Name: Författare i fokus: Framsteg inom nanopartikelteknik för läkemedelstillförsel och immunterapi
Uploaded: 2023-11-10T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device at JoVE.com

Finansiering erhölls från Fischell Department of Bioengineering (KM), T32 GM080201 (MA), Vogel Endowed Summer Fellowship (MA), LAM Foundation (KM) och American Lung Association (KM). Författarna vill tacka Michele Kaluzienski för hjälp med redigeringen.

Detta protokoll godkändes av UMD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Vävnader från 7 till 9 veckor gamla C57BL/6J-möss användes för dessa studier. Djuren erhölls från en kommersiell källa (se materialförteckning).
1. Manuell dissociation
OBS: Detta steg är anpassat från Maisel K. et al.7.
<ol><li>Ta bort dissekerad vävnad och placera den i kalla cellodlingsmedier med 5 % fetalt...

Halvautomatiserad mekanisk-enzymatisk vävnadsdissociation för encellsanalys

<ol>
	<li>Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+dissociation+for+single-cell+and+single-nuclei+RNA+sequencing+for+low+amounts+of+input+material.">Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material.</a> Frontiers in Zoology. 19 (1), 27 (2022).</li><li>Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+murine+hepatic+stellate+cells.">Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells.</a> Fibrosis: Methods and Protocols. , 7113-7118 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+endothelial+cells+from+juvenile+nasopharyngeal+angiofibroma.">The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).</li><li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+rna+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies.">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022 (2022).</li><li>McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tissue+dissociation+for+rapid+extraction+of+viable+cells.">Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells.</a> Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).</li><li>Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric-field+facilitated+rapid+and+efficient+dissociation+of+tissues+into+viable+single+cells.">Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10728 (2022).</li><li>Maisel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-lymphangiogenic+VEGFR-3+signaling+modulates+memory+T+cell+responses+in+allergic+airway+inflammation.">Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation.</a> Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).</li><li>Karmakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+to+determine+the+utility+of+automated+tissue+dissociator+for+flowcytometry+based+evaluation+of+hematolymphoid+tumor+tissue+biopsies.">A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies.</a> Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).</li><li>Montanari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated-mechanical+procedure+compared+to+gentle+enzymatic+tissue+dissociation+in+cell+function+studies.">Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies.</a> Biomolecules. 12 (5), 701 (2022).</li><li>Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carpal+tunnel+syndrome:+a+review+of+literature.">Carpal tunnel syndrome: a review of literature.</a> Cureus. 12 (3), e7333 (2020).</li></ol>

Denna enhet har utformats för enkel montering i forskningsmiljön för att tillhandahålla encellssuspensioner från hela vävnader för efterföljande encellsanalys. Funktionerna, även om de är grundläggande, är tillräckliga för att möta behoven hos forskare i akademiska miljöer och utanför. En viktig fördel med att använda denna enhet är dess potential att förbättra beredningen av encellssuspensioner genom att minska variabiliteten. Dessutom kan möjligheten att bearbeta 12+ prover samtidigt förbättra ...

