Name: 著者スポットライト:ドラッグデリバリーと免疫療法のためのナノ粒子技術の進歩
Uploaded: 2023-11-10T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device at JoVE.com

資金提供は、Fischell Department of Bioengineering(KM)、T32 GM080201(MA)、Vogel Endowed Summer Fellowship(MA)、LAM Foundation(KM)、およびAmerican Lung Association(KM)から受けました。著者は、編集を手伝ってくれたMichele Kaluzienskiに感謝します。

このプロトコルは、UMD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) によって承認されました。これらの研究には、7週齢から9週齢の雌のC57BL/6Jマウスの組織を使用しました。動物は市販の供給源から入手した( 資料表参照)。
1. 手動解離
注:この手順は、Maisel K. et al.7 から引用したものです。
<ol><li>解剖した組織?...

シングルセル解析のための半自動機械酵素組織解離

<ol>
	<li>Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+dissociation+for+single-cell+and+single-nuclei+RNA+sequencing+for+low+amounts+of+input+material.">Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material.</a> Frontiers in Zoology. 19 (1), 27 (2022).</li><li>Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+murine+hepatic+stellate+cells.">Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells.</a> Fibrosis: Methods and Protocols. , 7113-7118 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+endothelial+cells+from+juvenile+nasopharyngeal+angiofibroma.">The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).</li><li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+rna+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies.">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022 (2022).</li><li>McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tissue+dissociation+for+rapid+extraction+of+viable+cells.">Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells.</a> Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).</li><li>Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric-field+facilitated+rapid+and+efficient+dissociation+of+tissues+into+viable+single+cells.">Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10728 (2022).</li><li>Maisel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-lymphangiogenic+VEGFR-3+signaling+modulates+memory+T+cell+responses+in+allergic+airway+inflammation.">Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation.</a> Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).</li><li>Karmakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+to+determine+the+utility+of+automated+tissue+dissociator+for+flowcytometry+based+evaluation+of+hematolymphoid+tumor+tissue+biopsies.">A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies.</a> Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).</li><li>Montanari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated-mechanical+procedure+compared+to+gentle+enzymatic+tissue+dissociation+in+cell+function+studies.">Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies.</a> Biomolecules. 12 (5), 701 (2022).</li><li>Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carpal+tunnel+syndrome:+a+review+of+literature.">Carpal tunnel syndrome: a review of literature.</a> Cureus. 12 (3), e7333 (2020).</li></ol>

このデバイスは、研究環境で簡単に組み立てられるように設計されており、その後のシングルセル解析のために組織全体からシングルセル懸濁液を提供します。これらの機能は、基本的なものですが、学術現場やその他の研究者のニーズを満たすのに十分です。このデバイスを使用する主な利点は、ばらつきを低減することにより、単一細胞懸濁液の調製を改善できる可能性があることです?...

