Name: Autor destacado: Avances en la tecnología de nanopartículas para la administración de fármacos y la inmunoterapia
Uploaded: 2023-11-10T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device at JoVE.com

Se recibieron fondos del Departamento de Bioingeniería de Fischell (KM), T32 GM080201 (MA), Vogel Endowed Summer Fellowship (MA), LAM Foundation (KM) y American Lung Association (KM). Los autores desean agradecer a Michele Kaluzienski por su ayuda con la edición.

Este protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la UMD. Para estos estudios se utilizaron tejidos de ratones hembra C57BL/6J de 7 a 9 semanas de edad. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).
1. Disociación manual
NOTA: Este paso es una adaptación de Maisel K. et al.7.
<ol><li>Extraer el tejido diseccionado y colocarlo e...

Disociación semiautomática de tejidos mecánico-enzimáticos para análisis de células individuales

<ol>
	<li>Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+dissociation+for+single-cell+and+single-nuclei+RNA+sequencing+for+low+amounts+of+input+material.">Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material.</a> Frontiers in Zoology. 19 (1), 27 (2022).</li><li>Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+murine+hepatic+stellate+cells.">Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells.</a> Fibrosis: Methods and Protocols. , 7113-7118 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+endothelial+cells+from+juvenile+nasopharyngeal+angiofibroma.">The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).</li><li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+rna+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies.">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022 (2022).</li><li>McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tissue+dissociation+for+rapid+extraction+of+viable+cells.">Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells.</a> Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).</li><li>Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric-field+facilitated+rapid+and+efficient+dissociation+of+tissues+into+viable+single+cells.">Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10728 (2022).</li><li>Maisel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-lymphangiogenic+VEGFR-3+signaling+modulates+memory+T+cell+responses+in+allergic+airway+inflammation.">Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation.</a> Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).</li><li>Karmakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+to+determine+the+utility+of+automated+tissue+dissociator+for+flowcytometry+based+evaluation+of+hematolymphoid+tumor+tissue+biopsies.">A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies.</a> Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).</li><li>Montanari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated-mechanical+procedure+compared+to+gentle+enzymatic+tissue+dissociation+in+cell+function+studies.">Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies.</a> Biomolecules. 12 (5), 701 (2022).</li><li>Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carpal+tunnel+syndrome:+a+review+of+literature.">Carpal tunnel syndrome: a review of literature.</a> Cureus. 12 (3), e7333 (2020).</li></ol>

Este dispositivo fue diseñado para un fácil ensamblaje en el entorno de investigación para proporcionar suspensiones unicelulares a partir de tejidos enteros para su posterior análisis de células individuales. Las características, aunque básicas, son suficientes para satisfacer las necesidades de los investigadores en entornos académicos y más allá. Un beneficio clave del uso de este dispositivo es su potencial para mejorar la preparación de suspensiones unicelulares al reducir la variabilidad. Además, la cap...