Encellsanalys har snabbt blivit avgörande för nya biomedicinska upptäckter, oavsett om det gäller tillämpningar som flödescytometri, identifiering av olika celltyper, encellssekvensering eller för att identifiera genomiska eller transkriptomiska variationer mellan celler1. För att utföra sådana cellisoleringar från vävnader av intresse krävs att man maler dissekerade vävnader och trycker dem genom en fincellsil för att filtrera bort bindväv från de önskade cellerna (Figur 1A). Isolering av vidhäftande celltyper, t.ex. dendritiska celler eller makrofager, eller celler från särskilt fibrösa vävnader, kräver ytterligare mekaniska eller enzymatiska separationssteg 2,3,4. Denna process görs vanligtvis manuellt, vilket gör den mycket tidskrävande och benägen för användarvariabilitet vid bedömning av cellutbyten och provviabilitet. Därför är det viktigt att introducera anpassningsbara alternativ för automatiserad vävnadsdissociation. Även om vissa försök har gjorts för att utforma sådana system är de befintliga alternativen inte alltid lättillgängliga, särskilt i akademiska laboratorier och miljöer med lägre resurser, till stor del på grund av attdessa enheter är kostsamma 5. Dessutom är dessa enheter inte alltid anpassningsbara till de individuella behoven hos en forskargrupp6.
Här utformades en vävnadsdissociatoranordning för att automatisera nedbrytningen av hela vävnader eller vävnadsbitar till encellssuspensioner med hjälp av matsmältningsenzymer och mekaniska störningar. Denna enhet kan enkelt monteras i labbet, placeras i värme- eller kylkammare för temperaturreglering, anpassas för det antal vävnader som krävs för att dissociera och programmeras med önskade dissociationsprotokoll. Den breda användningen av denna enhet kan avsevärt förbättra reproducerbarheten av cellextraktionsprotokoll och ge ett tidsbesparande alternativ till manuell dissociation.
Designen möjliggör samtidig matsmältning av upp till 12 vävnader genom en automatiserad process. Enheten består av 12 individuella motorer parallellkopplade och drivs av en vanlig väggkontakt via en AC/DC-adapter med en justerbar volymtage ratt för att styra motorernas rotation/hastighet. Motorerna vrider en sexkantsbult som passar tätt in i toppen av C-rören. C-rören hålls på plats genom nedåtriktad spänning på en akrylplatta som låses på vardera sidan till toppplattan där motorerna är säkrade (Figur 1B). Eftersom motorerna är parallellkopplade bör deras hastighet vid en given spänning inte variera mycket, men belastningen (antalet C-rör monterade på enheten) kommer att påverka hastigheten även när spänningen hålls konstant. För att mäta rotationer per minut (rpm) har en varvräknare byggts in med hjälp av en halleffektsensor och en fast magnet på en av motoraxlarna (kompletterande figur 1). CAD-filerna för att bygga motormatriser finns i Supplementary Coding File 1. Dessutom ingår en programmerbar omkopplare för att vända rotationsriktningen genom att vända de positiva/negativa laddningarna som levereras till motorerna. Alla dessa funktioner är integrerade med kodad programvara (Arduino IDE-programvara, se Materialförteckning) på en Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Med hjälp av anslutna knappar och en LCD-panel (kompletterande figur 2) är det möjligt att skapa och köra sparade och anpassade protokoll, automatiskt vända rotationsriktningen vid specificerade tidpunkter för ett protokoll, justera hastigheten med hjälp av spänningen (kompletterande figur 3) och visa aktuell motorhastighet och tid som återstår för att slutföra ett programmerat protokoll (kompletterande figur 4).
För den aktuella studien framställdes encellssuspensioner med hjälp av både mekanisk-enzymatisk vävnadsdissociation med denna enhet och manuell-enzymatisk vävnadsdissociation för att bestämma skillnader, om några, i celler som återvunnits för nedströmsapplikationer. Cellpreparaten utvärderades baserat på totalt cellutbyte per vävnad och procentuell cellviabilitet. Flödescytometri användes för att jämföra potentialskillnader i ytmarköruttryck. Data analyserades med hjälp av grafer och programvara för statistisk analys. Oparade Welch t-tester användes för att jämföra par av prover eller grupper, med provstorlekar n > 4 möss som representerade 2 replikatexperiment. Detaljerade instruktioner för tillverkning och montering av denna enhet finns i Supplementary File 1. Material som behövs för detta protokoll listas i materialtabellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#188; inch acrylic sheet&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Acrylic Mega Store</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#189; inch acrylic sheet 12&#34; x 12&#34;</td>
			<td>SimbaLux</td>
			<td>SL-AS13-12x12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 G stainless steel wire (for tension arms)</td>
			<td>Everbilt</td>
			<td>1000847413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 G electrical wire (stranded)</td>
			<td>Best Connections</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x 3 mm magnet&#160;&#160;</td>
			<td>SU-CRO0587</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)</td>
			<td>AEDIKO</td>
			<td>AE06233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Rated Torque: 2.2 Kg.cm 
			Reduction Ratio: 1:22 
			Rated Current: 0.1 A 
			D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24&#34; x 0.55&#34;) (D x L) 
			Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46&#34; x 0.98&#34;) (D x L) 
			Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43&#34; x 1.31&#34;) (D x L) 
			Mounting Hole Size: M3 (not included)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/C Power Adapter with variable voltage controller&#160;&#160; (5 Amps, 3-12 volts)</td>
			<td>Mo-gu</td>
			<td>J19091-2-MG-US</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer</td>
			<td>Walfront</td>
			<td>1A</td>
			<td>(power adapter for powering Arduino Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano&#160;&#160; (Lafvin)</td>
			<td>LAFVIN</td>
			<td>8541582500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons&#160;</td>
			<td>Awpeye</td>
			<td>Push-button</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 4</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS4 LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided foam tape</td>
			<td>SANKA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided prototyping circuit board</td>
			<td>deyue</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical solder and soldering iron</td>
			<td>LDK</td>
			<td>1002P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>03429NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad, La Jolla, CA</td>
			<td></td>
			<td>Graphing and statistical analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches</td>
			<td>SunFounder</td>
			<td>43237-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12</td>
			<td>Uxcell</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12</td>
			<td>FAS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumper wires (for Arduino Nano)</td>
			<td>ELEGOO</td>
			<td>EL-CP-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD screen</td>
			<td>JANSANE</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12</td>
			<td>Shenzhen 
			Baishichuangyou 
			Technology co.Ltd</td>
			<td>310luosditaozhuang</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36</td>
			<td>Still Awake</td>
			<td>a52400001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick disconnect terminal connectors</td>
			<td>IEUYO</td>
			<td>22010064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>46232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Shenzhen 
			Weiyapuhua 
			Technology</td>
			<td>60-026-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanical dissociation of tissues for single cell analysis using a motorized device

