Name: Yazar Spotlight: İlaç Dağıtımı ve İmmünoterapi için Nanopartikül Teknolojisindeki Gelişmeler
Uploaded: 2023-11-10T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device at JoVE.com

Fischell Biyomühendislik Bölümü (KM), T32 GM080201 (MA), Vogel Endowed Summer Fellowship (MA), LAM Vakfı (KM) ve Amerikan Akciğer Derneği'nden (KM) fon alındı. Yazarlar, düzenleme konusundaki yardımları için Michele Kaluzienski'ye teşekkür etmek istiyor.

Bu protokol UMD Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmalar için 7 ila 9 haftalık dişi C57BL / 6J farelerinden alınan dokular kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz.
1. Manuel ayrışma
NOT: Bu adım Maisel K. ve ark.7'den uyarlanmıştır.
<ol><li>Diseke edilmiş dokuyu çıkarın ve% 5 fetal sığır serumu (FBS) ile s...

Tek hücreli analiz için yarı otomatik mekanik-enzimatik doku ayrışması

<ol>
	<li>Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+dissociation+for+single-cell+and+single-nuclei+RNA+sequencing+for+low+amounts+of+input+material.">Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material.</a> Frontiers in Zoology. 19 (1), 27 (2022).</li><li>Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R., Ritti&#233;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+murine+hepatic+stellate+cells.">Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells.</a> Fibrosis: Methods and Protocols. , 7113-7118 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+and+characterization+of+endothelial+cells+from+juvenile+nasopharyngeal+angiofibroma.">The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).</li><li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+rna+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies.">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022 (2022).</li><li>McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tissue+dissociation+for+rapid+extraction+of+viable+cells.">Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells.</a> Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).</li><li>Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric-field+facilitated+rapid+and+efficient+dissociation+of+tissues+into+viable+single+cells.">Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10728 (2022).</li><li>Maisel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-lymphangiogenic+VEGFR-3+signaling+modulates+memory+T+cell+responses+in+allergic+airway+inflammation.">Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation.</a> Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).</li><li>Karmakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+to+determine+the+utility+of+automated+tissue+dissociator+for+flowcytometry+based+evaluation+of+hematolymphoid+tumor+tissue+biopsies.">A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies.</a> Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).</li><li>Montanari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated-mechanical+procedure+compared+to+gentle+enzymatic+tissue+dissociation+in+cell+function+studies.">Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies.</a> Biomolecules. 12 (5), 701 (2022).</li><li>Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carpal+tunnel+syndrome:+a+review+of+literature.">Carpal tunnel syndrome: a review of literature.</a> Cureus. 12 (3), e7333 (2020).</li></ol>

Bu cihaz, sonraki tek hücreli analiz için tüm dokulardan tek hücreli süspansiyonlar sağlamak üzere araştırma ortamında kolay montaj için tasarlanmıştır. Özellikler, temel olmakla birlikte, akademik ortamlarda ve ötesinde araştırmacıların ihtiyaçlarını karşılamak için yeterlidir. Bu cihazı kullanmanın önemli bir yararı, değişkenliği azaltarak tek hücreli süspansiyonların hazırlanmasını iyileştirme potansiyelidir. Ek olarak, 12+ numuneyi aynı anda işleme yeteneği, numuneden numune...

