Name: Autor im Rampenlicht: Fortschritte in der Nanopartikeltechnologie für die Verabreichung von Medikamenten und die Immuntherapie
Uploaded: 2023-11-10T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device at JoVE.com

Die Finanzierung erfolgte durch das Fischell Department of Bioengineering (KM), T32 GM080201 (MA), das Vogel Endowed Summer Fellowship (MA), die LAM Foundation (KM) und die American Lung Association (KM). Die Autoren danken Michele Kaluzienski für die Hilfe bei der Bearbeitung.

Dieses Protokoll wurde vom UMD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Für diese Studien wurden Gewebe von 7 bis 9 Wochen alten weiblichen C57BL/6J-Mäusen verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle).
1. Manuelle Dissoziation
HINWEIS: Dieser Schritt wurde von Maisel K. et al.7 übernommen.
<ol><li>Entfernen Sie präpariertes Gewebe und l...

Halbautomatische mechanisch-enzymatische Gewebedissoziation für die Einzelzellanalyse

<ol>
	<li>Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+dissociation+for+single-cell+and+single-nuclei+RNA+sequencing+for+low+amounts+of+input+material.">Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material.</a> Frontiers in Zoology. 19 (1), 27 (2022).</li><li>Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+murine+hepatic+stellate+cells.">Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells.</a> Fibrosis: Methods and Protocols. , 7113-7118 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+endothelial+cells+from+juvenile+nasopharyngeal+angiofibroma.">The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).</li><li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+rna+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies.">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022 (2022).</li><li>McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tissue+dissociation+for+rapid+extraction+of+viable+cells.">Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells.</a> Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).</li><li>Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric-field+facilitated+rapid+and+efficient+dissociation+of+tissues+into+viable+single+cells.">Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10728 (2022).</li><li>Maisel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-lymphangiogenic+VEGFR-3+signaling+modulates+memory+T+cell+responses+in+allergic+airway+inflammation.">Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation.</a> Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).</li><li>Karmakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+to+determine+the+utility+of+automated+tissue+dissociator+for+flowcytometry+based+evaluation+of+hematolymphoid+tumor+tissue+biopsies.">A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies.</a> Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).</li><li>Montanari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated-mechanical+procedure+compared+to+gentle+enzymatic+tissue+dissociation+in+cell+function+studies.">Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies.</a> Biomolecules. 12 (5), 701 (2022).</li><li>Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carpal+tunnel+syndrome:+a+review+of+literature.">Carpal tunnel syndrome: a review of literature.</a> Cureus. 12 (3), e7333 (2020).</li></ol>

Dieses Gerät wurde für die einfache Montage in der Forschungsumgebung entwickelt, um Einzelzellsuspensionen aus ganzen Geweben für die anschließende Einzelzellanalyse bereitzustellen. Die Funktionen sind zwar einfach, reichen aber aus, um die Bedürfnisse von Forschern im akademischen Umfeld und darüber hinaus zu erfüllen. Ein wesentlicher Vorteil dieses Geräts ist sein Potenzial, die Herstellung von Einzelzellsuspensionen durch Verringerung der Variabilität zu verbessern. Darüber hinaus könnte die Fähigkeit, ...

