Name: लेखक स्पॉटलाइट: ड्रग डिलीवरी और इम्यूनोथेरेपी के लिए नैनोपार्टिकल प्रौद्योगिकी में प्रगति
Uploaded: 2023-11-10T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device at JoVE.com

फिशेल डिपार्टमेंट ऑफ बायोइंजिनियरिंग (KM), T32 GM080201 (MA), Vogel Endowed Summer Fellowship (MA), LAM Foundation (KM), और American Lung Association (KM) से फंडिंग प्राप्त हुई। लेखक संपादन में मदद के लिए मिशेल कलुज़िएन्स्की को धन्यवाद देना चाहते हैं।

इस प्रोटोकॉल UMD संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था. इन अध्ययनों के लिए 7 से 9 सप्ताह की महिला C57BL/6J चूहों के ऊतकों का उपयोग किया गया था। जानवरों को एक वाणिज्यिक स्रोत से प्र?...

एकल-सेल विश्लेषण के लिए अर्ध-स्वचालित यांत्रिक-एंजाइमेटिक ऊतक पृथक्करण

<ol>
	<li>Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+dissociation+for+single-cell+and+single-nuclei+RNA+sequencing+for+low+amounts+of+input+material.">Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material.</a> Frontiers in Zoology. 19 (1), 27 (2022).</li><li>Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+murine+hepatic+stellate+cells.">Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells.</a> Fibrosis: Methods and Protocols. , 7113-7118 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+endothelial+cells+from+juvenile+nasopharyngeal+angiofibroma.">The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).</li><li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+rna+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies.">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022 (2022).</li><li>McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tissue+dissociation+for+rapid+extraction+of+viable+cells.">Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells.</a> Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).</li><li>Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric-field+facilitated+rapid+and+efficient+dissociation+of+tissues+into+viable+single+cells.">Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10728 (2022).</li><li>Maisel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-lymphangiogenic+VEGFR-3+signaling+modulates+memory+T+cell+responses+in+allergic+airway+inflammation.">Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation.</a> Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).</li><li>Karmakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+to+determine+the+utility+of+automated+tissue+dissociator+for+flowcytometry+based+evaluation+of+hematolymphoid+tumor+tissue+biopsies.">A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies.</a> Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).</li><li>Montanari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated-mechanical+procedure+compared+to+gentle+enzymatic+tissue+dissociation+in+cell+function+studies.">Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies.</a> Biomolecules. 12 (5), 701 (2022).</li><li>Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carpal+tunnel+syndrome:+a+review+of+literature.">Carpal tunnel syndrome: a review of literature.</a> Cureus. 12 (3), e7333 (2020).</li></ol>

इस उपकरण को बाद में एकल-कोशिका विश्लेषण के लिए पूरे ऊतकों से एकल-कोशिका निलंबन प्रदान करने के लिए अनुसंधान सेटिंग में आसान विधानसभा के लिए डिज़ाइन किया गया था। सुविधाएँ, जबकि बुनियादी, अकादमिक सेटिंग्...

