Name: Autore in primo piano: Progressi nella tecnologia delle nanoparticelle per la somministrazione di farmaci e l'immunoterapia
Uploaded: 2023-11-10T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device at JoVE.com

I finanziamenti sono stati ricevuti dal Dipartimento di Bioingegneria di Fischell (KM), T32 GM080201 (MA), Vogel Endowed Summer Fellowship (MA), LAM Foundation (KM) e American Lung Association (KM). Gli autori desiderano ringraziare Michele Kaluzienski per l'aiuto con l'editing.

Questo protocollo è stato approvato dall'UMD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Per questi studi sono stati utilizzati tessuti di topi femmina C57BL/6J di età compresa tra 7 e 9 settimane. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).
1. Dissociazione manuale
NOTA: Questo passaggio è adattato da Maisel K. et al.7.
<ol><li>Rimuovere il tessuto sez...

Dissociazione tissutale meccanico-enzimatica semi-automatizzata per l'analisi di singole cellule

<ol>
	<li>Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+dissociation+for+single-cell+and+single-nuclei+RNA+sequencing+for+low+amounts+of+input+material.">Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material.</a> Frontiers in Zoology. 19 (1), 27 (2022).</li><li>Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+murine+hepatic+stellate+cells.">Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells.</a> Fibrosis: Methods and Protocols. , 7113-7118 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+endothelial+cells+from+juvenile+nasopharyngeal+angiofibroma.">The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).</li><li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+rna+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies.">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022 (2022).</li><li>McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tissue+dissociation+for+rapid+extraction+of+viable+cells.">Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells.</a> Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).</li><li>Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric-field+facilitated+rapid+and+efficient+dissociation+of+tissues+into+viable+single+cells.">Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10728 (2022).</li><li>Maisel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-lymphangiogenic+VEGFR-3+signaling+modulates+memory+T+cell+responses+in+allergic+airway+inflammation.">Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation.</a> Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).</li><li>Karmakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+to+determine+the+utility+of+automated+tissue+dissociator+for+flowcytometry+based+evaluation+of+hematolymphoid+tumor+tissue+biopsies.">A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies.</a> Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).</li><li>Montanari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated-mechanical+procedure+compared+to+gentle+enzymatic+tissue+dissociation+in+cell+function+studies.">Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies.</a> Biomolecules. 12 (5), 701 (2022).</li><li>Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carpal+tunnel+syndrome:+a+review+of+literature.">Carpal tunnel syndrome: a review of literature.</a> Cureus. 12 (3), e7333 (2020).</li></ol>

Questo dispositivo è stato progettato per un facile assemblaggio in ambito di ricerca per fornire sospensioni unicellulari da tessuti interi per la successiva analisi di singole cellule. Le caratteristiche, sebbene di base, sono sufficienti per soddisfare le esigenze dei ricercatori in ambito accademico e non solo. Un vantaggio chiave dell'utilizzo di questo dispositivo è il suo potenziale per migliorare la preparazione di sospensioni a singola cellula riducendo la variabilità. Inoltre, la capacità di elaborare 12+ c...