Tek hücreli analiz, akış sitometrisi, farklı hücre tiplerinin tanımlanması, tek hücre dizilimi veya hücreler arasındaki genomik veya transkriptomik varyasyonların tanımlanması gibi uygulamalar için yeni biyomedikal keşifler için hızla önemli hale gelmiştir1. İlgilenilen dokulardan bu tür hücre izolasyonlarının gerçekleştirilmesi, disseke edilmiş dokuların kıyılmasını ve istenen hücrelerden bağ dokusunu filtrelemek için ince bir hücre süzgecinden itilmesini gerektirir (Şekil 1A). Dendritik hücreler veya makrofajlar veya özellikle fibröz dokulardan hücreler gibi yapışık hücre tiplerinin izole edilmesi, ek mekanik veya enzimatik ayırma adımları gerektirir 2,3,4. Bu işlem genellikle manuel olarak yapılır, bu da hücre verimlerini ve numune canlılığını değerlendirirken oldukça zaman alıcı ve kullanıcı değişkenliğine eğilimli hale getirir. Bu nedenle, otomatik doku ayrışması için özelleştirilebilir seçenekler sunmak çok önemlidir. Bu tür sistemleri tasarlamak için bazı girişimlerde bulunulmuş olsa da, büyük ölçüde bu cihazların maliyet engelleyici doğası nedeniyle, özellikle akademik laboratuvarlarda ve daha düşük kaynak ortamlarında mevcut seçeneklere her zaman kolayca erişilememektedir5. Ayrıca, bu cihazlar her zaman bir araştırma grubunun bireysel ihtiyaçlarına göre özelleştirilemez6.
Burada, sindirim enzimleri ve mekanik bozulma yardımıyla tüm dokuların veya doku parçalarının tek hücreli süspansiyonlara sindirimini otomatikleştirmek için bir doku ayrıştırıcı cihaz tasarlandı. Bu cihaz laboratuvarda kolayca monte edilebilir, sıcaklık regülasyonu için ısıtma veya soğutma odalarına yerleştirilebilir, gerekli sayıda dokunun ayrışması için özelleştirilebilir ve istenen ayrışma protokolleri ile programlanabilir. Bu cihazın geniş kullanımı, hücre ekstraksiyon protokollerinin tekrarlanabilirliğini önemli ölçüde artırabilir ve manuel ayrışmaya zaman kazandıran bir alternatif sağlayabilir.
Tasarım, otomatik bir işlemle 12 dokuya kadar aynı anda sindirime izin verir. Cihaz, paralel olarak bağlanmış ve motorların dönüşünü/hızını kontrol etmek için ayarlanabilir voltaj kadranlı bir AC/DC adaptör aracılığıyla standart bir duvar prizi ile çalışan 12 ayrı motordan oluşur. Motorlar, C-boruların üst kısmına sıkıca oturan altıgen bir cıvatayı döndürür. C-tüpleri, motorların sabitlendiği üst plakaya her iki taraftan kilitlenen akrilik bir plaka üzerinde aşağı doğru gerilimle yerinde tutulur (Şekil 1B). Motorlar paralel olarak bağlandığından, herhangi bir voltajdaki hızları çok fazla değişmemelidir, ancak voltaj sabit tutulduğunda bile yük (cihaza monte edilen C-tüplerinin sayısı) hızı etkileyecektir. Dakikadaki dönüşleri (rpm) ölçmek için, bir hall etkisi sensörü ve motor millerinden birine sabit bir mıknatıs kullanılarak bir takometre dahil edilmiştir (Ek Şekil 1). Motor dizileri oluşturmak için CAD dosyaları Ek Kodlama Dosyası 1'de sağlanır. Ayrıca, motorlara iletilen pozitif/negatif yükleri tersine çevirerek dönüş yönünü tersine çevirmek için programlanabilir bir anahtar da dahildir. Tüm bu özellikler, bir Arduino Nano (Ek Kodlama Dosyası 2) üzerinde kodlanmış yazılım (Arduino IDE yazılımı, Malzeme Tablosuna bakın) kullanılarak entegre edilmiştir. Bağlı düğmeleri ve bir LCD paneli (Ek Şekil 2) kullanarak, kaydedilmiş ve özel protokoller oluşturmak ve çalıştırmak, bir protokolün belirli zamanlarında dönüş yönünü otomatik olarak tersine çevirmek, voltajı kullanarak hızı ayarlamak (Ek Şekil 3) ve programlanmış bir protokolü tamamlamak için mevcut motor hızını ve kalan süreyi görüntülemek mümkündür (Ek Şekil 4).
Bu çalışma için, hem bu cihazla mekanik-enzimatik doku ayrışması hem de manuel-enzimatik doku ayrışması kullanılarak, aşağı akış uygulamaları için geri kazanılan hücrelerdeki farklılıkları belirlemek için tek hücreli süspansiyonlar hazırlandı. Hücre preparatları, doku başına toplam hücre verimine ve hücre canlılığı yüzdesine göre değerlendirildi. Yüzey marker ekspresyonundaki potansiyel farklılıkları karşılaştırmak için akış sitometrisi kullanıldı. Veriler grafik ve istatistiksel analiz programları kullanılarak analiz edilmiştir. Örneklem veya grup çiftlerini karşılaştırmak için eşlenmemiş Welch t-testleri kullanıldı ve örneklem büyüklükleri n > 4 fareyi temsil eden 2 tekrarlanan deney kullanıldı. Bu cihazın imalatı ve montajı için ayrıntılı talimatlar Ek Dosya 1'de bulunabilir. Bu protokol için gerekli malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#188; inch acrylic sheet&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Acrylic Mega Store</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#189; inch acrylic sheet 12&#34; x 12&#34;</td>
			<td>SimbaLux</td>
			<td>SL-AS13-12x12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 G stainless steel wire (for tension arms)</td>
			<td>Everbilt</td>
			<td>1000847413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 G electrical wire (stranded)</td>
			<td>Best Connections</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 x 3 mm magnet&#160;&#160;</td>
			<td>SU-CRO0587</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-channel relay board (to reverse polarity of current to motors)</td>
			<td>AEDIKO</td>
			<td>AE06233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 mm Diameter DC Motors (12 V, 200 rpm) x 12</td>
			<td>Greartisan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Rated Torque: 2.2 Kg.cm 
			Reduction Ratio: 1:22 
			Rated Current: 0.1 A 
			D Shaped Output Shaft Size: 6 x 14mm (0.24&#34; x 0.55&#34;) (D x L) 
			Gearbox Size: 37 x 25 mm (1.46&#34; x 0.98&#34;) (D x L) 
			Motor Size: 36.2 x 33.3 mm (1.43&#34; x 1.31&#34;) (D x L) 
			Mounting Hole Size: M3 (not included)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/C Power Adapter with variable voltage controller&#160;&#160; (5 Amps, 3-12 volts)</td>
			<td>Mo-gu</td>
			<td>J19091-2-MG-US</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC-DC 5 V 1 A Precision buck converter step down transformer</td>
			<td>Walfront</td>
			<td>1A</td>
			<td>(power adapter for powering Arduino Nano)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano&#160;&#160; (Lafvin)</td>
			<td>LAFVIN</td>
			<td>8541582500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buttons&#160;</td>
			<td>Awpeye</td>
			<td>Push-button</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL6/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase 4</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS4 LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sided foam tape</td>
			<td>SANKA</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided prototyping circuit board</td>
			<td>deyue</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>E7889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical solder and soldering iron</td>
			<td>LDK</td>
			<td>1002P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>03429NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad, La Jolla, CA</td>
			<td></td>
			<td>Graphing and statistical analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hall effect sensor Dimensions : 0.79 x 0.79x 0.39 inches</td>
			<td>SunFounder</td>
			<td>43237-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex Coupler 6 mm Bore Motor Brass x 2 x 12</td>
			<td>Uxcell</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hex head bolts (M4-.70 X 12 Hex Head Cap Screw) x 12</td>
			<td>FAS</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jumper wires (for Arduino Nano)</td>
			<td>ELEGOO</td>
			<td>EL-CP-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD screen</td>
			<td>JANSANE</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Hex Socket Head Cap Screws x 12</td>
			<td>Shenzhen 
			Baishichuangyou 
			Technology co.Ltd</td>
			<td>310luosditaozhuang</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 Stainless SteelMachine screws Flat Head Hex Socket Cap Screws (30 mm) x 36</td>
			<td>Still Awake</td>
			<td>a52400001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick disconnect terminal connectors</td>
			<td>IEUYO</td>
			<td>22010064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer (10x)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>46232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terminal adapter shield Expansion board for Arduino Nano&#160; 12&#34; x 24&#34;</td>
			<td>Shenzhen 
			Weiyapuhua 
			Technology</td>
			<td>60-026-3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanical dissociation of tissues for single cell analysis using a motorized device