シングルセル解析は、フローサイトメトリー、異なる細胞タイプの同定、シングルセルシーケンシング、細胞間のゲノムやトランスクリプトーム変異の同定などのアプリケーションにおいて、新しい生物医学的発見に急速に重要になっています1。目的組織からこのような細胞単離を行うには、解剖した組織を細かく刻み、それらを微細なセルストレーナーに押し込んで、目的の細胞から結合組織をろ過する必要があります(図1A)。樹状細胞やマクロファージなどの接着細胞タイプ、または特に線維組織からの細胞を単離するには、追加の機械的または酵素的分離ステップが必要です2,3,4。このプロセスは通常、手作業で行われるため、細胞収量やサンプルの生存率を評価する際に、非常に時間がかかり、ユーザーによるばらつきが生じやすくなります。したがって、自動組織解離のためのカスタマイズ可能なオプションを導入することが重要です。このようなシステムを設計する試みはいくつか行われてきましたが、特に学術研究室やリソースの少ない環境では、主にこれらのデバイスのコストが法外な性質のために、既存のオプションに常に容易にアクセスできるとは限りません5。さらに、これらの機器は、研究グループ6の個々のニーズに合わせて常にカスタマイズできるとは限らない。
ここでは、消化酵素と機械的破壊の助けを借りて、組織全体または組織片の単一細胞懸濁液への消化を自動化するように組織解離装置が設計されました。この装置は、実験室で簡単に組み立てることができ、温度調節のために加熱室または冷却室に入れ、解離に必要な組織数に合わせてカスタマイズし、目的の解離プロトコルでプログラムすることができます。このデバイスを広く使用することで、細胞抽出プロトコルの再現性が大幅に向上し、手動解離に代わる時間節約が期待できます。
この設計により、自動化されたプロセスにより、最大12個の組織を同時に消化することができます。このデバイスは、並列に配線された12個の個別のモーターで構成され、モーターの回転/速度を制御するための調整可能な電圧ダイヤルを備えたAC/DCアダプターを介して標準の壁プラグから電力を供給されます。モーターは、Cチューブの上部にぴったりと収まる六角ボルトを回転させます。Cチューブは、モーターが固定されているトッププレートの両側にラッチするアクリルプレートに下向きの張力をかけることで所定の位置に保持されます(図1B)。モーターは並列に配線されているため、任意の電圧での速度はあまり変化しませんが、電圧が一定に保たれていても、負荷(デバイスに取り付けられたCチューブの数)が速度に影響を与えます。毎分回転数(rpm)を測定するために、ホール効果センサーとモーターシャフトの1つに固定磁石を使用してタコメーターが組み込まれています(補足図1)。モーターアレイを構築するためのCADファイルは、 補足コーディングファイル1で提供されています。また、モーターに供給される正/負の電荷を逆転させることで回転方向を反転させるプログラム可能なスイッチも含まれています。これらの機能はすべて、コード化されたソフトウェア(Arduino IDEソフトウェア、 材料表を参照)を使用して、Arduino Nano(補足コーディングファイル2)に統合されています。接続されたボタンとLCDパネル(補足図2)を使用して、保存されたプロトコルとカスタムプロトコルを作成および実行し、プロトコルの指定された時間に回転方向を自動的に反転させ、電圧を使用して速度を調整し(補足図3)、プログラムされたプロトコルを完了するための現在のモーター速度と残り時間を表示することができます(補足図4)。
本研究では、このデバイスによる機械的酵素的組織解離と手動酵素組織解離の両方を使用して単一細胞懸濁液を調製し、下流のアプリケーション用に回収された細胞に違いがある場合、その違いを決定しました。細胞調製物は、組織あたりの総細胞収量および細胞生存率に基づいて評価しました。フローサイトメトリーを使用して、表面マーカー発現の潜在的な違いを比較しました。データは、グラフ作成および統計解析ソフトウェアを使用して分析しました。対応のないウェルチの t検定 は、2つの反復実験を表す4匹のマウス>サンプルサイズnで、サンプルまたはグループのペアを比較するために使用されました。このデバイスの製造と組み立ての詳細な手順は、 補足ファイル1に記載されています。このプロトコルに必要な材料は、 材料表に記載されています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#188; inch acrylic sheet&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Acrylic Mega Store</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#189; inch acrylic sheet 12&#34; x 12&#34;</td>
			<td>SimbaLux</td>
			<td>SL-AS13-12x12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 G stainless steel wire (for tension arms)</td>
			<td>Everbilt</td>
			<td>1000847413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 G electrical wire (stranded)</td>
			<td>Best Connections</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x 3 mm magnet&#160;&#160;</td>
			<td>SU-CRO0587</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)</td>
			<td>AEDIKO</td>
			<td>AE06233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Rated Torque: 2.2 Kg.cm 
			Reduction Ratio: 1:22 
			Rated Current: 0.1 A 
			D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24&#34; x 0.55&#34;) (D x L) 
			Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46&#34; x 0.98&#34;) (D x L) 
			Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43&#34; x 1.31&#34;) (D x L) 
			Mounting Hole Size: M3 (not included)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/C Power Adapter with variable voltage controller&#160;&#160; (5 Amps, 3-12 volts)</td>
			<td>Mo-gu</td>
			<td>J19091-2-MG-US</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer</td>
			<td>Walfront</td>
			<td>1A</td>
			<td>(power adapter for powering Arduino Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano&#160;&#160; (Lafvin)</td>
			<td>LAFVIN</td>
			<td>8541582500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons&#160;</td>
			<td>Awpeye</td>
			<td>Push-button</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 4</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS4 LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided foam tape</td>
			<td>SANKA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided prototyping circuit board</td>
			<td>deyue</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical solder and soldering iron</td>
			<td>LDK</td>
			<td>1002P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>03429NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad, La Jolla, CA</td>
			<td></td>
			<td>Graphing and statistical analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches</td>
			<td>SunFounder</td>
			<td>43237-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12</td>
			<td>Uxcell</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12</td>
			<td>FAS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumper wires (for Arduino Nano)</td>
			<td>ELEGOO</td>
			<td>EL-CP-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD screen</td>
			<td>JANSANE</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12</td>
			<td>Shenzhen 
			Baishichuangyou 
			Technology co.Ltd</td>
			<td>310luosditaozhuang</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36</td>
			<td>Still Awake</td>
			<td>a52400001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick disconnect terminal connectors</td>
			<td>IEUYO</td>
			<td>22010064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>46232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Shenzhen 
			Weiyapuhua 
			Technology</td>
			<td>60-026-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanical dissociation of tissues for single cell analysis using a motorized device

