Name: Pleins feux sur l’auteur : Progrès de la technologie des nanoparticules pour l’administration de médicaments et l’immunothérapie
Uploaded: 2023-11-10T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device at JoVE.com

Le financement a été reçu du département de bio-ingénierie Fischell (KM), du T32 GM080201 (MA), de la bourse d’été Vogel (MA), de la Fondation LAM (KM) et de l’American Lung Association (KM). Les auteurs tiennent à remercier Michele Kaluzienski pour son aide à l’édition.

Ce protocole a été approuvé par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’UMD (IACUC). Des tissus de souris C57BL/6J femelles âgées de 7 à 9 semaines ont été utilisés pour ces études. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir la Table des matières).
1. Dissociation manuelle
NOTE : Cette étape est adaptée de Maisel K. et al.7.
<ol><li>Retirez le...

Dissociation mécano-enzymatique semi-automatisée pour l’analyse de cellules uniques

<ol>
	<li>Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+dissociation+for+single-cell+and+single-nuclei+RNA+sequencing+for+low+amounts+of+input+material.">Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material.</a> Frontiers in Zoology. 19 (1), 27 (2022).</li><li>Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+murine+hepatic+stellate+cells.">Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells.</a> Fibrosis: Methods and Protocols. , 7113-7118 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+endothelial+cells+from+juvenile+nasopharyngeal+angiofibroma.">The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).</li><li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+rna+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies.">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022 (2022).</li><li>McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tissue+dissociation+for+rapid+extraction+of+viable+cells.">Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells.</a> Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).</li><li>Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric-field+facilitated+rapid+and+efficient+dissociation+of+tissues+into+viable+single+cells.">Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10728 (2022).</li><li>Maisel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-lymphangiogenic+VEGFR-3+signaling+modulates+memory+T+cell+responses+in+allergic+airway+inflammation.">Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation.</a> Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).</li><li>Karmakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+to+determine+the+utility+of+automated+tissue+dissociator+for+flowcytometry+based+evaluation+of+hematolymphoid+tumor+tissue+biopsies.">A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies.</a> Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).</li><li>Montanari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated-mechanical+procedure+compared+to+gentle+enzymatic+tissue+dissociation+in+cell+function+studies.">Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies.</a> Biomolecules. 12 (5), 701 (2022).</li><li>Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carpal+tunnel+syndrome:+a+review+of+literature.">Carpal tunnel syndrome: a review of literature.</a> Cureus. 12 (3), e7333 (2020).</li></ol>

Ce dispositif a été conçu pour être facilement assemblé dans le cadre de la recherche afin de fournir des suspensions unicellulaires à partir de tissus entiers pour une analyse ultérieure sur cellule unique. Les fonctionnalités, bien que basiques, sont suffisantes pour répondre aux besoins des chercheurs en milieu universitaire et au-delà. L’un des principaux avantages de l’utilisation de ce dispositif est son potentiel d’amélioration de la préparation des suspensions unicellulaires en réduisant la var...