एकल-कोशिका विश्लेषण तेजी से नई बायोमेडिकल खोजों के लिए महत्वपूर्ण हो गया है, चाहे प्रवाह साइटोमेट्री जैसे अनुप्रयोगों के लिए, विभिन्न सेल प्रकारों की पहचान करना, एकल-कोशिका अनुक्रमण, या कोशिकाओं के बीच जीनोमिक या ट्रांसक्रिप्टोमिक विविधताओं की पहचान करनेके लिए। ब्याज के ऊतकों से इस तरह के सेल अलगाव प्रदर्शन विच्छेदित ऊतकों कीमा बनाया हुआ और उन्हें वांछित कोशिकाओं (चित्रा 1 ए) से संयोजी ऊतक बाहर फिल्टर करने के लिए एक ठीक सेल छलनी के माध्यम से धक्का की आवश्यकता है. इस तरह के वृक्ष के समान कोशिकाओं या मैक्रोफेज, या विशेष रूप से रेशेदार ऊतकों से कोशिकाओं के रूप में पक्षपाती सेल प्रकार, अलग अतिरिक्त यांत्रिक या एंजाइमी जुदाई कदम 2,3,4 की आवश्यकता है. यह प्रक्रिया आम तौर पर मैन्युअल रूप से किया जाता है, जिससे सेल पैदावार और नमूना व्यवहार्यता का आकलन करते समय यह अत्यधिक समय लेने वाली और उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता के लिए प्रवण होता है। इसलिए, स्वचालित ऊतक पृथक्करण के लिए अनुकूलन विकल्प पेश करना महत्वपूर्ण है। हालांकि इस तरह के सिस्टम को डिजाइन करने के लिए कुछ प्रयास किए गए हैं, मौजूदा विकल्प हमेशा आसानी से सुलभ नहीं होते हैं, खासकर अकादमिक प्रयोगशालाओं और कम-संसाधन सेटिंग्स में, मोटे तौर परइन उपकरणों की लागत-निषेधात्मक प्रकृति के कारण। इसके अलावा, इन उपकरणों को हमेशा एक अनुसंधान समूह6 की व्यक्तिगत जरूरतों के लिए अनुकूलन नहीं कर रहे हैं.
यहां, एक ऊतक विघटनकर्ता उपकरण को पाचन एंजाइमों और यांत्रिक व्यवधान की सहायता से पूरे ऊतकों या ऊतक के टुकड़ों के पाचन को एकल-कोशिका निलंबन में स्वचालित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। इस उपकरण को आसानी से प्रयोगशाला में इकट्ठा किया जा सकता है, तापमान विनियमन के लिए हीटिंग या शीतलन कक्षों में रखा जा सकता है, ऊतकों की आवश्यक संख्या को अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और वांछित पृथक्करण प्रोटोकॉल के साथ प्रोग्राम किया जा सकता है। इस उपकरण का व्यापक उपयोग सेल निष्कर्षण प्रोटोकॉल की प्रजनन क्षमता में काफी सुधार कर सकता है और मैनुअल पृथक्करण के लिए समय बचाने वाला विकल्प प्रदान कर सकता है।
डिजाइन एक स्वचालित प्रक्रिया के माध्यम से 12 ऊतकों तक एक साथ पाचन की अनुमति देता है। डिवाइस समानांतर में वायर्ड 12 अलग-अलग मोटर्स से बना है और मोटर्स के रोटेशन / गति को नियंत्रित करने के लिए एक समायोज्य वोल्टेज डायल के साथ एसी / डीसी एडाप्टर के माध्यम से एक मानक दीवार प्लग द्वारा संचालित है। मोटर्स एक हेक्स बोल्ट को चालू करते हैं जो सी-ट्यूबों के शीर्ष में अच्छी तरह से फिट बैठता है। सी-ट्यूब एक ऐक्रेलिक प्लेट पर नीचे की ओर तनाव से आयोजित किए जाते हैं जो दोनों तरफ शीर्ष प्लेट पर लेट जाती है जहां मोटर्स सुरक्षित होते हैं (चित्र 1बी)। क्योंकि मोटर्स समानांतर में वायर्ड होते हैं, किसी भी वोल्टेज पर उनकी गति बहुत भिन्न नहीं होनी चाहिए, लेकिन लोड (डिवाइस पर घुड़सवार सी-ट्यूबों की संख्या) वोल्टेज स्थिर रखे जाने पर भी गति को प्रभावित करेगा। प्रति मिनट (आरपीएम) रोटेशन को मापने के लिए, एक हॉल प्रभाव सेंसर और मोटर शाफ्ट (पूरक चित्रा 1) में से एक पर एक निश्चित चुंबक का उपयोग करके एक टैकोमीटर को शामिल किया गया है। मोटर सरणियों के निर्माण के लिए सीएडी फाइलें पूरक कोडिंग फ़ाइल 1 में प्रदान की जाती हैं। मोटर्स को दिए गए सकारात्मक/नकारात्मक आवेशों को उलटकर रोटेशन की दिशा को उलटने के लिए एक प्रोग्राम करने योग्य स्विच भी शामिल है। इन सभी विशेषताओं को एक Arduino नैनो (पूरक कोडिंग फ़ाइल 2) पर कोडित सॉफ़्टवेयर (Arduino IDE सॉफ़्टवेयर, सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके एकीकृत किया गया है। जुड़े बटन और एक एलसीडी पैनल (अनुपूरक चित्रा 2) का उपयोग करके, सहेजे गए और कस्टम प्रोटोकॉल बनाना और चलाना संभव है, स्वचालित रूप से प्रोटोकॉल के निर्दिष्ट समय पर घूर्णी दिशा को उलट दें, वोल्टेज (पूरक चित्रा 3) का उपयोग करके गति समायोजित करें, और वर्तमान मोटर गति प्रदर्शित करें और एक प्रोग्राम किए गए प्रोटोकॉल (अनुपूरक चित्रा 4) को पूरा करने के लिए छोड़ दिया गया समय।
वर्तमान अध्ययन के लिए, एकल सेल निलंबन इस उपकरण और मैनुअल एंजाइमी ऊतक पृथक्करण दोनों के साथ दोनों का उपयोग कर तैयार किया गया मतभेद निर्धारित करने के लिए, यदि कोई हो, बहाव अनुप्रयोगों के लिए बरामद कोशिकाओं में. सेल की तैयारी ऊतक और प्रतिशत सेल व्यवहार्यता प्रति कुल सेल पैदावार के आधार पर मूल्यांकन किया गया. फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग सतह मार्कर अभिव्यक्ति में संभावित अंतर की तुलना करने के लिए किया गया था। रेखांकन और सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण किया गया था। अयुग्मित वेल्च टी-परीक्षणों का उपयोग नमूनों या समूहों के जोड़े की तुलना करने के लिए किया गया था, नमूना आकार एन > 4 चूहों के साथ 2 प्रतिकृति प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करते थे। इस उपकरण के निर्माण और संयोजन के लिए विस्तृत निर्देश पूरक फ़ाइल 1 में पाए जा सकते हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक सामग्री सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#188; inch acrylic sheet&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Acrylic Mega Store</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#189; inch acrylic sheet 12&#34; x 12&#34;</td>
			<td>SimbaLux</td>
			<td>SL-AS13-12x12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 G stainless steel wire (for tension arms)</td>
			<td>Everbilt</td>
			<td>1000847413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 G electrical wire (stranded)</td>
			<td>Best Connections</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x 3 mm magnet&#160;&#160;</td>
			<td>SU-CRO0587</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)</td>
			<td>AEDIKO</td>
			<td>AE06233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Rated Torque: 2.2 Kg.cm 
			Reduction Ratio: 1:22 
			Rated Current: 0.1 A 
			D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24&#34; x 0.55&#34;) (D x L) 
			Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46&#34; x 0.98&#34;) (D x L) 
			Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43&#34; x 1.31&#34;) (D x L) 
			Mounting Hole Size: M3 (not included)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/C Power Adapter with variable voltage controller&#160;&#160; (5 Amps, 3-12 volts)</td>
			<td>Mo-gu</td>
			<td>J19091-2-MG-US</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer</td>
			<td>Walfront</td>
			<td>1A</td>
			<td>(power adapter for powering Arduino Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano&#160;&#160; (Lafvin)</td>
			<td>LAFVIN</td>
			<td>8541582500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons&#160;</td>
			<td>Awpeye</td>
			<td>Push-button</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 4</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS4 LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided foam tape</td>
			<td>SANKA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided prototyping circuit board</td>
			<td>deyue</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical solder and soldering iron</td>
			<td>LDK</td>
			<td>1002P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>03429NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad, La Jolla, CA</td>
			<td></td>
			<td>Graphing and statistical analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches</td>
			<td>SunFounder</td>
			<td>43237-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12</td>
			<td>Uxcell</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12</td>
			<td>FAS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumper wires (for Arduino Nano)</td>
			<td>ELEGOO</td>
			<td>EL-CP-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD screen</td>
			<td>JANSANE</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12</td>
			<td>Shenzhen 
			Baishichuangyou 
			Technology co.Ltd</td>
			<td>310luosditaozhuang</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36</td>
			<td>Still Awake</td>
			<td>a52400001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick disconnect terminal connectors</td>
			<td>IEUYO</td>
			<td>22010064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>46232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Shenzhen 
			Weiyapuhua 
			Technology</td>
			<td>60-026-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanical dissociation of tissues for single cell analysis using a motorized device