組織サンプルの分析のために単一細胞を単離して調製できることは、新しい生物医学的発見や研究にとって急速に重要になっています。シングルセル単離のための手動プロトコルは、非常に時間がかかり、ユーザーによるばらつきが生じやすいです。自動化された機械的プロトコルは、処理時間とサンプルのばらつきを減らすことができますが、リソースの少ない研究環境では簡単にアクセスできず、費用対効果も高くありません。ここで説明する装置は、学術研究室向けの低コストの代替品として市販の材料を使用した半自動組織解離用に設計されました。デバイス設計を製造、組み立て、および操作するための手順が提供されています。解離プロトコルは、複数のマウス組織にわたる手動調製と同等の細胞収量とサンプル生存率を持つ単一細胞懸濁液を確実に生成します。このプロトコルは、デバイスごとに最大12個の組織サンプルを同時に処理する機能を提供し、大きなサンプルサイズを必要とする研究をより管理しやすくします。付属のソフトウェアにより、さまざまな組織や実験の制約に対応するためにデバイスプロトコルをカスタマイズすることもできます。

Single-cell analysis has rapidly become crucial for new biomedical discoveries, whether for applications such as flow cytometry, identifying different cell types, single-cell sequencing, or for identifying genomic or transcriptomic variations between cells1. Performing such cell isolations from tissues of interest&#160;requires mincing dissected tissues and pushing them through a fine cell strainer to filter out connective tissue from the desired cells (Figure 1A). Isolating adherent cell types, such as dendritic cells or macrophages, or cells from particularly fibrous tissues, requires additional mechanical or enzymatic separation steps2,3,4. This process is generally done manually, making it highly time-consuming and prone to user variability when assessing cell yields and sample viability. Therefore, it is crucial to introduce customizable options for automated tissue dissociation. While some attempts have been made to design such systems, the existing options are not always readily accessible, particularly in academic labs and lower-resource settings, largely due to the cost-prohibitive nature of these devices5. Furthermore, these devices are not always customizable to the individual needs of a research group6.
Here, a tissue dissociator device was designed to automate the digestion of whole tissues or tissue pieces into single-cell suspensions with the aid of digestive enzymes and mechanical disruption. This device can be easily assembled in the lab, placed into heating or cooling chambers for temperature regulation, customized for the required number of tissues to dissociate, and programmed with the desired dissociation protocols. The broad use of this device could significantly improve the reproducibility of cell extraction protocols and provide a time-saving alternative to manual dissociation.
The design allows for the simultaneous digestion of up to 12 tissues through an automated process. The device is composed of 12 individual motors wired in parallel and powered by a standard wall plug through an AC/DC adapter with an adjustable voltage dial to control the rotation/speed of the motors. The motors turn a hex bolt that fits snugly into the top of the C-tubes. The C-tubes are held in place by downward tension on an acrylic plate that latches on either side to the top plate where the motors are secured (Figure 1B). Because the motors are wired in parallel, their speed at any given voltage should not vary much, but the load (the number of C-tubes mounted on the device) will affect speed even when the voltage is kept constant. To measure rotations per minute (rpm), a tachometer has been incorporated using a hall effect sensor and a fixed magnet on one of the motor shafts (Supplementary Figure 1). The CAD files for building motor arrays are provided in Supplementary Coding File 1. Also included is a programmable switch to reverse the direction of rotation by reversing the positive/negative charges delivered to the motors. All of these features are integrated using coded software (Arduino IDE software, see Table of Materials) on an Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Using connected buttons and an LCD panel (Supplementary Figure 2), it is possible to create and run saved and custom protocols, automatically reverse the rotational direction at specified times of a protocol, adjust speed using the voltage (Supplementary Figure 3), and display the current motor speed and time left to complete a programmed protocol (Supplementary Figure 4).
For the present study, single-cell suspensions were prepared using both mechanical-enzymatic tissue dissociation with this device and manual-enzymatic tissue dissociation to determine differences, if any, in cells recovered for downstream applications. The cell preparations were evaluated based on total cell yields per tissue and&#160;percent cell viability. Flow&#160;cytometry was used to compare potential differences in surface marker expression. Data were analyzed using graphing and statistical analysis software. Unpaired Welch t-tests were used to compare pairs of samples or groups, with sample sizes n &#62; 4 mice representing 2 replicate experiments. Detailed instructions for the fabrication and assembly of this device can be found in Supplementary File 1. Materials needed for this protocol are listed in the Table of Materials.

