds. Then press the blue button to select the on screen value. In the second custom mode menu, press the green button to specify the duration of reverse rotation to 10 seconds.Then press the blue button to select the on screen value. In the third custom mode menu, press the red button to specify the selection loops to four times. Then press the blue button to select the on screen value.Adjust the voltage control dial to 200 RPM and start the custom program. Next, add digestion enzyme in four milliliters of cold culture media containing dissected tissues. Again, load the C-tube onto the device and repeat the custom program as demonstrated previously.After the run, transfer the device with the loaded tubes to a 37 degree Celsius incubator for 45 minutes. Next, load the C-tube onto the device and set the custom program at 50 RPM with forward rotation to 270 seconds. Reverse rotation to 30 seconds and looping nine times.Add EDTA to a five millimolar final concentration to the sample. Set the custom program at 100 RPM with forward rotation to 30 seconds. Reverse rotation to 10 seconds and looping twice.Next, pass the cell suspension through a 70 micrometer cell strainer and collect the filtrate in a 50 or 15 milliliter tube. Centrifuge the collected cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees Celsius and discard the supernatant. Re-suspend the pellet in one milliliter of red blood cell lysis buffer, and incubate for one minute.Neutralize the lysis buffer with nine milliliters of cold PBS. Again, centrifuge the cells and re-suspend the pellet in the desired buffer or media. Cell suspension prepared with motorized device and manual dissociation exhibited comparable cell viability and yields across mouse lung, kidney, and heart tissues.Immune cell populations like T-cells and dendritic cells were not significantly affected by the isolation protocol. Surface marker expression also showed similar frequencies of isolated T-cells in mean fluorescence intensity for the antigen presentation marker MHC II in dendritic cells between manual and device isolation.