El análisis de una sola célula se ha convertido rápidamente en crucial para los nuevos descubrimientos biomédicos, ya sea para aplicaciones como la citometría de flujo, la identificación de diferentes tipos de células, la secuenciación de una sola célula o para la identificación de variaciones genómicas o transcriptómicasentre células. La realización de este tipo de aislamientos celulares a partir de tejidos de interés requiere picar los tejidos disecados y empujarlos a través de un fino filtro celular para filtrar el tejido conectivo de las células deseadas (Figura 1A). El aislamiento de tipos de células adherentes, como células dendríticas o macrófagos, o células de tejidos particularmente fibrosos, requiere pasos adicionales de separación mecánica o enzimática 2,3,4. Este proceso generalmente se realiza manualmente, lo que lo hace muy lento y propenso a la variabilidad del usuario al evaluar el rendimiento celular y la viabilidad de la muestra. Por lo tanto, es crucial introducir opciones personalizables para la disociación automatizada de tejidos. Si bien se han hecho algunos intentos de diseñar tales sistemas, las opciones existentes no siempre son fácilmente accesibles, particularmente en laboratorios académicos y entornos de bajos recursos, en gran parte debido a la naturaleza prohibitiva de estos dispositivos5. Además, estos dispositivos no siempre son personalizables a las necesidades individuales de un grupo de investigación6.
Aquí, se diseñó un dispositivo disociador de tejidos para automatizar la digestión de tejidos enteros o trozos de tejido en suspensiones unicelulares con la ayuda de enzimas digestivas y disrupciones mecánicas. Este dispositivo se puede ensamblar fácilmente en el laboratorio, colocar en cámaras de calentamiento o enfriamiento para regular la temperatura, personalizar para el número requerido de tejidos a disociar y programar con los protocolos de disociación deseados. El uso generalizado de este dispositivo podría mejorar significativamente la reproducibilidad de los protocolos de extracción celular y proporcionar una alternativa que ahorra tiempo a la disociación manual.
El diseño permite la digestión simultánea de hasta 12 tejidos a través de un proceso automatizado. El dispositivo está compuesto por 12 motores individuales cableados en paralelo y alimentados por un enchufe de pared estándar a través de un adaptador de CA/CC con un dial de voltaje ajustable para controlar la rotación/velocidad de los motores. Los motores giran un perno hexagonal que encaja perfectamente en la parte superior de los tubos C. Los tubos C se mantienen en su lugar mediante una tensión hacia abajo en una placa acrílica que se engancha a cada lado de la placa superior donde se aseguran los motores (Figura 1B). Debido a que los motores están conectados en paralelo, su velocidad a cualquier voltaje dado no debería variar mucho, pero la carga (la cantidad de tubos C montados en el dispositivo) afectará la velocidad incluso cuando el voltaje se mantenga constante. Para medir las rotaciones por minuto (rpm), se ha incorporado un tacómetro mediante un sensor de efecto Hall y un imán fijo en uno de los ejes del motor (Figura complementaria 1). Los archivos CAD para la construcción de matrices de motores se proporcionan en el Archivo de codificación suplementario 1. También se incluye un interruptor programable para invertir la dirección de rotación invirtiendo las cargas positivas/negativas entregadas a los motores. Todas estas características se integran mediante software codificado (software Arduino IDE, consulte la Tabla de materiales) en un Arduino Nano (Archivo de codificación suplementario 2). Usando botones conectados y un panel LCD (Figura complementaria 2), es posible crear y ejecutar protocolos guardados y personalizados, invertir automáticamente la dirección de rotación en momentos específicos de un protocolo, ajustar la velocidad usando el voltaje (Figura complementaria 3) y mostrar la velocidad actual del motor y el tiempo restante para completar un protocolo programado (Figura complementaria 4).
Para el presente estudio, se prepararon suspensiones unicelulares utilizando tanto la disociación de tejido mecánico-enzimático con este dispositivo como la disociación manual-enzimática de tejido para determinar las diferencias, si las hubiera, en las células recuperadas para aplicaciones posteriores. Las preparaciones celulares se evaluaron en función de los rendimientos celulares totales por tejido y el porcentaje de viabilidad celular. Se utilizó la citometría de flujo para comparar las posibles diferencias en la expresión de marcadores de superficie. Los datos fueron analizados mediante software de graficación y análisis estadístico. Se utilizaron pruebas t de Welch no apareadas para comparar pares de muestras o grupos, con tamaños de muestra n > 4 ratones que representaban 2 experimentos replicados. Las instrucciones detalladas para la fabricación y el montaje de este dispositivo se pueden encontrar en el Archivo Complementario 1. Los materiales necesarios para este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#188; inch acrylic sheet&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Acrylic Mega Store</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#189; inch acrylic sheet 12&#34; x 12&#34;</td>
			<td>SimbaLux</td>
			<td>SL-AS13-12x12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 G stainless steel wire (for tension arms)</td>
			<td>Everbilt</td>
			<td>1000847413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 G electrical wire (stranded)</td>
			<td>Best Connections</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x 3 mm magnet&#160;&#160;</td>
			<td>SU-CRO0587</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)</td>
			<td>AEDIKO</td>
			<td>AE06233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Rated Torque: 2.2 Kg.cm 
			Reduction Ratio: 1:22 
			Rated Current: 0.1 A 
			D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24&#34; x 0.55&#34;) (D x L) 
			Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46&#34; x 0.98&#34;) (D x L) 
			Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43&#34; x 1.31&#34;) (D x L) 
			Mounting Hole Size: M3 (not included)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/C Power Adapter with variable voltage controller&#160;&#160; (5 Amps, 3-12 volts)</td>
			<td>Mo-gu</td>
			<td>J19091-2-MG-US</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer</td>
			<td>Walfront</td>
			<td>1A</td>
			<td>(power adapter for powering Arduino Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano&#160;&#160; (Lafvin)</td>
			<td>LAFVIN</td>
			<td>8541582500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons&#160;</td>
			<td>Awpeye</td>
			<td>Push-button</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 4</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS4 LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided foam tape</td>
			<td>SANKA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided prototyping circuit board</td>
			<td>deyue</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical solder and soldering iron</td>
			<td>LDK</td>
			<td>1002P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>03429NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad, La Jolla, CA</td>
			<td></td>
			<td>Graphing and statistical analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches</td>
			<td>SunFounder</td>
			<td>43237-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12</td>
			<td>Uxcell</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12</td>
			<td>FAS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumper wires (for Arduino Nano)</td>
			<td>ELEGOO</td>
			<td>EL-CP-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD screen</td>
			<td>JANSANE</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12</td>
			<td>Shenzhen 
			Baishichuangyou 
			Technology co.Ltd</td>
			<td>310luosditaozhuang</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36</td>
			<td>Still Awake</td>
			<td>a52400001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick disconnect terminal connectors</td>
			<td>IEUYO</td>
			<td>22010064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>46232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Shenzhen 
			Weiyapuhua 
			Technology</td>
			<td>60-026-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanical dissociation of tissues for single cell analysis using a motorized device