ऊतक के नमूनों के विश्लेषण के लिए एकल कोशिकाओं को अलग करने और तैयार करने में सक्षम होना तेजी से नई जैव चिकित्सा खोजों और अनुसंधान के लिए महत्वपूर्ण हो गया है। एकल सेल अलगाव के लिए मैनुअल प्रोटोकॉल अत्यधिक समय लेने वाली और उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता के लिए प्रवण हैं. स्वचालित यांत्रिक प्रोटोकॉल प्रसंस्करण समय और नमूना परिवर्तनशीलता को कम करने में सक्षम हैं, लेकिन कम-संसाधन अनुसंधान सेटिंग्स में आसानी से सुलभ या लागत प्रभावी नहीं हैं। यहाँ वर्णित डिवाइस अकादमिक प्रयोगशालाओं के लिए एक कम लागत विकल्प के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सामग्री का उपयोग कर अर्द्ध स्वचालित ऊतक पृथक्करण के लिए डिजाइन किया गया था. डिवाइस डिज़ाइन को बनाने, इकट्ठा करने और संचालित करने के निर्देश प्रदान किए गए हैं। पृथक्करण प्रोटोकॉल मज़बूती से तुलनीय सेल पैदावार और कई माउस ऊतकों में मैनुअल तैयारी के लिए नमूना व्यवहार्यता के साथ एकल सेल निलंबन पैदा करता है। प्रोटोकॉल प्रति डिवाइस एक साथ 12 ऊतक नमूनों को संसाधित करने की क्षमता प्रदान करता है, जिससे बड़े नमूना आकार की आवश्यकता वाले अध्ययन अधिक प्रबंधनीय हो जाते हैं। साथ में सॉफ्टवेयर भी अलग ऊतकों और प्रयोगात्मक बाधाओं को समायोजित करने के लिए डिवाइस प्रोटोकॉल के अनुकूलन के लिए अनुमति देता है.