Doku örneklerinin analizi için tek hücreleri izole edebilmek ve hazırlayabilmek, yeni biyomedikal keşifler ve araştırmalar için hızla önemli hale geldi. Tek hücreli izolasyonlar için manuel protokoller oldukça zaman alıcıdır ve kullanıcı değişkenliğine eğilimlidir. Otomatik mekanik protokoller, işlem süresini ve numune değişkenliğini azaltabilir, ancak daha düşük kaynaklı araştırma ortamlarında kolayca erişilebilir veya uygun maliyetli değildir. Burada açıklanan cihaz, akademik laboratuvarlar için düşük maliyetli bir alternatif olarak ticari olarak temin edilebilen malzemeler kullanılarak yarı otomatik doku ayrışması için tasarlanmıştır. Cihaz tasarımının imalatı, montajı ve çalıştırılması için talimatlar sağlanmıştır. Ayrışma protokolü, birden fazla fare dokusunda manuel preparatlarla karşılaştırılabilir hücre verimleri ve numune canlılığı ile güvenilir bir şekilde tek hücreli süspansiyonlar üretir. Protokol, cihaz başına aynı anda 12 adede kadar doku örneğini işleme yeteneği sağlayarak büyük örnek boyutları gerektiren çalışmaları daha yönetilebilir hale getirir. Eşlik eden yazılım ayrıca, değişen dokulara ve deneysel kısıtlamalara uyum sağlamak için cihaz protokolünün özelleştirilmesine de izin verir.