Att kunna isolera och förbereda enstaka celler för analys av vävnadsprover har snabbt blivit avgörande för nya biomedicinska upptäckter och forskning. Manuella protokoll för encellsisoleringar är mycket tidskrävande och utsatta för användarvariationer. Automatiserade mekaniska protokoll kan minska bearbetningstiden och provvariationen, men är inte lättillgängliga eller kostnadseffektiva i forskningsmiljöer med lägre resurser. Enheten som beskrivs här designades för halvautomatisk vävnadsdissociation med kommersiellt tillgängliga material som ett lågkostnadsalternativ för akademiska laboratorier. Instruktioner för att tillverka, montera och använda enhetsdesignen har tillhandahållits. Dissociationsprotokollet producerar på ett tillförlitligt sätt encellssuspensioner med jämförbart cellutbyte och provviabilitet med manuella preparationer över flera musvävnader. Protokollet ger möjlighet att bearbeta upp till 12 vävnadsprover samtidigt per enhet, vilket gör studier som kräver stora provstorlekar mer hanterbara. Den medföljande programvaran gör det också möjligt att anpassa enhetsprotokollet för att tillgodose olika vävnader och experimentella begränsningar.

Single-cell analysis has rapidly become crucial for new biomedical discoveries, whether for applications such as flow cytometry, identifying different cell types, single-cell sequencing, or for identifying genomic or transcriptomic variations between cells1. Performing such cell isolations from tissues of interest&#160;requires mincing dissected tissues and pushing them through a fine cell strainer to filter out connective tissue from the desired cells (Figure 1A). Isolating adherent cell types, such as dendritic cells or macrophages, or cells from particularly fibrous tissues, requires additional mechanical or enzymatic separation steps2,3,4. This process is generally done manually, making it highly time-consuming and prone to user variability when assessing cell yields and sample viability. Therefore, it is crucial to introduce customizable options for automated tissue dissociation. While some attempts have been made to design such systems, the existing options are not always readily accessible, particularly in academic labs and lower-resource settings, largely due to the cost-prohibitive nature of these devices5. Furthermore, these devices are not always customizable to the individual needs of a research group6.
Here, a tissue dissociator device was designed to automate the digestion of whole tissues or tissue pieces into single-cell suspensions with the aid of digestive enzymes and mechanical disruption. This device can be easily assembled in the lab, placed into heating or cooling chambers for temperature regulation, customized for the required number of tissues to dissociate, and programmed with the desired dissociation protocols. The broad use of this device could significantly improve the reproducibility of cell extraction protocols and provide a time-saving alternative to manual dissociation.
The design allows for the simultaneous digestion of up to 12 tissues through an automated process. The device is composed of 12 individual motors wired in parallel and powered by a standard wall plug through an AC/DC adapter with an adjustable voltage dial to control the rotation/speed of the motors. The motors turn a hex bolt that fits snugly into the top of the C-tubes. The C-tubes are held in place by downward tension on an acrylic plate that latches on either side to the top plate where the motors are secured (Figure 1B). Because the motors are wired in parallel, their speed at any given voltage should not vary much, but the load (the number of C-tubes mounted on the device) will affect speed even when the voltage is kept constant. To measure rotations per minute (rpm), a tachometer has been incorporated using a hall effect sensor and a fixed magnet on one of the motor shafts (Supplementary Figure 1). The CAD files for building motor arrays are provided in Supplementary Coding File 1. Also included is a programmable switch to reverse the direction of rotation by reversing the positive/negative charges delivered to the motors. All of these features are integrated using coded software (Arduino IDE software, see Table of Materials) on an Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Using connected buttons and an LCD panel (Supplementary Figure 2), it is possible to create and run saved and custom protocols, automatically reverse the rotational direction at specified times of a protocol, adjust speed using the voltage (Supplementary Figure 3), and display the current motor speed and time left to complete a programmed protocol (Supplementary Figure 4).
For the present study, single-cell suspensions were prepared using both mechanical-enzymatic tissue dissociation with this device and manual-enzymatic tissue dissociation to determine differences, if any, in cells recovered for downstream applications. The cell preparations were evaluated based on total cell yields per tissue and&#160;percent cell viability. Flow&#160;cytometry was used to compare potential differences in surface marker expression. Data were analyzed using graphing and statistical analysis software. Unpaired Welch t-tests were used to compare pairs of samples or groups, with sample sizes n &#62; 4 mice representing 2 replicate experiments. Detailed instructions for the fabrication and assembly of this device can be found in Supplementary File 1. Materials needed for this protocol are listed in the Table of Materials.