L'analisi di singole cellule è diventata rapidamente cruciale per le nuove scoperte biomediche, sia per applicazioni come la citometria a flusso, l'identificazione di diversi tipi di cellule, il sequenziamento di singole cellule o per l'identificazione di variazioni genomiche o trascrittomiche tra le cellule1. L'esecuzione di tali isolamenti cellulari dai tessuti di interesse richiede la triturazione dei tessuti sezionati e la loro spinta attraverso un filtro cellulare fine per filtrare il tessuto connettivo dalle cellule desiderate (Figura 1A). L'isolamento di tipi di cellule aderenti, come le cellule dendritiche o i macrofagi, o di cellule provenienti da tessuti particolarmente fibrosi, richiede ulteriori passaggi di separazione meccanica o enzimatica 2,3,4. Questo processo viene generalmente eseguito manualmente, il che lo rende molto dispendioso in termini di tempo e soggetto a variabilità dell'utente quando si valutano le rese cellulari e la vitalità del campione. Pertanto, è fondamentale introdurre opzioni personalizzabili per la dissociazione automatizzata dei tessuti. Sebbene siano stati fatti alcuni tentativi per progettare tali sistemi, le opzioni esistenti non sono sempre facilmente accessibili, in particolare nei laboratori accademici e in ambienti con risorse ridotte, in gran parte a causa della natura proibitiva dei costi di questi dispositivi5. Inoltre, questi dispositivi non sono sempre personalizzabili in base alle esigenze individuali di un gruppo di ricerca6.
Qui, un dispositivo di dissociazione tissutale è stato progettato per automatizzare la digestione di interi tessuti o pezzi di tessuto in sospensioni unicellulari con l'aiuto di enzimi digestivi e interruzioni meccaniche. Questo dispositivo può essere facilmente assemblato in laboratorio, collocato in camere di riscaldamento o raffreddamento per la regolazione della temperatura, personalizzato per il numero richiesto di tessuti da dissociare e programmato con i protocolli di dissociazione desiderati. L'ampio uso di questo dispositivo potrebbe migliorare significativamente la riproducibilità dei protocolli di estrazione cellulare e fornire un'alternativa che consente di risparmiare tempo alla dissociazione manuale.
Il design consente la digestione simultanea di un massimo di 12 tessuti attraverso un processo automatizzato. Il dispositivo è composto da 12 singoli motori cablati in parallelo e alimentati da una presa a muro standard tramite un adattatore AC/DC con un quadrante di tensione regolabile per controllare la rotazione/velocità dei motori. I motori ruotano un bullone esagonale che si inserisce perfettamente nella parte superiore dei tubi a C. I tubi a C sono tenuti in posizione da una tensione verso il basso su una piastra acrilica che si aggancia su entrambi i lati alla piastra superiore dove sono fissati i motori (Figura 1B). Poiché i motori sono cablati in parallelo, la loro velocità a una data tensione non dovrebbe variare molto, ma il carico (il numero di tubi a C montati sul dispositivo) influenzerà la velocità anche quando la tensione viene mantenuta costante. Per misurare le rotazioni al minuto (giri/min), è stato incorporato un tachimetro che utilizza un sensore ad effetto Hall e un magnete fisso su uno degli alberi motore (Figura 1 supplementare). I file CAD per la costruzione di array di motori sono forniti nel file di codifica supplementare 1. È incluso anche un interruttore programmabile per invertire il senso di rotazione invertendo le cariche positive/negative erogate ai motori. Tutte queste funzionalità sono integrate utilizzando un software codificato (software Arduino IDE, vedi Table of Materials) su un Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Utilizzando i pulsanti collegati e un pannello LCD (Figura supplementare 2), è possibile creare ed eseguire protocolli salvati e personalizzati, invertire automaticamente il senso di rotazione a orari specificati di un protocollo, regolare la velocità utilizzando la tensione (Figura supplementare 3) e visualizzare la velocità corrente del motore e il tempo rimanente per completare un protocollo programmato (Figura supplementare 4).
Per il presente studio, sono state preparate sospensioni a singola cellula utilizzando sia la dissociazione tissutale meccanico-enzimatica con questo dispositivo che la dissociazione tissutale manuale-enzimatica per determinare le differenze, se presenti, nelle cellule recuperate per applicazioni a valle. Le preparazioni cellulari sono state valutate in base alla resa cellulare totale per tessuto e alla percentuale di vitalità cellulare. La citometria a flusso è stata utilizzata per confrontare le differenze di potenziale nell'espressione dei marcatori di superficie. I dati sono stati analizzati utilizzando software di analisi grafica e statistica. I t-test Welch non accoppiati sono stati utilizzati per confrontare coppie di campioni o gruppi, con dimensioni del campione n > 4 topi che rappresentavano 2 esperimenti replicati. Istruzioni dettagliate per la fabbricazione e il montaggio di questo dispositivo sono disponibili nel file supplementare 1. I materiali necessari per questo protocollo sono elencati nella Tabella dei materiali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#188; inch acrylic sheet&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Acrylic Mega Store</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#189; inch acrylic sheet 12&#34; x 12&#34;</td>
			<td>SimbaLux</td>
			<td>SL-AS13-12x12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 G stainless steel wire (for tension arms)</td>
			<td>Everbilt</td>
			<td>1000847413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 G electrical wire (stranded)</td>
			<td>Best Connections</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x 3 mm magnet&#160;&#160;</td>
			<td>SU-CRO0587</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)</td>
			<td>AEDIKO</td>
			<td>AE06233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Rated Torque: 2.2 Kg.cm 
			Reduction Ratio: 1:22 
			Rated Current: 0.1 A 
			D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24&#34; x 0.55&#34;) (D x L) 
			Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46&#34; x 0.98&#34;) (D x L) 
			Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43&#34; x 1.31&#34;) (D x L) 
			Mounting Hole Size: M3 (not included)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/C Power Adapter with variable voltage controller&#160;&#160; (5 Amps, 3-12 volts)</td>
			<td>Mo-gu</td>
			<td>J19091-2-MG-US</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer</td>
			<td>Walfront</td>
			<td>1A</td>
			<td>(power adapter for powering Arduino Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano&#160;&#160; (Lafvin)</td>
			<td>LAFVIN</td>
			<td>8541582500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons&#160;</td>
			<td>Awpeye</td>
			<td>Push-button</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 4</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS4 LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided foam tape</td>
			<td>SANKA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided prototyping circuit board</td>
			<td>deyue</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical solder and soldering iron</td>
			<td>LDK</td>
			<td>1002P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>03429NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad, La Jolla, CA</td>
			<td></td>
			<td>Graphing and statistical analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches</td>
			<td>SunFounder</td>
			<td>43237-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12</td>
			<td>Uxcell</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12</td>
			<td>FAS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumper wires (for Arduino Nano)</td>
			<td>ELEGOO</td>
			<td>EL-CP-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD screen</td>
			<td>JANSANE</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12</td>
			<td>Shenzhen 
			Baishichuangyou 
			Technology co.Ltd</td>
			<td>310luosditaozhuang</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36</td>
			<td>Still Awake</td>
			<td>a52400001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick disconnect terminal connectors</td>
			<td>IEUYO</td>
			<td>22010064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>46232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Shenzhen 
			Weiyapuhua 
			Technology</td>
			<td>60-026-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanical dissociation of tissues for single cell analysis using a motorized device