L’analyse de cellules uniques est rapidement devenue cruciale pour les nouvelles découvertes biomédicales, que ce soit pour des applications telles que la cytométrie en flux, l’identification de différents types de cellules, le séquençage de cellules uniques ou pour l’identification de variations génomiques ou transcriptomiques entre les cellules1. Pour effectuer de tels isolements cellulaires à partir de tissus d’intérêt, il faut hacher des tissus disséqués et les pousser à travers une fine passoire cellulaire pour filtrer le tissu conjonctif des cellules souhaitées (Figure 1A). L’isolement des types de cellules adhérentes, telles que les cellules dendritiques ou les macrophages, ou les cellules de tissus particulièrement fibreux, nécessite des étapes de séparation mécaniques ou enzymatiques supplémentaires 2,3,4. Ce processus est généralement effectué manuellement, ce qui le rend très long et sujet à la variabilité de l’utilisateur lors de l’évaluation des rendements cellulaires et de la viabilité des échantillons. Par conséquent, il est crucial d’introduire des options personnalisables pour la dissociation tissulaire automatisée. Bien que certaines tentatives aient été faites pour concevoir de tels systèmes, les options existantes ne sont pas toujours facilement accessibles, en particulier dans les laboratoires universitaires et les milieux à faibles ressources, en grande partie en raison de la nature prohibitive de ces dispositifs5. De plus, ces appareils ne sont pas toujours personnalisables en fonction des besoins individuels d’un groupe de recherche6.
Ici, un dispositif de dissociation tissulaire a été conçu pour automatiser la digestion de tissus entiers ou de morceaux de tissus en suspensions unicellulaires à l’aide d’enzymes digestives et de perturbations mécaniques. Cet appareil peut être facilement assemblé en laboratoire, placé dans des chambres de chauffage ou de refroidissement pour la régulation de la température, personnalisé pour le nombre requis de tissus à dissocier et programmé avec les protocoles de dissociation souhaités. L’utilisation généralisée de ce dispositif pourrait améliorer considérablement la reproductibilité des protocoles d’extraction cellulaire et fournir une alternative rapide à la dissociation manuelle.
La conception permet la digestion simultanée de jusqu’à 12 tissus grâce à un processus automatisé. L’appareil est composé de 12 moteurs individuels câblés en parallèle et alimentés par une prise murale standard via un adaptateur AC/DC avec un cadran de tension réglable pour contrôler la rotation/vitesse des moteurs. Les moteurs font tourner un boulon hexagonal qui s’insère parfaitement dans le haut des tubes en C. Les tubes C sont maintenus en place par une tension vers le bas sur une plaque acrylique qui se verrouille de chaque côté à la plaque supérieure où les moteurs sont fixés (Figure 1B). Parce que les moteurs sont câblés en parallèle, leur vitesse à une tension donnée ne devrait pas varier beaucoup, mais la charge (le nombre de tubes C montés sur l’appareil) affectera la vitesse même lorsque la tension est maintenue constante. Pour mesurer les rotations par minute (tr/min), un tachymètre a été incorporé à l’aide d’un capteur à effet Hall et d’un aimant fixe sur l’un des arbres du moteur (Figure supplémentaire 1). Les fichiers CAO pour la construction de réseaux de moteurs sont fournis dans le fichier de codage supplémentaire 1. Un interrupteur programmable est également inclus pour inverser le sens de rotation en inversant les charges positives/négatives délivrées aux moteurs. Toutes ces fonctionnalités sont intégrées à l’aide d’un logiciel codé (logiciel Arduino IDE, voir Table des matériaux) sur un Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). À l’aide de boutons connectés et d’un écran LCD (Figure supplémentaire 2), il est possible de créer et d’exécuter des protocoles enregistrés et personnalisés, d’inverser automatiquement le sens de rotation à des moments spécifiés d’un protocole, d’ajuster la vitesse à l’aide de la tension (Figure supplémentaire 3) et d’afficher la vitesse actuelle du moteur et le temps restant pour terminer un protocole programmé (Figure supplémentaire 4).
Pour la présente étude, des suspensions unicellulaires ont été préparées en utilisant à la fois la dissociation tissulaire mécanique-enzymatique avec ce dispositif et la dissociation tissulaire-enzymatique manuelle pour déterminer les différences, le cas échéant, dans les cellules récupérées pour des applications en aval. Les préparations cellulaires ont été évaluées en fonction du rendement total des cellules par tissu et du pourcentage de viabilité cellulaire. La cytométrie en flux a été utilisée pour comparer les différences potentielles dans l’expression des marqueurs de surface. Les données ont été analysées à l’aide d’un logiciel de graphisme et d’analyse statistique. Des tests t de Welch non appariés ont été utilisés pour comparer des paires d’échantillons ou de groupes, avec des tailles d’échantillon n > 4 souris représentant 2 expériences répétées. Des instructions détaillées pour la fabrication et l’assemblage de cet appareil se trouvent dans le dossier supplémentaire 1. Le matériel nécessaire à ce protocole est indiqué dans le tableau des matériaux.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#188; inch acrylic sheet&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Acrylic Mega Store</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#189; inch acrylic sheet 12&#34; x 12&#34;</td>
			<td>SimbaLux</td>
			<td>SL-AS13-12x12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 G stainless steel wire (for tension arms)</td>
			<td>Everbilt</td>
			<td>1000847413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 G electrical wire (stranded)</td>
			<td>Best Connections</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x 3 mm magnet&#160;&#160;</td>
			<td>SU-CRO0587</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)</td>
			<td>AEDIKO</td>
			<td>AE06233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Rated Torque: 2.2 Kg.cm 
			Reduction Ratio: 1:22 
			Rated Current: 0.1 A 
			D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24&#34; x 0.55&#34;) (D x L) 
			Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46&#34; x 0.98&#34;) (D x L) 
			Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43&#34; x 1.31&#34;) (D x L) 
			Mounting Hole Size: M3 (not included)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/C Power Adapter with variable voltage controller&#160;&#160; (5 Amps, 3-12 volts)</td>
			<td>Mo-gu</td>
			<td>J19091-2-MG-US</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer</td>
			<td>Walfront</td>
			<td>1A</td>
			<td>(power adapter for powering Arduino Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano&#160;&#160; (Lafvin)</td>
			<td>LAFVIN</td>
			<td>8541582500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons&#160;</td>
			<td>Awpeye</td>
			<td>Push-button</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 4</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS4 LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided foam tape</td>
			<td>SANKA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided prototyping circuit board</td>
			<td>deyue</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical solder and soldering iron</td>
			<td>LDK</td>
			<td>1002P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>03429NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad, La Jolla, CA</td>
			<td></td>
			<td>Graphing and statistical analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches</td>
			<td>SunFounder</td>
			<td>43237-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12</td>
			<td>Uxcell</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12</td>
			<td>FAS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumper wires (for Arduino Nano)</td>
			<td>ELEGOO</td>
			<td>EL-CP-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD screen</td>
			<td>JANSANE</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12</td>
			<td>Shenzhen 
			Baishichuangyou 
			Technology co.Ltd</td>
			<td>310luosditaozhuang</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36</td>
			<td>Still Awake</td>
			<td>a52400001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick disconnect terminal connectors</td>
			<td>IEUYO</td>
			<td>22010064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>46232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Shenzhen 
			Weiyapuhua 
			Technology</td>
			<td>60-026-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanical dissociation of tissues for single cell analysis using a motorized device