Die Einzelzellanalyse ist für neue biomedizinische Entdeckungen schnell von entscheidender Bedeutung geworden, sei es für Anwendungen wie die Durchflusszytometrie, die Identifizierung verschiedener Zelltypen, die Einzelzellsequenzierung oder die Identifizierung genomischer oder transkriptomischer Variationen zwischen Zellen1. Die Durchführung solcher Zellisolierungen aus Geweben von Interesse erfordert das Zerkleinern von präpariertem Gewebe und das Schieben durch ein feines Zellsieb, um das Bindegewebe aus den gewünschten Zellen herauszufiltern (Abbildung 1A). Die Isolierung adhärenter Zelltypen, wie dendritische Zellen oder Makrophagen, oder Zellen aus besonders faserigen Geweben erfordert zusätzliche mechanische oder enzymatische Trennschritte 2,3,4. Dieser Prozess wird in der Regel manuell durchgeführt, was ihn sehr zeitaufwändig und anfällig für Benutzerschwankungen bei der Beurteilung von Zellausbeuten und Probenviabilität macht. Daher ist es wichtig, anpassbare Optionen für die automatisierte Gewebedissoziation einzuführen. Es wurden zwar einige Versuche unternommen, solche Systeme zu entwickeln, aber die vorhandenen Optionen sind nicht immer leicht zugänglich, insbesondere in akademischen Labors und ressourcenärmeren Umgebungen, was vor allem auf die unerschwingliche Natur dieser Geräte zurückzuführenist 5. Darüber hinaus sind diese Geräte nicht immer an die individuellen Bedürfnisse einer Forschungsgruppe anpassbar6.
Hier wurde ein Gewebedissoziatorgerät entwickelt, um den Verdau ganzer Gewebe oder Gewebestücke in Einzelzellsuspensionen mit Hilfe von Verdauungsenzymen und mechanischem Aufschluss zu automatisieren. Dieses Gerät kann einfach im Labor zusammengebaut, zur Temperaturregulierung in Heiz- oder Kühlkammern platziert, an die erforderliche Anzahl von zu dissoziierenden Geweben angepasst und mit den gewünschten Dissoziationsprotokollen programmiert werden. Der breite Einsatz dieses Geräts könnte die Reproduzierbarkeit von Zellextraktionsprotokollen erheblich verbessern und eine zeitsparende Alternative zur manuellen Dissoziation bieten.
Das Design ermöglicht den gleichzeitigen Aufschluss von bis zu 12 Geweben durch einen automatisierten Prozess. Das Gerät besteht aus 12 einzelnen Motoren, die parallel geschaltet sind und über einen Standard-Wandstecker über einen AC/DC-Adapter mit einstellbarem Spannungsregler zur Steuerung der Rotation/Drehzahl der Motoren mit Strom versorgt werden. Die Motoren drehen eine Sechskantschraube, die genau in die Oberseite der C-Rohre passt. Die C-Rohre werden durch Abwärtsspannung auf einer Acrylplatte gehalten, die auf beiden Seiten an der oberen Platte einrastet, an der die Motoren befestigt sind (Abbildung 1B). Da die Motoren parallel verdrahtet sind, sollte ihre Drehzahl bei einer bestimmten Spannung nicht stark variieren, aber die Last (die Anzahl der am Gerät montierten C-Röhren) beeinflusst die Drehzahl, selbst wenn die Spannung konstant gehalten wird. Zur Messung der Umdrehungen pro Minute (U/min) wurde ein Drehzahlmesser mit einem Hall-Effekt-Sensor und einem festen Magneten auf einer der Motorwellen eingebaut (Ergänzende Abbildung 1). Die CAD-Dateien für den Bau von Motor-Arrays werden in der ergänzenden Codierungsdatei 1 bereitgestellt. Ebenfalls enthalten ist ein programmierbarer Schalter zur Umkehrung der Drehrichtung durch Umkehrung der an die Motoren abgegebenen positiven/negativen Ladungen. Alle diese Funktionen werden mithilfe einer codierten Software (Arduino IDE-Software, siehe Materialtabelle) auf einem Arduino Nano (Supplementary Coding File 2) integriert. Mit angeschlossenen Tasten und einem LCD-Panel (Ergänzende Abbildung 2) ist es möglich, gespeicherte und benutzerdefinierte Protokolle zu erstellen und auszuführen, die Drehrichtung zu bestimmten Zeiten eines Protokolls automatisch umzukehren, die Drehzahl anhand der Spannung anzupassen (Ergänzende Abbildung 3) und die aktuelle Motordrehzahl und die verbleibende Zeit anzuzeigen, um ein programmiertes Protokoll abzuschließen (Ergänzende Abbildung 4).
Für die vorliegende Studie wurden Einzelzellsuspensionen sowohl unter Verwendung mechanisch-enzymatischer Gewebedissoziation mit diesem Gerät als auch manuell-enzymatischer Gewebedissoziation hergestellt, um gegebenenfalls Unterschiede in Zellen zu bestimmen, die für nachgeschaltete Anwendungen gewonnen wurden. Die Zellpräparate wurden auf der Grundlage der Gesamtzellausbeute pro Gewebe und der prozentualen Zellviabilität bewertet. Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um potenzielle Unterschiede in der Oberflächenmarkerexpression zu vergleichen. Die Daten wurden mit Hilfe von Grafik- und statistischer Analysesoftware analysiert. Unpaarige Welch-t-Tests wurden verwendet, um Paare von Proben oder Gruppen zu vergleichen, wobei die Stichprobengrößen n > 4 Mäusen 2 Wiederholungsexperimente darstellten. Detaillierte Anweisungen zur Herstellung und Montage dieses Geräts finden Sie in der Zusatzdatei 1. Die für dieses Protokoll benötigten Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#188; inch acrylic sheet&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Acrylic Mega Store</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#189; inch acrylic sheet 12&#34; x 12&#34;</td>
			<td>SimbaLux</td>
			<td>SL-AS13-12x12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 G stainless steel wire (for tension arms)</td>
			<td>Everbilt</td>
			<td>1000847413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 G electrical wire (stranded)</td>
			<td>Best Connections</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x 3 mm magnet&#160;&#160;</td>
			<td>SU-CRO0587</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)</td>
			<td>AEDIKO</td>
			<td>AE06233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Rated Torque: 2.2 Kg.cm 
			Reduction Ratio: 1:22 
			Rated Current: 0.1 A 
			D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24&#34; x 0.55&#34;) (D x L) 
			Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46&#34; x 0.98&#34;) (D x L) 
			Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43&#34; x 1.31&#34;) (D x L) 
			Mounting Hole Size: M3 (not included)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/C Power Adapter with variable voltage controller&#160;&#160; (5 Amps, 3-12 volts)</td>
			<td>Mo-gu</td>
			<td>J19091-2-MG-US</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer</td>
			<td>Walfront</td>
			<td>1A</td>
			<td>(power adapter for powering Arduino Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano&#160;&#160; (Lafvin)</td>
			<td>LAFVIN</td>
			<td>8541582500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons&#160;</td>
			<td>Awpeye</td>
			<td>Push-button</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 4</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS4 LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided foam tape</td>
			<td>SANKA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided prototyping circuit board</td>
			<td>deyue</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical solder and soldering iron</td>
			<td>LDK</td>
			<td>1002P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>03429NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad, La Jolla, CA</td>
			<td></td>
			<td>Graphing and statistical analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches</td>
			<td>SunFounder</td>
			<td>43237-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12</td>
			<td>Uxcell</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12</td>
			<td>FAS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumper wires (for Arduino Nano)</td>
			<td>ELEGOO</td>
			<td>EL-CP-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD screen</td>
			<td>JANSANE</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12</td>
			<td>Shenzhen 
			Baishichuangyou 
			Technology co.Ltd</td>
			<td>310luosditaozhuang</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36</td>
			<td>Still Awake</td>
			<td>a52400001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick disconnect terminal connectors</td>
			<td>IEUYO</td>
			<td>22010064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>46232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Shenzhen 
			Weiyapuhua 
			Technology</td>
			<td>60-026-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanical dissociation of tissues for single cell analysis using a motorized device