Essere in grado di isolare e preparare singole cellule per l'analisi di campioni di tessuto è diventato rapidamente cruciale per le nuove scoperte e ricerche biomediche. I protocolli manuali per gli isolamenti a singola cellula sono molto dispendiosi in termini di tempo e soggetti a variabilità dell'utente. I protocolli meccanici automatizzati sono in grado di ridurre i tempi di elaborazione e la variabilità dei campioni, ma non sono facilmente accessibili o convenienti in contesti di ricerca con risorse ridotte. Il dispositivo qui descritto è stato progettato per la dissociazione semiautomatica dei tessuti utilizzando materiali disponibili in commercio come alternativa a basso costo per i laboratori accademici. Sono state fornite le istruzioni per fabbricare, assemblare e utilizzare il design del dispositivo. Il protocollo di dissociazione produce in modo affidabile sospensioni a singola cellula con rese cellulari e vitalità del campione paragonabili alle preparazioni manuali su più tessuti di topo. Il protocollo offre la possibilità di elaborare fino a 12 campioni di tessuto contemporaneamente per dispositivo, rendendo più gestibili gli studi che richiedono campioni di grandi dimensioni. Il software di accompagnamento consente inoltre di personalizzare il protocollo del dispositivo per adattarsi ai diversi tessuti e vincoli sperimentali.

Single-cell analysis has rapidly become crucial for new biomedical discoveries, whether for applications such as flow cytometry, identifying different cell types, single-cell sequencing, or for identifying genomic or transcriptomic variations between cells1. Performing such cell isolations from tissues of interest&#160;requires mincing dissected tissues and pushing them through a fine cell strainer to filter out connective tissue from the desired cells (Figure 1A). Isolating adherent cell types, such as dendritic cells or macrophages, or cells from particularly fibrous tissues, requires additional mechanical or enzymatic separation steps2,3,4. This process is generally done manually, making it highly time-consuming and prone to user variability when assessing cell yields and sample viability. Therefore, it is crucial to introduce customizable options for automated tissue dissociation. While some attempts have been made to design such systems, the existing options are not always readily accessible, particularly in academic labs and lower-resource settings, largely due to the cost-prohibitive nature of these devices5. Furthermore, these devices are not always customizable to the individual needs of a research group6.
Here, a tissue dissociator device was designed to automate the digestion of whole tissues or tissue pieces into single-cell suspensions with the aid of digestive enzymes and mechanical disruption. This device can be easily assembled in the lab, placed into heating or cooling chambers for temperature regulation, customized for the required number of tissues to dissociate, and programmed with the desired dissociation protocols. The broad use of this device could significantly improve the reproducibility of cell extraction protocols and provide a time-saving alternative to manual dissociation.
The design allows for the simultaneous digestion of up to 12 tissues through an automated process. The device is composed of 12 individual motors wired in parallel and powered by a standard wall plug through an AC/DC adapter with an adjustable voltage dial to control the rotation/speed of the motors. The motors turn a hex bolt that fits snugly into the top of the C-tubes. The C-tubes are held in place by downward tension on an acrylic plate that latches on either side to the top plate where the motors are secured (Figure 1B). Because the motors are wired in parallel, their speed at any given voltage should not vary much, but the load (the number of C-tubes mounted on the device) will affect speed even when the voltage is kept constant. To measure rotations per minute (rpm), a tachometer has been incorporated using a hall effect sensor and a fixed magnet on one of the motor shafts (Supplementary Figure 1). The CAD files for building motor arrays are provided in Supplementary Coding File 1. Also included is a programmable switch to reverse the direction of rotation by reversing the positive/negative charges delivered to the motors. All of these features are integrated using coded software (Arduino IDE software, see Table of Materials) on an Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Using connected buttons and an LCD panel (Supplementary Figure 2), it is possible to create and run saved and custom protocols, automatically reverse the rotational direction at specified times of a protocol, adjust speed using the voltage (Supplementary Figure 3), and display the current motor speed and time left to complete a programmed protocol (Supplementary Figure 4).
For the present study, single-cell suspensions were prepared using both mechanical-enzymatic tissue dissociation with this device and manual-enzymatic tissue dissociation to determine differences, if any, in cells recovered for downstream applications. The cell preparations were evaluated based on total cell yields per tissue and&#160;percent cell viability. Flow&#160;cytometry was used to compare potential differences in surface marker expression. Data were analyzed using graphing and statistical analysis software. Unpaired Welch t-tests were used to compare pairs of samples or groups, with sample sizes n &#62; 4 mice representing 2 replicate experiments. Detailed instructions for the fabrication and assembly of this device can be found in Supplementary File 1. Materials needed for this protocol are listed in the Table of Materials.