Författare i fokus: Framsteg inom nanopartikelteknik för läkemedelstillförsel och immunterapi

Mekanisk dissociation av vävnader för encellsanalys med hjälp av en motoriserad anordning

Our lab develops nanoparticles as tools to study biological barriers and to overcome these barriers at mucosal surfaces to improve drug delivery and immunotherapy. One of the most notable developments is the COVID-19 vaccines by Pfizer, BioNTech, and Moderna that use lipid nanoparticle formulations to deliver mRNA for vaccination. There are a lot of ongoing efforts to improve immunotherapies like vaccines and cancer treatments using nanoparticles, as these formulations could improve target delivery to immune cells and reduce the systemic side effects of immunotherapies.Single cell analysis is an essential component of immunology in biomedical research, one of the most common techniques being flow cytometry. Performing such cell isolations from tissues of interest requires reliable tissue dissociation. Making laboratory research more accessible without compromising quality and accuracy can be challenging.Automating processes makes technical and labor intensive steps easier to learn and allows trainees to gain experience doing more sophisticated analyses without affecting the reliability of results. The main advantage of this protocol and the accompanying device design is its customizability and cost effectiveness. The ability to process up to 12 tissues simultaneously reduces processing times.This low cost alternative makes this technology more accessible in lower resourced research settings.

Detta halvautomatiska mekaniska protokoll kan replikera resultat från experiment där celler bearbetades manuellt. Cellsuspensioner framställda med denna anordning och genom manuell dissociation visar jämförbart cellutbyte och provviabilitet över lung-, njur- och hjärtvävnad hos möss (figur 2A,B). Populationer av immunceller, såsom T-celler och dendritiska celler, påverkades inte signifikant av en skillnad i isoleringsprotokoll (Figur 2C</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device at JoVE.com

Ett allmänt protokoll för kombinerad enzymatisk och halvautomatisk mekanisk dissociation av vävnader för att generera encellssuspensioner för nedströmsanalyser, såsom flödescytometri, tillhandahålls. Instruktioner för tillverkning, montering och drift av den billiga mekaniska anordningen som utvecklats för detta protokoll ingår.

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. ...