Die Möglichkeit, einzelne Zellen für die Analyse von Gewebeproben zu isolieren und vorzubereiten, ist für neue biomedizinische Entdeckungen und Forschungen schnell entscheidend geworden. Manuelle Protokolle für Einzelzellisolierungen sind sehr zeitaufwändig und anfällig für Benutzervariabilität. Automatisierte mechanische Protokolle sind in der Lage, die Verarbeitungszeit und die Probenvariabilität zu reduzieren, sind aber in Forschungsumgebungen mit geringeren Ressourcen nicht leicht zugänglich oder kostengünstig. Das hier beschriebene Gerät wurde für die halbautomatische Gewebedissoziation unter Verwendung kommerziell erhältlicher Materialien als kostengünstige Alternative für akademische Labore entwickelt. Anweisungen zur Herstellung, Montage und Bedienung des Gerätedesigns wurden bereitgestellt. Das Dissoziationsprotokoll erzeugt zuverlässig Einzelzellsuspensionen mit vergleichbaren Zellausbeuten und Probenviabilität wie manuelle Präparationen über mehrere Mausgewebe. Das Protokoll bietet die Möglichkeit, bis zu 12 Gewebeproben gleichzeitig pro Gerät zu verarbeiten, wodurch Studien, die große Probengrößen erfordern, leichter zu bewältigen sind. Die mitgelieferte Software ermöglicht auch die Anpassung des Geräteprotokolls, um unterschiedliche Gewebe und experimentelle Einschränkungen zu berücksichtigen.