Ser capaz de aislar y preparar células individuales para el análisis de muestras de tejido se ha convertido rápidamente en algo crucial para los nuevos descubrimientos e investigaciones biomédicas. Los protocolos manuales para el aislamiento de una sola célula consumen mucho tiempo y son propensos a la variabilidad del usuario. Los protocolos mecánicos automatizados pueden reducir el tiempo de procesamiento y la variabilidad de las muestras, pero no son fácilmente accesibles ni rentables en entornos de investigación con menos recursos. El dispositivo descrito aquí fue diseñado para la disociación semiautomatizada de tejidos utilizando materiales disponibles comercialmente como una alternativa de bajo costo para los laboratorios académicos. Se han proporcionado instrucciones para fabricar, ensamblar y operar el diseño del dispositivo. El protocolo de disociación produce de forma fiable suspensiones unicelulares con rendimientos celulares y viabilidad de muestras comparables a las preparaciones manuales en múltiples tejidos de ratón. El protocolo proporciona la capacidad de procesar hasta 12 muestras de tejido simultáneamente por dispositivo, lo que hace que los estudios que requieren grandes tamaños de muestra sean más manejables. El software que lo acompaña también permite personalizar el protocolo del dispositivo para adaptarse a los diferentes tejidos y restricciones experimentales.

Single-cell analysis has rapidly become crucial for new biomedical discoveries, whether for applications such as flow cytometry, identifying different cell types, single-cell sequencing, or for identifying genomic or transcriptomic variations between cells1. Performing such cell isolations from tissues of interest&#160;requires mincing dissected tissues and pushing them through a fine cell strainer to filter out connective tissue from the desired cells (Figure 1A). Isolating adherent cell types, such as dendritic cells or macrophages, or cells from particularly fibrous tissues, requires additional mechanical or enzymatic separation steps2,3,4. This process is generally done manually, making it highly time-consuming and prone to user variability when assessing cell yields and sample viability. Therefore, it is crucial to introduce customizable options for automated tissue dissociation. While some attempts have been made to design such systems, the existing options are not always readily accessible, particularly in academic labs and lower-resource settings, largely due to the cost-prohibitive nature of these devices5. Furthermore, these devices are not always customizable to the individual needs of a research group6.
Here, a tissue dissociator device was designed to automate the digestion of whole tissues or tissue pieces into single-cell suspensions with the aid of digestive enzymes and mechanical disruption. This device can be easily assembled in the lab, placed into heating or cooling chambers for temperature regulation, customized for the required number of tissues to dissociate, and programmed with the desired dissociation protocols. The broad use of this device could significantly improve the reproducibility of cell extraction protocols and provide a time-saving alternative to manual dissociation.
The design allows for the simultaneous digestion of up to 12 tissues through an automated process. The device is composed of 12 individual motors wired in parallel and powered by a standard wall plug through an AC/DC adapter with an adjustable voltage dial to control the rotation/speed of the motors. The motors turn a hex bolt that fits snugly into the top of the C-tubes. The C-tubes are held in place by downward tension on an acrylic plate that latches on either side to the top plate where the motors are secured (Figure 1B). Because the motors are wired in parallel, their speed at any given voltage should not vary much, but the load (the number of C-tubes mounted on the device) will affect speed even when the voltage is kept constant. To measure rotations per minute (rpm), a tachometer has been incorporated using a hall effect sensor and a fixed magnet on one of the motor shafts (Supplementary Figure 1). The CAD files for building motor arrays are provided in Supplementary Coding File 1. Also included is a programmable switch to reverse the direction of rotation by reversing the positive/negative charges delivered to the motors. All of these features are integrated using coded software (Arduino IDE software, see Table of Materials) on an Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Using connected buttons and an LCD panel (Supplementary Figure 2), it is possible to create and run saved and custom protocols, automatically reverse the rotational direction at specified times of a protocol, adjust speed using the voltage (Supplementary Figure 3), and display the current motor speed and time left to complete a programmed protocol (Supplementary Figure 4).
For the present study, single-cell suspensions were prepared using both mechanical-enzymatic tissue dissociation with this device and manual-enzymatic tissue dissociation to determine differences, if any, in cells recovered for downstream applications. The cell preparations were evaluated based on total cell yields per tissue and&#160;percent cell viability. Flow&#160;cytometry was used to compare potential differences in surface marker expression. Data were analyzed using graphing and statistical analysis software. Unpaired Welch t-tests were used to compare pairs of samples or groups, with sample sizes n &#62; 4 mice representing 2 replicate experiments. Detailed instructions for the fabrication and assembly of this device can be found in Supplementary File 1. Materials needed for this protocol are listed in the Table of Materials.