Single-cell analysis has rapidly become crucial for new biomedical discoveries, whether for applications such as flow cytometry, identifying different cell types, single-cell sequencing, or for identifying genomic or transcriptomic variations between cells1. Performing such cell isolations from tissues of interest&#160;requires mincing dissected tissues and pushing them through a fine cell strainer to filter out connective tissue from the desired cells (Figure 1A). Isolating adherent cell types, such as dendritic cells or macrophages, or cells from particularly fibrous tissues, requires additional mechanical or enzymatic separation steps2,3,4. This process is generally done manually, making it highly time-consuming and prone to user variability when assessing cell yields and sample viability. Therefore, it is crucial to introduce customizable options for automated tissue dissociation. While some attempts have been made to design such systems, the existing options are not always readily accessible, particularly in academic labs and lower-resource settings, largely due to the cost-prohibitive nature of these devices5. Furthermore, these devices are not always customizable to the individual needs of a research group6.
Here, a tissue dissociator device was designed to automate the digestion of whole tissues or tissue pieces into single-cell suspensions with the aid of digestive enzymes and mechanical disruption. This device can be easily assembled in the lab, placed into heating or cooling chambers for temperature regulation, customized for the required number of tissues to dissociate, and programmed with the desired dissociation protocols. The broad use of this device could significantly improve the reproducibility of cell extraction protocols and provide a time-saving alternative to manual dissociation.
The design allows for the simultaneous digestion of up to 12 tissues through an automated process. The device is composed of 12 individual motors wired in parallel and powered by a standard wall plug through an AC/DC adapter with an adjustable voltage dial to control the rotation/speed of the motors. The motors turn a hex bolt that fits snugly into the top of the C-tubes. The C-tubes are held in place by downward tension on an acrylic plate that latches on either side to the top plate where the motors are secured (Figure 1B). Because the motors are wired in parallel, their speed at any given voltage should not vary much, but the load (the number of C-tubes mounted on the device) will affect speed even when the voltage is kept constant. To measure rotations per minute (rpm), a tachometer has been incorporated using a hall effect sensor and a fixed magnet on one of the motor shafts (Supplementary Figure 1). The CAD files for building motor arrays are provided in Supplementary Coding File 1. Also included is a programmable switch to reverse the direction of rotation by reversing the positive/negative charges delivered to the motors. All of these features are integrated using coded software (Arduino IDE software, see Table of Materials) on an Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Using connected buttons and an LCD panel (Supplementary Figure 2), it is possible to create and run saved and custom protocols, automatically reverse the rotational direction at specified times of a protocol, adjust speed using the voltage (Supplementary Figure 3), and display the current motor speed and time left to complete a programmed protocol (Supplementary Figure 4).
For the present study, single-cell suspensions were prepared using both mechanical-enzymatic tissue dissociation with this device and manual-enzymatic tissue dissociation to determine differences, if any, in cells recovered for downstream applications. The cell preparations were evaluated based on total cell yields per tissue and&#160;percent cell viability. Flow&#160;cytometry was used to compare potential differences in surface marker expression. Data were analyzed using graphing and statistical analysis software. Unpaired Welch t-tests were used to compare pairs of samples or groups, with sample sizes n &#62; 4 mice representing 2 replicate experiments. Detailed instructions for the fabrication and assembly of this device can be found in Supplementary File 1. Materials needed for this protocol are listed in the Table of Materials.