Être capable d’isoler et de préparer des cellules uniques pour l’analyse d’échantillons de tissus est rapidement devenu crucial pour les nouvelles découvertes et recherches biomédicales. Les protocoles manuels pour les isolements de cellules uniques prennent beaucoup de temps et sont sujets à la variabilité de l’utilisateur. Les protocoles mécaniques automatisés sont capables de réduire le temps de traitement et la variabilité des échantillons, mais ne sont pas facilement accessibles ou rentables dans les milieux de recherche à faibles ressources. Le dispositif décrit ici a été conçu pour la dissociation semi-automatisée des tissus en utilisant des matériaux disponibles dans le commerce comme alternative peu coûteuse pour les laboratoires universitaires. Des instructions pour fabriquer, assembler et utiliser la conception de l’appareil ont été fournies. Le protocole de dissociation produit de manière fiable des suspensions unicellulaires avec des rendements cellulaires et une viabilité d’échantillon comparables à ceux des préparations manuelles sur plusieurs tissus de souris. Le protocole offre la possibilité de traiter jusqu’à 12 échantillons de tissus simultanément par dispositif, ce qui facilite la gestion des études nécessitant des échantillons de grande taille. Le logiciel qui l’accompagne permet également de personnaliser le protocole du dispositif pour s’adapter à divers tissus et contraintes expérimentales.