Autore in primo piano: Progressi nella tecnologia delle nanoparticelle per la somministrazione di farmaci e l'immunoterapia

Dissociazione meccanica dei tessuti per l'analisi di singole cellule mediante dispositivo motorizzato

Our lab develops nanoparticles as tools to study biological barriers and to overcome these barriers at mucosal surfaces to improve drug delivery and immunotherapy. One of the most notable developments is the COVID-19 vaccines by Pfizer, BioNTech, and Moderna that use lipid nanoparticle formulations to deliver mRNA for vaccination. There are a lot of ongoing efforts to improve immunotherapies like vaccines and cancer treatments using nanoparticles, as these formulations could improve target delivery to immune cells and reduce the systemic side effects of immunotherapies.Single cell analysis is an essential component of immunology in biomedical research, one of the most common techniques being flow cytometry. Performing such cell isolations from tissues of interest requires reliable tissue dissociation. Making laboratory research more accessible without compromising quality and accuracy can be challenging.Automating processes makes technical and labor intensive steps easier to learn and allows trainees to gain experience doing more sophisticated analyses without affecting the reliability of results. The main advantage of this protocol and the accompanying device design is its customizability and cost effectiveness. The ability to process up to 12 tissues simultaneously reduces processing times.This low cost alternative makes this technology more accessible in lower resourced research settings.

Questo protocollo meccanico semi-automatizzato è in grado di replicare i risultati di esperimenti in cui le cellule sono state elaborate manualmente. Le sospensioni cellulari preparate utilizzando questo dispositivo e mediante dissociazione manuale mostrano rese cellulari comparabili e vitalità del campione nei tessuti polmonari, renali e cardiaci del topo (Figura 2A,B). Le popolazioni di cellule immunitarie, come le cellule T e le cellule dendritiche, non sono state signi...

Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device at JoVE.com

Viene fornito un protocollo generale per la dissociazione meccanica enzimatica e semiautomatica combinata dei tessuti per generare sospensioni a singola cellula per analisi a valle, come la citometria a flusso. Sono incluse le istruzioni per la fabbricazione, l'assemblaggio e il funzionamento del dispositivo meccanico a basso costo sviluppato per questo protocollo.

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. ...