लेखक स्पॉटलाइट: ड्रग डिलीवरी और इम्यूनोथेरेपी के लिए नैनोपार्टिकल प्रौद्योगिकी में प्रगति

मोटर चालित डिवाइस का उपयोग करके एकल सेल विश्लेषण के लिए ऊतकों का यांत्रिक पृथक्करण

Our lab develops nanoparticles as tools to study biological barriers and to overcome these barriers at mucosal surfaces to improve drug delivery and immunotherapy. One of the most notable developments is the COVID-19 vaccines by Pfizer, BioNTech, and Moderna that use lipid nanoparticle formulations to deliver mRNA for vaccination. There are a lot of ongoing efforts to improve immunotherapies like vaccines and cancer treatments using nanoparticles, as these formulations could improve target delivery to immune cells and reduce the systemic side effects of immunotherapies.Single cell analysis is an essential component of immunology in biomedical research, one of the most common techniques being flow cytometry. Performing such cell isolations from tissues of interest requires reliable tissue dissociation. Making laboratory research more accessible without compromising quality and accuracy can be challenging.Automating processes makes technical and labor intensive steps easier to learn and allows trainees to gain experience doing more sophisticated analyses without affecting the reliability of results. The main advantage of this protocol and the accompanying device design is its customizability and cost effectiveness. The ability to process up to 12 tissues simultaneously reduces processing times.This low cost alternative makes this technology more accessible in lower resourced research settings.

यह अर्ध-स्वचालित यांत्रिक प्रोटोकॉल उन प्रयोगों से परिणामों को दोहरा सकता है जिनमें कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से संसाधित किया गया था। इस उपकरण का उपयोग करके और मैनुअल पृथक्करण द्वारा तैयार किए गए सेल ?...

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प्रवाह साइटोमेट्री जैसे डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एकल-सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए ऊतकों के संयुक्त एंजाइमेटिक और अर्ध-स्वचालित यांत्रिक पृथक्करण के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है। इस प्रोटोकॉल के लिए विकसित कम लागत वाले यांत्रिक उपकरण के निर्माण, असेंबली और संचालन के लिए निर्देश शामिल हैं।

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. ...

हमारी प्रयोगशाला जैविक बाधाओं का अध्ययन करने और दवा वितरण और इम्यूनोथेरेपी में सुधार के लिए म्यूकोसल सतहों पर इन बाधाओं को दूर करने के लिए उपकरण के रूप में नैनोकणों को विकसित करती है। सबसे उल्लेखनीय विकासों में से एक फाइजर, बायोएनटेक और मॉडर्ना द्वारा COVID-19 टीके हैं जो टीकाकरण के लिए mRNA देने के लिए लिपिड नैनोपार्टिकल फॉर्मूलेशन का उपयोग करते हैं। नैनोकणों का उपयोग करके टीके और कैंसर उपचार जैसे इम्यूनोथेरेपी में सुधार के लिए बहुत सारे प्रयास चल रहे हैं, क्योंकि ये फॉर्मूलेशन प्रतिरक्षा कोशिकाओं को लक्ष्य वितरण में सुधार कर सकते हैं और इम्यूनोथेरेपी के प्रणालीगत दुष्प्रभावों को कम कर सकते हैं।एकल कोशिका विश्लेषण जैव चिकित्सा अनुसंधान में इम्यूनोलॉजी का एक अनिवार्य घटक है, जो फ्लो साइटोमेट्री होने वाली सबसे आम तकनीकों में से एक है। ब्याज के ऊतकों से इस तरह के सेल अलगाव प्रदर्शन विश्वसनीय ऊतक पृथक्करण की आवश्यकता है. गुणवत्ता और सटीकता से समझौता किए बिना प्रयोगशाला अनुसंधान को अधिक सुलभ बनाना चुनौतीपूर्ण हो सकता है।स्वचालित प्रक्रियाएं तकनीकी और श्रम गहन चरणों को सीखना आसान बनाती हैं और प्रशिक्षुओं को परिणामों की विश्वसनीयता को प्रभावित किए बिना अधिक परिष्कृत विश्लेषण करने का अनुभव प्राप्त करने की अनुमति देती हैं। इस प्रोटोकॉल और साथ में डिवाइस डिजाइन का मुख्य लाभ इसकी अनुकूलन क्षमता और लागत प्रभावशीलता है। एक साथ 12 ऊतकों को संसाधित करने की क्षमता प्रसंस्करण समय को कम करती है।यह कम लागत वाला विकल्प इस तकनीक को कम संसाधन वाली अनुसंधान सेटिंग्स में अधिक सुलभ बनाता है।