Single-cell analysis has rapidly become crucial for new biomedical discoveries, whether for applications such as flow cytometry, identifying different cell types, single-cell sequencing, or for identifying genomic or transcriptomic variations between cells1. Performing such cell isolations from tissues of interest&#160;requires mincing dissected tissues and pushing them through a fine cell strainer to filter out connective tissue from the desired cells (Figure 1A). Isolating adherent cell types, such as dendritic cells or macrophages, or cells from particularly fibrous tissues, requires additional mechanical or enzymatic separation steps2,3,4. This process is generally done manually, making it highly time-consuming and prone to user variability when assessing cell yields and sample viability. Therefore, it is crucial to introduce customizable options for automated tissue dissociation. While some attempts have been made to design such systems, the existing options are not always readily accessible, particularly in academic labs and lower-resource settings, largely due to the cost-prohibitive nature of these devices5. Furthermore, these devices are not always customizable to the individual needs of a research group6.
Here, a tissue dissociator device was designed to automate the digestion of whole tissues or tissue pieces into single-cell suspensions with the aid of digestive enzymes and mechanical disruption. This device can be easily assembled in the lab, placed into heating or cooling chambers for temperature regulation, customized for the required number of tissues to dissociate, and programmed with the desired dissociation protocols. The broad use of this device could significantly improve the reproducibility of cell extraction protocols and provide a time-saving alternative to manual dissociation.
The design allows for the simultaneous digestion of up to 12 tissues through an automated process. The device is composed of 12 individual motors wired in parallel and powered by a standard wall plug through an AC/DC adapter with an adjustable voltage dial to control the rotation/speed of the motors. The motors turn a hex bolt that fits snugly into the top of the C-tubes. The C-tubes are held in place by downward tension on an acrylic plate that latches on either side to the top plate where the motors are secured (Figure 1B). Because the motors are wired in parallel, their speed at any given voltage should not vary much, but the load (the number of C-tubes mounted on the device) will affect speed even when the voltage is kept constant. To measure rotations per minute (rpm), a tachometer has been incorporated using a hall effect sensor and a fixed magnet on one of the motor shafts (Supplementary Figure 1). The CAD files for building motor arrays are provided in Supplementary Coding File 1. Also included is a programmable switch to reverse the direction of rotation by reversing the positive/negative charges delivered to the motors. All of these features are integrated using coded software (Arduino IDE software, see Table of Materials) on an Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Using connected buttons and an LCD panel (Supplementary Figure 2), it is possible to create and run saved and custom protocols, automatically reverse the rotational direction at specified times of a protocol, adjust speed using the voltage (Supplementary Figure 3), and display the current motor speed and time left to complete a programmed protocol (Supplementary Figure 4).
For the present study, single-cell suspensions were prepared using both mechanical-enzymatic tissue dissociation with this device and manual-enzymatic tissue dissociation to determine differences, if any, in cells recovered for downstream applications. The cell preparations were evaluated based on total cell yields per tissue and&#160;percent cell viability. Flow&#160;cytometry was used to compare potential differences in surface marker expression. Data were analyzed using graphing and statistical analysis software. Unpaired Welch t-tests were used to compare pairs of samples or groups, with sample sizes n &#62; 4 mice representing 2 replicate experiments. Detailed instructions for the fabrication and assembly of this device can be found in Supplementary File 1. Materials needed for this protocol are listed in the Table of Materials.

Pleins feux sur l’auteur : Progrès de la technologie des nanoparticules pour l’administration de médicaments et l’immunothérapie

Dissociation mécanique de tissus pour l’analyse de cellules uniques à l’aide d’un dispositif motorisé

Our lab develops nanoparticles as tools to study biological barriers and to overcome these barriers at mucosal surfaces to improve drug delivery and immunotherapy. One of the most notable developments is the COVID-19 vaccines by Pfizer, BioNTech, and Moderna that use lipid nanoparticle formulations to deliver mRNA for vaccination. There are a lot of ongoing efforts to improve immunotherapies like vaccines and cancer treatments using nanoparticles, as these formulations could improve target delivery to immune cells and reduce the systemic side effects of immunotherapies.Single cell analysis is an essential component of immunology in biomedical research, one of the most common techniques being flow cytometry. Performing such cell isolations from tissues of interest requires reliable tissue dissociation. Making laboratory research more accessible without compromising quality and accuracy can be challenging.Automating processes makes technical and labor intensive steps easier to learn and allows trainees to gain experience doing more sophisticated analyses without affecting the reliability of results. The main advantage of this protocol and the accompanying device design is its customizability and cost effectiveness. The ability to process up to 12 tissues simultaneously reduces processing times.This low cost alternative makes this technology more accessible in lower resourced research settings.

Ce protocole mécanique semi-automatisé peut reproduire les résultats d’expériences dans lesquelles les cellules ont été traitées manuellement. Les suspensions cellulaires préparées à l’aide de ce dispositif et par dissociation manuelle montrent des rendements cellulaires et une viabilité d’échantillon comparables dans les tissus pulmonaires, rénaux et cardiaques de souris (Figure 2A,B). Les populations de cellules immunitaires, telles que les lymphocytes T...

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Un protocole général pour la dissociation mécanique enzymatique et semi-automatisée combinée des tissus afin de générer des suspensions unicellulaires pour des analyses en aval, telles que la cytométrie en flux, est fourni. Des instructions pour la fabrication, l’assemblage et le fonctionnement du dispositif mécanique à faible coût développé pour ce protocole sont incluses.

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. ...