著者スポットライト:ドラッグデリバリーと免疫療法のためのナノ粒子技術の進歩

電動装置を用いた単一細胞解析のための組織の機械的解離

Our lab develops nanoparticles as tools to study biological barriers and to overcome these barriers at mucosal surfaces to improve drug delivery and immunotherapy. One of the most notable developments is the COVID-19 vaccines by Pfizer, BioNTech, and Moderna that use lipid nanoparticle formulations to deliver mRNA for vaccination. There are a lot of ongoing efforts to improve immunotherapies like vaccines and cancer treatments using nanoparticles, as these formulations could improve target delivery to immune cells and reduce the systemic side effects of immunotherapies.Single cell analysis is an essential component of immunology in biomedical research, one of the most common techniques being flow cytometry. Performing such cell isolations from tissues of interest requires reliable tissue dissociation. Making laboratory research more accessible without compromising quality and accuracy can be challenging.Automating processes makes technical and labor intensive steps easier to learn and allows trainees to gain experience doing more sophisticated analyses without affecting the reliability of results. The main advantage of this protocol and the accompanying device design is its customizability and cost effectiveness. The ability to process up to 12 tissues simultaneously reduces processing times.This low cost alternative makes this technology more accessible in lower resourced research settings.

この半自動の機械的プロトコルは、細胞を手作業で処理した実験の結果を再現することができます。この装置を使用して手動解離によって調製した細胞懸濁液は、マウスの肺、腎臓、および心臓組織全体で同等の細胞収量とサンプル生存率を示します(図2A、B)。T細胞や樹状細胞などの免疫細胞の集団は、単離プロトコルの違いによって有意な影響を受けま?...

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フローサイトメトリーなどのダウンストリーム解析用の単一細胞懸濁液を生成するために、組織の酵素的および半自動機械的解離を組み合わせるための一般的なプロトコルが提供されています。このプロトコル用に開発された低コストの機械装置の製造、組み立て、および操作に関する説明が含まれています。

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. ...

私たちの研究室では、生物学的障壁を研究し、粘膜表面のこれらの障壁を克服して薬物送達と免疫療法を改善するためのツールとしてナノ粒子を開発しています。最も注目すべき開発の1つは、ファイザー、ビオンテック、モデルナによるCOVID-19ワクチンで、脂質ナノ粒子製剤を使用してワクチン接種用のmRNAを送達しています。ワクチンやナノ粒子を用いたがん治療などの免疫療法は、免疫細胞への標的送達を改善し、免疫療法の全身性副作用を軽減することができるため、これらの製剤を改善するための多くの取り組みが進行中です。シングルセル解析は、生物医学研究における免疫学の重要な要素であり、最も一般的な手法の1つがフローサイトメトリーです。目的組織からこのような細胞単離を行うには、信頼性の高い組織解離が必要です。品質と精度を損なうことなく、実験室での研究をより身近なものにすることは、困難な場合があります。プロセスを自動化することで、技術的および労働集約的なステップの習得が容易になり、受講者は結果の信頼性に影響を与えることなく、より高度な分析を行う経験を積むことができます。このプロトコルとそれに付随するデバイス設計の主な利点は、そのカスタマイズ性と費用対効果です。最大12個の組織を同時に処理できるため、処理時間が短縮されます。この低コストの代替手段により、このテクノロジーはリソースの少ない研究環境でよりアクセスしやすくなります。