mechanical-dissociation-tissues-for-single-cell-analysis-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. Manual protocols for single-cell isolations are highly time-consuming and prone to user variability. Automated mechanical protocols are able to reduce processing time and sample variability but aren't easily accessible or cost-effective in lower-resourced research settings. The device described here was designed for semi-automated tissue dissociation using commercially available materials as a low-cost alternative for academic laboratories. Instructions to fabricate, assemble, and operate the device design have been provided. The dissociation protocol reliably produces single-cell suspensions with comparable cell yields and sample viability to manual preparations across multiple mouse tissues. The protocol provides the ability to process up to 12 tissue samples simultaneously per device, making studies requiring large sample sizes more manageable. The accompanying software also allows for customization of the device protocol to accommodate varying tissues and experimental constraints.

A general protocol for the combined enzymatic and semi-automated mechanical dissociation of tissues to generate single-cell suspensions for downstream analyses, such as flow cytometry, is provided. Instructions for the fabrication, assembly, and operation of the low-cost mechanical device developed for this protocol are included.

Semi-Automated Mechanical Dissociation of Mouse Tissues to Generate Single-Cell Suspensions

To begin, place the dissected mouse tissue in a cold cell culture medium containing 5%FBS. Using sharp dissection scissors, chop the tissue until approximately five millimeters fragments are obtained. Transfer the chopped fragments to a C-tube and add one milliliter of cell culture media.Load the C-tube onto the motorized device and fit the tube holder plate over the D-shaped tube bottoms. Latch the tension arms into the acrylic plate to secure the tubes to the motor plate. To set a custom program on the motorized device from the main menu, press the blue button to choose custom mode.In the first custom mode menu, press the green button to specify the duration of forward rotation to 30 seconds. Then press the blue button to select the on screen value. In the second custom mode menu, press the green button to specify the duration of reverse rotation to 10 seconds.Then press the blue button to select the on screen value. In the third custom mode menu, press the red button to specify the selection loops to four times. Then press the blue button to select the on screen value.Adjust the voltage control dial to 200 RPM and start the custom program. Next, add digestion enzyme in four milliliters of cold culture media containing dissected tissues. Again, load the C-tube onto the device and repeat the custom program as demonstrated previously.After the run, transfer the device with the loaded tubes to a 37 degree Celsius incubator for 45 minutes. Next, load the C-tube onto the device and set the custom program at 50 RPM with forward rotation to 270 seconds. Reverse rotation to 30 seconds and looping nine times.Add EDTA to a five millimolar final concentration to the sample. Set the custom program at 100 RPM with forward rotation to 30 seconds. Reverse rotation to 10 seconds and looping twice.Next, pass the cell suspension through a 70 micrometer cell strainer and collect the filtrate in a 50 or 15 milliliter tube. Centrifuge the collected cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees Celsius and discard the supernatant. Re-suspend the pellet in one milliliter of red blood cell lysis buffer, and incubate for one minute.Neutralize the lysis buffer with nine milliliters of cold PBS. Again, centrifuge the cells and re-suspend the pellet in the desired buffer or media. Cell suspension prepared with motorized device and manual dissociation exhibited comparable cell viability and yields across mouse lung, kidney, and heart tissues.Immune cell populations like T-cells and dendritic cells were not significantly affected by the isolation protocol. Surface marker expression also showed similar frequencies of isolated T-cells in mean fluorescence intensity for the antigen presentation marker MHC II in dendritic cells between manual and device isolation.