Vårt labb utvecklar nanopartiklar som verktyg för att studera biologiska barriärer och för att övervinna dessa barriärer vid slemhinnors ytor för att förbättra läkemedelstillförsel och immunterapi. En av de mest anmärkningsvärda utvecklingarna är covid-19-vaccinerna från Pfizer, BioNTech och Moderna som använder lipidnanopartikelformuleringar för att leverera mRNA för vaccination. Det pågår många ansträngningar för att förbättra immunterapier som vacciner och cancerbehandlingar med hjälp av nanopartiklar, eftersom dessa formuleringar kan förbättra målleveransen till immunceller och minska de systemiska biverkningarna av immunterapier.Encellsanalys är en viktig del av immunologin inom biomedicinsk forskning, en av de vanligaste teknikerna är flödescytometri. Att utföra sådana cellisoleringar från vävnader av intresse kräver tillförlitlig vävnadsdissociation. Att göra laboratorieforskning mer tillgänglig utan att kompromissa med kvalitet och noggrannhet kan vara utmanande.Automatisering av processer gör tekniska och arbetsintensiva steg lättare att lära sig och gör det möjligt för praktikanter att få erfarenhet av att göra mer sofistikerade analyser utan att påverka resultatens tillförlitlighet. Den största fördelen med detta protokoll och den medföljande enhetsdesignen är dess anpassningsbarhet och kostnadseffektivitet. Möjligheten att bearbeta upp till 12 vävnader samtidigt minskar bearbetningstiderna.Detta lågkostnadsalternativ gör denna teknik mer tillgänglig i forskningsmiljöer med lägre resurser.

mechanical-dissociation-tissues-for-single-cell-analysis-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. Manual protocols for single-cell isolations are highly time-consuming and prone to user variability. Automated mechanical protocols are able to reduce processing time and sample variability but aren't easily accessible or cost-effective in lower-resourced research settings. The device described here was designed for semi-automated tissue dissociation using commercially available materials as a low-cost alternative for academic laboratories. Instructions to fabricate, assemble, and operate the device design have been provided. The dissociation protocol reliably produces single-cell suspensions with comparable cell yields and sample viability to manual preparations across multiple mouse tissues. The protocol provides the ability to process up to 12 tissue samples simultaneously per device, making studies requiring large sample sizes more manageable. The accompanying software also allows for customization of the device protocol to accommodate varying tissues and experimental constraints.

A general protocol for the combined enzymatic and semi-automated mechanical dissociation of tissues to generate single-cell suspensions for downstream analyses, such as flow cytometry, is provided. Instructions for the fabrication, assembly, and operation of the low-cost mechanical device developed for this protocol are included.

Semi-Automated Mechanical Dissociation of Mouse Tissues to Generate Single-Cell Suspensions

To begin, place the dissected mouse tissue in a cold cell culture medium containing 5%FBS. Using sharp dissection scissors, chop the tissue until approximately five millimeters fragments are obtained. Transfer the chopped fragments to a C-tube and add one milliliter of cell culture media.Load the C-tube onto the motorized device and fit the tube holder plate over the D-shaped tube bottoms. Latch the tension arms into the acrylic plate to secure the tubes to the motor plate. To set a custom program on the motorized device from the main menu, press the blue button to choose custom mode.In the first custom mode menu, press the green button to specify the duration of forward rotation to 30 seconds. Then press the blue button to select the on screen value. In the second custom mode menu, press the green button to specify the duration of reverse rotation to 10 seconds.Then press the blue button to select the on screen value. In the third custom mode menu, press the red button to specify the selection loops to four times. Then press the blue button to select the on screen value.Adjust the voltage control dial to 200 RPM and start the custom program. Next, add digestion enzyme in four milliliters of cold culture media containing dissected tissues. Again, load the C-tube onto the device and repeat the custom program as demonstrated previously.After the run, transfer the device with the loaded tubes to a 37 degree Celsius incubator for 45 minutes. Next, load the C-tube onto the device and set the custom program at 50 RPM with forward rotation to 270 seconds. Reverse rotation to 30 seconds and looping nine times.Add EDTA to a five millimolar final concentration to the sample. Set the custom program at 100 RPM with forward rotation to 30 seconds. Reverse rotation to 10 seconds and looping twice.Next, pass the cell suspension through a 70 micrometer cell strainer and collect the filtrate in a 50 or 15 milliliter tube. Centrifuge the collected cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees Celsius and discard the supernatant. Re-suspend the pellet in one milliliter of red blood cell lysis buffer, and incubate for one minute.Neutralize the lysis buffer with nine milliliters of cold PBS. Again, centrifuge the cells and re-suspend the pellet in the desired buffer or media. Cell suspension prepared with motorized device and manual dissociation exhibited comparable cell viability and yields across mouse lung, kidney, and heart tissues.Immune cell populations like T-cells and dendritic cells were not significantly affected by the isolation protocol. Surface marker expression also showed similar frequencies of isolated T-cells in mean fluorescence intensity for the antigen presentation marker MHC II in dendritic cells between manual and device isolation.