Single-cell analysis has rapidly become crucial for new biomedical discoveries, whether for applications such as flow cytometry, identifying different cell types, single-cell sequencing, or for identifying genomic or transcriptomic variations between cells1. Performing such cell isolations from tissues of interest&#160;requires mincing dissected tissues and pushing them through a fine cell strainer to filter out connective tissue from the desired cells (Figure 1A). Isolating adherent cell types, such as dendritic cells or macrophages, or cells from particularly fibrous tissues, requires additional mechanical or enzymatic separation steps2,3,4. This process is generally done manually, making it highly time-consuming and prone to user variability when assessing cell yields and sample viability. Therefore, it is crucial to introduce customizable options for automated tissue dissociation. While some attempts have been made to design such systems, the existing options are not always readily accessible, particularly in academic labs and lower-resource settings, largely due to the cost-prohibitive nature of these devices5. Furthermore, these devices are not always customizable to the individual needs of a research group6.
Here, a tissue dissociator device was designed to automate the digestion of whole tissues or tissue pieces into single-cell suspensions with the aid of digestive enzymes and mechanical disruption. This device can be easily assembled in the lab, placed into heating or cooling chambers for temperature regulation, customized for the required number of tissues to dissociate, and programmed with the desired dissociation protocols. The broad use of this device could significantly improve the reproducibility of cell extraction protocols and provide a time-saving alternative to manual dissociation.
The design allows for the simultaneous digestion of up to 12 tissues through an automated process. The device is composed of 12 individual motors wired in parallel and powered by a standard wall plug through an AC/DC adapter with an adjustable voltage dial to control the rotation/speed of the motors. The motors turn a hex bolt that fits snugly into the top of the C-tubes. The C-tubes are held in place by downward tension on an acrylic plate that latches on either side to the top plate where the motors are secured (Figure 1B). Because the motors are wired in parallel, their speed at any given voltage should not vary much, but the load (the number of C-tubes mounted on the device) will affect speed even when the voltage is kept constant. To measure rotations per minute (rpm), a tachometer has been incorporated using a hall effect sensor and a fixed magnet on one of the motor shafts (Supplementary Figure 1). The CAD files for building motor arrays are provided in Supplementary Coding File 1. Also included is a programmable switch to reverse the direction of rotation by reversing the positive/negative charges delivered to the motors. All of these features are integrated using coded software (Arduino IDE software, see Table of Materials) on an Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Using connected buttons and an LCD panel (Supplementary Figure 2), it is possible to create and run saved and custom protocols, automatically reverse the rotational direction at specified times of a protocol, adjust speed using the voltage (Supplementary Figure 3), and display the current motor speed and time left to complete a programmed protocol (Supplementary Figure 4).
For the present study, single-cell suspensions were prepared using both mechanical-enzymatic tissue dissociation with this device and manual-enzymatic tissue dissociation to determine differences, if any, in cells recovered for downstream applications. The cell preparations were evaluated based on total cell yields per tissue and&#160;percent cell viability. Flow&#160;cytometry was used to compare potential differences in surface marker expression. Data were analyzed using graphing and statistical analysis software. Unpaired Welch t-tests were used to compare pairs of samples or groups, with sample sizes n &#62; 4 mice representing 2 replicate experiments. Detailed instructions for the fabrication and assembly of this device can be found in Supplementary File 1. Materials needed for this protocol are listed in the Table of Materials.