Single-cell analysis has rapidly become crucial for new biomedical discoveries, whether for applications such as flow cytometry, identifying different cell types, single-cell sequencing, or for identifying genomic or transcriptomic variations between cells1. Performing such cell isolations from tissues of interest&#160;requires mincing dissected tissues and pushing them through a fine cell strainer to filter out connective tissue from the desired cells (Figure 1A). Isolating adherent cell types, such as dendritic cells or macrophages, or cells from particularly fibrous tissues, requires additional mechanical or enzymatic separation steps2,3,4. This process is generally done manually, making it highly time-consuming and prone to user variability when assessing cell yields and sample viability. Therefore, it is crucial to introduce customizable options for automated tissue dissociation. While some attempts have been made to design such systems, the existing options are not always readily accessible, particularly in academic labs and lower-resource settings, largely due to the cost-prohibitive nature of these devices5. Furthermore, these devices are not always customizable to the individual needs of a research group6.
Here, a tissue dissociator device was designed to automate the digestion of whole tissues or tissue pieces into single-cell suspensions with the aid of digestive enzymes and mechanical disruption. This device can be easily assembled in the lab, placed into heating or cooling chambers for temperature regulation, customized for the required number of tissues to dissociate, and programmed with the desired dissociation protocols. The broad use of this device could significantly improve the reproducibility of cell extraction protocols and provide a time-saving alternative to manual dissociation.
The design allows for the simultaneous digestion of up to 12 tissues through an automated process. The device is composed of 12 individual motors wired in parallel and powered by a standard wall plug through an AC/DC adapter with an adjustable voltage dial to control the rotation/speed of the motors. The motors turn a hex bolt that fits snugly into the top of the C-tubes. The C-tubes are held in place by downward tension on an acrylic plate that latches on either side to the top plate where the motors are secured (Figure 1B). Because the motors are wired in parallel, their speed at any given voltage should not vary much, but the load (the number of C-tubes mounted on the device) will affect speed even when the voltage is kept constant. To measure rotations per minute (rpm), a tachometer has been incorporated using a hall effect sensor and a fixed magnet on one of the motor shafts (Supplementary Figure 1). The CAD files for building motor arrays are provided in Supplementary Coding File 1. Also included is a programmable switch to reverse the direction of rotation by reversing the positive/negative charges delivered to the motors. All of these features are integrated using coded software (Arduino IDE software, see Table of Materials) on an Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Using connected buttons and an LCD panel (Supplementary Figure 2), it is possible to create and run saved and custom protocols, automatically reverse the rotational direction at specified times of a protocol, adjust speed using the voltage (Supplementary Figure 3), and display the current motor speed and time left to complete a programmed protocol (Supplementary Figure 4).
For the present study, single-cell suspensions were prepared using both mechanical-enzymatic tissue dissociation with this device and manual-enzymatic tissue dissociation to determine differences, if any, in cells recovered for downstream applications. The cell preparations were evaluated based on total cell yields per tissue and&#160;percent cell viability. Flow&#160;cytometry was used to compare potential differences in surface marker expression. Data were analyzed using graphing and statistical analysis software. Unpaired Welch t-tests were used to compare pairs of samples or groups, with sample sizes n &#62; 4 mice representing 2 replicate experiments. Detailed instructions for the fabrication and assembly of this device can be found in Supplementary File 1. Materials needed for this protocol are listed in the Table of Materials.