Autor destacado: Avances en la tecnología de nanopartículas para la administración de fármacos y la inmunoterapia

Disociación mecánica de tejidos para el análisis de células individuales mediante un dispositivo motorizado

Our lab develops nanoparticles as tools to study biological barriers and to overcome these barriers at mucosal surfaces to improve drug delivery and immunotherapy. One of the most notable developments is the COVID-19 vaccines by Pfizer, BioNTech, and Moderna that use lipid nanoparticle formulations to deliver mRNA for vaccination. There are a lot of ongoing efforts to improve immunotherapies like vaccines and cancer treatments using nanoparticles, as these formulations could improve target delivery to immune cells and reduce the systemic side effects of immunotherapies.Single cell analysis is an essential component of immunology in biomedical research, one of the most common techniques being flow cytometry. Performing such cell isolations from tissues of interest requires reliable tissue dissociation. Making laboratory research more accessible without compromising quality and accuracy can be challenging.Automating processes makes technical and labor intensive steps easier to learn and allows trainees to gain experience doing more sophisticated analyses without affecting the reliability of results. The main advantage of this protocol and the accompanying device design is its customizability and cost effectiveness. The ability to process up to 12 tissues simultaneously reduces processing times.This low cost alternative makes this technology more accessible in lower resourced research settings.

Este protocolo mecánico semiautomatizado puede replicar los resultados de experimentos en los que las células se procesaron manualmente. Las suspensiones celulares preparadas con este dispositivo y por disociación manual muestran rendimientos celulares comparables y viabilidad de la muestra en tejidos pulmonares, renales y cardíacos de ratón (Figura 2A, B). Las poblaciones de células inmunitarias, como las células T y las células dendríticas, no se vieron afectadas ...

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Se proporciona un protocolo general para la disociación mecánica enzimática y semiautomatizada combinada de tejidos para generar suspensiones unicelulares para análisis posteriores, como la citometría de flujo. Se incluyen instrucciones para la fabricación, montaje y operación del dispositivo mecánico de bajo costo desarrollado para este protocolo.

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. ...