Notre laboratoire développe des nanoparticules comme outils pour étudier les barrières biologiques et surmonter ces barrières à la surface des muqueuses afin d’améliorer l’administration de médicaments et l’immunothérapie. L’un des développements les plus notables est celui des vaccins COVID-19 de Pfizer, BioNTech et Moderna qui utilisent des formulations de nanoparticules lipidiques pour délivrer de l’ARNm pour la vaccination. De nombreux efforts sont en cours pour améliorer les immunothérapies telles que les vaccins et les traitements contre le cancer utilisant des nanoparticules, car ces formulations pourraient améliorer l’administration de la cible aux cellules immunitaires et réduire les effets secondaires systémiques des immunothérapies.L’analyse de cellules uniques est une composante essentielle de l’immunologie dans la recherche biomédicale, l’une des techniques les plus courantes étant la cytométrie en flux. La réalisation de tels isolements cellulaires à partir de tissus d’intérêt nécessite une dissociation tissulaire fiable. Rendre la recherche en laboratoire plus accessible sans compromettre la qualité et la précision peut être un défi.L’automatisation des processus facilite l’apprentissage des étapes techniques et laborieuses et permet aux stagiaires d’acquérir de l’expérience en effectuant des analyses plus sophistiquées sans affecter la fiabilité des résultats. Le principal avantage de ce protocole et de la conception de l’appareil qui l’accompagne est sa personnalisation et sa rentabilité. La possibilité de traiter jusqu’à 12 tissus simultanément réduit les temps de traitement.Cette alternative peu coûteuse rend cette technologie plus accessible dans les milieux de recherche à faibles ressources.

mechanical-dissociation-tissues-for-single-cell-analysis-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. Manual protocols for single-cell isolations are highly time-consuming and prone to user variability. Automated mechanical protocols are able to reduce processing time and sample variability but aren't easily accessible or cost-effective in lower-resourced research settings. The device described here was designed for semi-automated tissue dissociation using commercially available materials as a low-cost alternative for academic laboratories. Instructions to fabricate, assemble, and operate the device design have been provided. The dissociation protocol reliably produces single-cell suspensions with comparable cell yields and sample viability to manual preparations across multiple mouse tissues. The protocol provides the ability to process up to 12 tissue samples simultaneously per device, making studies requiring large sample sizes more manageable. The accompanying software also allows for customization of the device protocol to accommodate varying tissues and experimental constraints.

A general protocol for the combined enzymatic and semi-automated mechanical dissociation of tissues to generate single-cell suspensions for downstream analyses, such as flow cytometry, is provided. Instructions for the fabrication, assembly, and operation of the low-cost mechanical device developed for this protocol are included.

Recherche

Bio-ingénierie

Semi-Automated Mechanical Dissociation of Mouse Tissues to Generate Single-Cell Suspensions

To begin, place the dissected mouse tissue in a cold cell culture medium containing 5%FBS. Using sharp dissection scissors, chop the tissue until approximately five millimeters fragments are obtained. Transfer the chopped fragments to a C-tube and add one milliliter of cell culture media.Load the C-tube onto the motorized device and fit the tube holder plate over the D-shaped tube bottoms. Latch the tension arms into the acrylic plate to secure the tubes to the motor plate. To set a custom program on the motorized device from the main menu, press the blue button to choose custom mode.In the first custom mode menu, press the green button to specify the duration of forward rotation to 30 seconds. Then press the blue button to select the on screen value. In the second custom mode menu, press the green button to specify the duration of reverse rotation to 10 seconds.Then press the blue button to select the on screen value. In the third custom mode menu, press the red button to specify the selection loops to four times. Then press the blue button to select the on screen value.Adjust the voltage control dial to 200 RPM and start the custom program. Next, add digestion enzyme in four milliliters of cold culture media containing dissected tissues. Again, load the C-tube onto the device and repeat the custom program as demonstrated previously.After the run, transfer the device with the loaded tubes to a 37 degree Celsius incubator for 45 minutes. Next, load the C-tube onto the device and set the custom program at 50 RPM with forward rotation to 270 seconds. Reverse rotation to 30 seconds and looping nine times.Add EDTA to a five millimolar final concentration to the sample. Set the custom program at 100 RPM with forward rotation to 30 seconds. Reverse rotation to 10 seconds and looping twice.Next, pass the cell suspension through a 70 micrometer cell strainer and collect the filtrate in a 50 or 15 milliliter tube. Centrifuge the collected cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees Celsius and discard the supernatant. Re-suspend the pellet in one milliliter of red blood cell lysis buffer, and incubate for one minute.Neutralize the lysis buffer with nine milliliters of cold PBS. Again, centrifuge the cells and re-suspend the pellet in the desired buffer or media. Cell suspension prepared with motorized device and manual dissociation exhibited comparable cell viability and yields across mouse lung, kidney, and heart tissues.Immune cell populations like T-cells and dendritic cells were not significantly affected by the isolation protocol. Surface marker expression also showed similar frequencies of isolated T-cells in mean fluorescence intensity for the antigen presentation marker MHC II in dendritic cells between manual and device isolation.