Autor im Rampenlicht: Fortschritte in der Nanopartikeltechnologie für die Verabreichung von Medikamenten und die Immuntherapie

Mechanische Dissoziation von Geweben für die Einzelzellanalyse mit einem motorisierten Gerät

Our lab develops nanoparticles as tools to study biological barriers and to overcome these barriers at mucosal surfaces to improve drug delivery and immunotherapy. One of the most notable developments is the COVID-19 vaccines by Pfizer, BioNTech, and Moderna that use lipid nanoparticle formulations to deliver mRNA for vaccination. There are a lot of ongoing efforts to improve immunotherapies like vaccines and cancer treatments using nanoparticles, as these formulations could improve target delivery to immune cells and reduce the systemic side effects of immunotherapies.Single cell analysis is an essential component of immunology in biomedical research, one of the most common techniques being flow cytometry. Performing such cell isolations from tissues of interest requires reliable tissue dissociation. Making laboratory research more accessible without compromising quality and accuracy can be challenging.Automating processes makes technical and labor intensive steps easier to learn and allows trainees to gain experience doing more sophisticated analyses without affecting the reliability of results. The main advantage of this protocol and the accompanying device design is its customizability and cost effectiveness. The ability to process up to 12 tissues simultaneously reduces processing times.This low cost alternative makes this technology more accessible in lower resourced research settings.

Dieses halbautomatische mechanische Protokoll kann Ergebnisse von Experimenten replizieren, in denen Zellen manuell bearbeitet wurden. Zellsuspensionen, die mit diesem Gerät und durch manuelle Dissoziation hergestellt wurden, zeigen vergleichbare Zellausbeuten und Probenviabilität in Lungen-, Nieren- und Herzgeweben von Mäusen (Abbildung 2A, B). Populationen von Immunzellen, wie T-Zellen und dendritische Zellen, wurden durch einen Unterschied im Isolationsprotokoll nicht ...

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Es wird ein allgemeines Protokoll für die kombinierte enzymatische und halbautomatische mechanische Dissoziation von Geweben zur Erzeugung von Einzelzellsuspensionen für nachgeschaltete Analysen, wie z. B. die Durchflusszytometrie, bereitgestellt. Anweisungen für die Herstellung, Montage und den Betrieb der kostengünstigen mechanischen Vorrichtung, die für dieses Protokoll entwickelt wurde, sind enthalten.

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. ...

Unser Labor entwickelt Nanopartikel als Werkzeuge zur Untersuchung biologischer Barrieren und zur Überwindung dieser Barrieren an Schleimhautoberflächen, um die Arzneimittelabgabe und Immuntherapie zu verbessern. Eine der bemerkenswertesten Entwicklungen sind die COVID-19-Impfstoffe von Pfizer, BioNTech und Moderna, die Lipid-Nanopartikel-Formulierungen verwenden, um mRNA für die Impfung zu liefern. Es gibt viele laufende Bemühungen, Immuntherapien wie Impfstoffe und Krebsbehandlungen mit Nanopartikeln zu verbessern, da diese Formulierungen die Zielabgabe an Immunzellen verbessern und die systemischen Nebenwirkungen von Immuntherapien reduzieren könnten.Die Einzelzellanalyse ist ein wesentlicher Bestandteil der Immunologie in der biomedizinischen Forschung, eine der häufigsten Techniken ist die Durchflusszytometrie. Die Durchführung solcher Zellisolierungen aus Geweben von Interesse erfordert eine zuverlässige Gewebedissoziation. Es kann eine Herausforderung sein, die Laborforschung zugänglicher zu machen, ohne Kompromisse bei Qualität und Genauigkeit einzugehen.Die Automatisierung von Prozessen erleichtert das Erlernen technischer und arbeitsintensiver Schritte und ermöglicht es den Auszubildenden, Erfahrungen mit anspruchsvolleren Analysen zu sammeln, ohne die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu beeinträchtigen. Der Hauptvorteil dieses Protokolls und des dazugehörigen Gerätedesigns ist seine Anpassbarkeit und Kosteneffizienz. Die Möglichkeit, bis zu 12 Gewebe gleichzeitig zu verarbeiten, reduziert die Verarbeitungszeiten.Diese kostengünstige Alternative macht diese Technologie in Forschungsumgebungen mit geringeren Ressourcen leichter zugänglich.