Nuestro laboratorio desarrolla nanopartículas como herramientas para estudiar las barreras biológicas y superar estas barreras en las superficies mucosas para mejorar la administración de fármacos y la inmunoterapia. Uno de los desarrollos más notables son las vacunas COVID-19 de Pfizer, BioNTech y Moderna que utilizan formulaciones de nanopartículas lipídicas para administrar ARNm para la vacunación. Hay muchos esfuerzos en curso para mejorar las inmunoterapias, como las vacunas y los tratamientos contra el cáncer que utilizan nanopartículas, ya que estas formulaciones podrían mejorar la entrega de dianas a las células inmunitarias y reducir los efectos secundarios sistémicos de las inmunoterapias.El análisis de células individuales es un componente esencial de la inmunología en la investigación biomédica, siendo una de las técnicas más comunes la citometría de flujo. La realización de este tipo de aislamientos celulares a partir de tejidos de interés requiere una disociación tisular fiable. Hacer que la investigación de laboratorio sea más accesible sin comprometer la calidad y la precisión puede ser un desafío.La automatización de los procesos facilita el aprendizaje de los pasos técnicos y laboriosos y permite a los alumnos adquirir experiencia en la realización de análisis más sofisticados sin afectar a la fiabilidad de los resultados. La principal ventaja de este protocolo y del diseño del dispositivo que lo acompaña es su capacidad de personalización y rentabilidad. La capacidad de procesar hasta 12 tejidos simultáneamente reduce los tiempos de procesamiento.Esta alternativa de bajo costo hace que esta tecnología sea más accesible en entornos de investigación con menos recursos.

mechanical-dissociation-tissues-for-single-cell-analysis-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. Manual protocols for single-cell isolations are highly time-consuming and prone to user variability. Automated mechanical protocols are able to reduce processing time and sample variability but aren't easily accessible or cost-effective in lower-resourced research settings. The device described here was designed for semi-automated tissue dissociation using commercially available materials as a low-cost alternative for academic laboratories. Instructions to fabricate, assemble, and operate the device design have been provided. The dissociation protocol reliably produces single-cell suspensions with comparable cell yields and sample viability to manual preparations across multiple mouse tissues. The protocol provides the ability to process up to 12 tissue samples simultaneously per device, making studies requiring large sample sizes more manageable. The accompanying software also allows for customization of the device protocol to accommodate varying tissues and experimental constraints.

A general protocol for the combined enzymatic and semi-automated mechanical dissociation of tissues to generate single-cell suspensions for downstream analyses, such as flow cytometry, is provided. Instructions for the fabrication, assembly, and operation of the low-cost mechanical device developed for this protocol are included.

Investigación

Bioingeniería

Semi-Automated Mechanical Dissociation of Mouse Tissues to Generate Single-Cell Suspensions

To begin, place the dissected mouse tissue in a cold cell culture medium containing 5%FBS. Using sharp dissection scissors, chop the tissue until approximately five millimeters fragments are obtained. Transfer the chopped fragments to a C-tube and add one milliliter of cell culture media.Load the C-tube onto the motorized device and fit the tube holder plate over the D-shaped tube bottoms. Latch the tension arms into the acrylic plate to secure the tubes to the motor plate. To set a custom program on the motorized device from the main menu, press the blue button to choose custom mode.In the first custom mode menu, press the green button to specify the duration of forward rotation to 30 seconds. Then press the blue button to select the on screen value. In the second custom mode menu, press the green button to specify the duration of reverse rotation to 10 seconds.Then press the blue button to select the on screen value. In the third custom mode menu, press the red button to specify the selection loops to four times. Then press the blue button to select the on screen value.Adjust the voltage control dial to 200 RPM and start the custom program. Next, add digestion enzyme in four milliliters of cold culture media containing dissected tissues. Again, load the C-tube onto the device and repeat the custom program as demonstrated previously.After the run, transfer the device with the loaded tubes to a 37 degree Celsius incubator for 45 minutes. Next, load the C-tube onto the device and set the custom program at 50 RPM with forward rotation to 270 seconds. Reverse rotation to 30 seconds and looping nine times.Add EDTA to a five millimolar final concentration to the sample. Set the custom program at 100 RPM with forward rotation to 30 seconds. Reverse rotation to 10 seconds and looping twice.Next, pass the cell suspension through a 70 micrometer cell strainer and collect the filtrate in a 50 or 15 milliliter tube. Centrifuge the collected cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees Celsius and discard the supernatant. Re-suspend the pellet in one milliliter of red blood cell lysis buffer, and incubate for one minute.Neutralize the lysis buffer with nine milliliters of cold PBS. Again, centrifuge the cells and re-suspend the pellet in the desired buffer or media. Cell suspension prepared with motorized device and manual dissociation exhibited comparable cell viability and yields across mouse lung, kidney, and heart tissues.Immune cell populations like T-cells and dendritic cells were not significantly affected by the isolation protocol. Surface marker expression also showed similar frequencies of isolated T-cells in mean fluorescence intensity for the antigen presentation marker MHC II in dendritic cells between manual and device isolation.