mechanical-dissociation-tissues-for-single-cell-analysis-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. Manual protocols for single-cell isolations are highly time-consuming and prone to user variability. Automated mechanical protocols are able to reduce processing time and sample variability but aren't easily accessible or cost-effective in lower-resourced research settings. The device described here was designed for semi-automated tissue dissociation using commercially available materials as a low-cost alternative for academic laboratories. Instructions to fabricate, assemble, and operate the device design have been provided. The dissociation protocol reliably produces single-cell suspensions with comparable cell yields and sample viability to manual preparations across multiple mouse tissues. The protocol provides the ability to process up to 12 tissue samples simultaneously per device, making studies requiring large sample sizes more manageable. The accompanying software also allows for customization of the device protocol to accommodate varying tissues and experimental constraints.

A general protocol for the combined enzymatic and semi-automated mechanical dissociation of tissues to generate single-cell suspensions for downstream analyses, such as flow cytometry, is provided. Instructions for the fabrication, assembly, and operation of the low-cost mechanical device developed for this protocol are included.

生物工学

Semi-Automated Mechanical Dissociation of Mouse Tissues to Generate Single-Cell Suspensions

To begin, place the dissected mouse tissue in a cold cell culture medium containing 5%FBS. Using sharp dissection scissors, chop the tissue until approximately five millimeters fragments are obtained. Transfer the chopped fragments to a C-tube and add one milliliter of cell culture media.Load the C-tube onto the motorized device and fit the tube holder plate over the D-shaped tube bottoms. Latch the tension arms into the acrylic plate to secure the tubes to the motor plate. To set a custom program on the motorized device from the main menu, press the blue button to choose custom mode.In the first custom mode menu, press the green button to specify the duration of forward rotation to 30 seconds. Then press the blue button to select the on screen value. In the second custom mode menu, press the green button to specify the duration of reverse rotation to 10 seconds.Then press the blue button to select the on screen value. In the third custom mode menu, press the red button to specify the selection loops to four times. Then press the blue button to select the on screen value.Adjust the voltage control dial to 200 RPM and start the custom program. Next, add digestion enzyme in four milliliters of cold culture media containing dissected tissues. Again, load the C-tube onto the device and repeat the custom program as demonstrated previously.After the run, transfer the device with the loaded tubes to a 37 degree Celsius incubator for 45 minutes. Next, load the C-tube onto the device and set the custom program at 50 RPM with forward rotation to 270 seconds. Reverse rotation to 30 seconds and looping nine times.Add EDTA to a five millimolar final concentration to the sample. Set the custom program at 100 RPM with forward rotation to 30 seconds. Reverse rotation to 10 seconds and looping twice.Next, pass the cell suspension through a 70 micrometer cell strainer and collect the filtrate in a 50 or 15 milliliter tube. Centrifuge the collected cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees Celsius and discard the supernatant. Re-suspend the pellet in one milliliter of red blood cell lysis buffer, and incubate for one minute.Neutralize the lysis buffer with nine milliliters of cold PBS. Again, centrifuge the cells and re-suspend the pellet in the desired buffer or media. Cell suspension prepared with motorized device and manual dissociation exhibited comparable cell viability and yields across mouse lung, kidney, and heart tissues.Immune cell populations like T-cells and dendritic cells were not significantly affected by the isolation protocol. Surface marker expression also showed similar frequencies of isolated T-cells in mean fluorescence intensity for the antigen presentation marker MHC II in dendritic cells between manual and device isolation.