mechanical-dissociation-tissues-for-single-cell-analysis-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. Manual protocols for single-cell isolations are highly time-consuming and prone to user variability. Automated mechanical protocols are able to reduce processing time and sample variability but aren't easily accessible or cost-effective in lower-resourced research settings. The device described here was designed for semi-automated tissue dissociation using commercially available materials as a low-cost alternative for academic laboratories. Instructions to fabricate, assemble, and operate the device design have been provided. The dissociation protocol reliably produces single-cell suspensions with comparable cell yields and sample viability to manual preparations across multiple mouse tissues. The protocol provides the ability to process up to 12 tissue samples simultaneously per device, making studies requiring large sample sizes more manageable. The accompanying software also allows for customization of the device protocol to accommodate varying tissues and experimental constraints.

A general protocol for the combined enzymatic and semi-automated mechanical dissociation of tissues to generate single-cell suspensions for downstream analyses, such as flow cytometry, is provided. Instructions for the fabrication, assembly, and operation of the low-cost mechanical device developed for this protocol are included.

Forschung

Biotechnik

Semi-Automated Mechanical Dissociation of Mouse Tissues to Generate Single-Cell Suspensions

To begin, place the dissected mouse tissue in a cold cell culture medium containing 5%FBS. Using sharp dissection scissors, chop the tissue until approximately five millimeters fragments are obtained. Transfer the chopped fragments to a C-tube and add one milliliter of cell culture media.Load the C-tube onto the motorized device and fit the tube holder plate over the D-shaped tube bottoms. Latch the tension arms into the acrylic plate to secure the tubes to the motor plate. To set a custom program on the motorized device from the main menu, press the blue button to choose custom mode.In the first custom mode menu, press the green button to specify the duration of forward rotation to 30 seconds. Then press the blue button to select the on screen value. In the second custom mode menu, press the green button to specify the duration of reverse rotation to 10 seconds.Then press the blue button to select the on screen value. In the third custom mode menu, press the red button to specify the selection loops to four times. Then press the blue button to select the on screen value.Adjust the voltage control dial to 200 RPM and start the custom program. Next, add digestion enzyme in four milliliters of cold culture media containing dissected tissues. Again, load the C-tube onto the device and repeat the custom program as demonstrated previously.After the run, transfer the device with the loaded tubes to a 37 degree Celsius incubator for 45 minutes. Next, load the C-tube onto the device and set the custom program at 50 RPM with forward rotation to 270 seconds. Reverse rotation to 30 seconds and looping nine times.Add EDTA to a five millimolar final concentration to the sample. Set the custom program at 100 RPM with forward rotation to 30 seconds. Reverse rotation to 10 seconds and looping twice.Next, pass the cell suspension through a 70 micrometer cell strainer and collect the filtrate in a 50 or 15 milliliter tube. Centrifuge the collected cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees Celsius and discard the supernatant. Re-suspend the pellet in one milliliter of red blood cell lysis buffer, and incubate for one minute.Neutralize the lysis buffer with nine milliliters of cold PBS. Again, centrifuge the cells and re-suspend the pellet in the desired buffer or media. Cell suspension prepared with motorized device and manual dissociation exhibited comparable cell viability and yields across mouse lung, kidney, and heart tissues.Immune cell populations like T-cells and dendritic cells were not significantly affected by the isolation protocol. Surface marker expression also showed similar frequencies of isolated T-cells in mean fluorescence intensity for the antigen presentation marker MHC II in dendritic cells between manual and device isolation.