Il nostro laboratorio sviluppa nanoparticelle come strumenti per studiare le barriere biologiche e per superarle sulle superfici delle mucose per migliorare la somministrazione di farmaci e l'immunoterapia. Uno degli sviluppi più notevoli sono i vaccini COVID-19 di Pfizer, BioNTech e Moderna che utilizzano formulazioni di nanoparticelle lipidiche per fornire mRNA per la vaccinazione. Ci sono molti sforzi in corso per migliorare le immunoterapie come i vaccini e i trattamenti contro il cancro che utilizzano nanoparticelle, poiché queste formulazioni potrebbero migliorare la consegna del bersaglio alle cellule immunitarie e ridurre gli effetti collaterali sistemici delle immunoterapie.L'analisi di singole cellule è una componente essenziale dell'immunologia nella ricerca biomedica, una delle tecniche più comuni è la citometria a flusso. L'esecuzione di tali isolamenti cellulari dai tessuti di interesse richiede una dissociazione tissutale affidabile. Rendere la ricerca di laboratorio più accessibile senza compromettere la qualità e l'accuratezza può essere difficile.L'automazione dei processi semplifica l'apprendimento di passaggi tecnici e laboriosi e consente ai tirocinanti di acquisire esperienza nell'esecuzione di analisi più sofisticate senza compromettere l'affidabilità dei risultati. Il vantaggio principale di questo protocollo e del design del dispositivo che lo accompagna è la sua personalizzazione ed economicità. La possibilità di processare fino a 12 tessuti contemporaneamente riduce i tempi di lavorazione.Questa alternativa a basso costo rende questa tecnologia più accessibile in contesti di ricerca con risorse ridotte.

mechanical-dissociation-tissues-for-single-cell-analysis-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. Manual protocols for single-cell isolations are highly time-consuming and prone to user variability. Automated mechanical protocols are able to reduce processing time and sample variability but aren't easily accessible or cost-effective in lower-resourced research settings. The device described here was designed for semi-automated tissue dissociation using commercially available materials as a low-cost alternative for academic laboratories. Instructions to fabricate, assemble, and operate the device design have been provided. The dissociation protocol reliably produces single-cell suspensions with comparable cell yields and sample viability to manual preparations across multiple mouse tissues. The protocol provides the ability to process up to 12 tissue samples simultaneously per device, making studies requiring large sample sizes more manageable. The accompanying software also allows for customization of the device protocol to accommodate varying tissues and experimental constraints.

A general protocol for the combined enzymatic and semi-automated mechanical dissociation of tissues to generate single-cell suspensions for downstream analyses, such as flow cytometry, is provided. Instructions for the fabrication, assembly, and operation of the low-cost mechanical device developed for this protocol are included.

Ricerca

Bioingegneria

Semi-Automated Mechanical Dissociation of Mouse Tissues to Generate Single-Cell Suspensions

To begin, place the dissected mouse tissue in a cold cell culture medium containing 5%FBS. Using sharp dissection scissors, chop the tissue until approximately five millimeters fragments are obtained. Transfer the chopped fragments to a C-tube and add one milliliter of cell culture media.Load the C-tube onto the motorized device and fit the tube holder plate over the D-shaped tube bottoms. Latch the tension arms into the acrylic plate to secure the tubes to the motor plate. To set a custom program on the motorized device from the main menu, press the blue button to choose custom mode.In the first custom mode menu, press the green button to specify the duration of forward rotation to 30 seconds. Then press the blue button to select the on screen value. In the second custom mode menu, press the green button to specify the duration of reverse rotation to 10 seconds.Then press the blue button to select the on screen value. In the third custom mode menu, press the red button to specify the selection loops to four times. Then press the blue button to select the on screen value.Adjust the voltage control dial to 200 RPM and start the custom program. Next, add digestion enzyme in four milliliters of cold culture media containing dissected tissues. Again, load the C-tube onto the device and repeat the custom program as demonstrated previously.After the run, transfer the device with the loaded tubes to a 37 degree Celsius incubator for 45 minutes. Next, load the C-tube onto the device and set the custom program at 50 RPM with forward rotation to 270 seconds. Reverse rotation to 30 seconds and looping nine times.Add EDTA to a five millimolar final concentration to the sample. Set the custom program at 100 RPM with forward rotation to 30 seconds. Reverse rotation to 10 seconds and looping twice.Next, pass the cell suspension through a 70 micrometer cell strainer and collect the filtrate in a 50 or 15 milliliter tube. Centrifuge the collected cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees Celsius and discard the supernatant. Re-suspend the pellet in one milliliter of red blood cell lysis buffer, and incubate for one minute.Neutralize the lysis buffer with nine milliliters of cold PBS. Again, centrifuge the cells and re-suspend the pellet in the desired buffer or media. Cell suspension prepared with motorized device and manual dissociation exhibited comparable cell viability and yields across mouse lung, kidney, and heart tissues.Immune cell populations like T-cells and dendritic cells were not significantly affected by the isolation protocol. Surface marker expression also showed similar frequencies of isolated T-cells in mean fluorescence intensity for the antigen presentation marker MHC II in dendritic cells between manual and device isolation.