Yazar Spotlight: İlaç Dağıtımı ve İmmünoterapi için Nanopartikül Teknolojisindeki Gelişmeler

Motorlu bir cihaz kullanarak tek hücre analizi için dokuların mekanik ayrışması

Our lab develops nanoparticles as tools to study biological barriers and to overcome these barriers at mucosal surfaces to improve drug delivery and immunotherapy. One of the most notable developments is the COVID-19 vaccines by Pfizer, BioNTech, and Moderna that use lipid nanoparticle formulations to deliver mRNA for vaccination. There are a lot of ongoing efforts to improve immunotherapies like vaccines and cancer treatments using nanoparticles, as these formulations could improve target delivery to immune cells and reduce the systemic side effects of immunotherapies.Single cell analysis is an essential component of immunology in biomedical research, one of the most common techniques being flow cytometry. Performing such cell isolations from tissues of interest requires reliable tissue dissociation. Making laboratory research more accessible without compromising quality and accuracy can be challenging.Automating processes makes technical and labor intensive steps easier to learn and allows trainees to gain experience doing more sophisticated analyses without affecting the reliability of results. The main advantage of this protocol and the accompanying device design is its customizability and cost effectiveness. The ability to process up to 12 tissues simultaneously reduces processing times.This low cost alternative makes this technology more accessible in lower resourced research settings.

Bu yarı otomatik mekanik protokol, hücrelerin manuel olarak işlendiği deneylerden elde edilen sonuçları çoğaltabilir. Bu cihaz kullanılarak ve manuel ayrışma ile hazırlanan hücre süspansiyonları, fare akciğeri, böbreği ve kalp dokuları arasında karşılaştırılabilir hücre verimleri ve numune canlılığı gösterir (Şekil 2A, B). T hücreleri ve dendritik hücreler gibi bağışıklık hücrelerinin popülasyonları, izolasyon protokolündeki bir far...

Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device at JoVE.com

Akış sitometrisi gibi aşağı akış analizleri için tek hücreli süspansiyonlar oluşturmak üzere dokuların kombine enzimatik ve yarı otomatik mekanik ayrışması için genel bir protokol sağlanır. Bu protokol için geliştirilen düşük maliyetli mekanik cihazın imalatı, montajı ve çalıştırılması için talimatlar dahildir.

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. ...

Laboratuvarımız, ilaç dağıtımını ve immünoterapiyi iyileştirmek için biyolojik engelleri incelemek ve mukozal yüzeylerdeki bu engellerin üstesinden gelmek için araçlar olarak nanopartiküller geliştirmektedir. En dikkate değer gelişmelerden biri, aşılama için mRNA sağlamak için lipid nanopartikül formülasyonları kullanan Pfizer, BioNTech ve Moderna'nın COVID-19 aşılarıdır. Nanopartiküller kullanarak aşılar ve kanser tedavileri gibi immünoterapileri geliştirmek için devam eden birçok çaba vardır, çünkü bu formülasyonlar bağışıklık hücrelerine hedef iletimi iyileştirebilir ve immünoterapilerin sistemik yan etkilerini azaltabilir.Tek hücre analizi, biyomedikal araştırmalarda immünolojinin önemli bir bileşenidir ve en yaygın tekniklerden biri akış sitometrisidir. İlgilenilen dokulardan bu tür hücre izolasyonlarının gerçekleştirilmesi, güvenilir doku ayrışması gerektirir. Kalite ve doğruluktan ödün vermeden laboratuvar araştırmalarını daha erişilebilir hale getirmek zor olabilir.Süreçlerin otomatikleştirilmesi, teknik ve emek yoğun adımların öğrenilmesini kolaylaştırır ve kursiyerlerin sonuçların güvenilirliğini etkilemeden daha karmaşık analizler yaparak deneyim kazanmalarını sağlar. Bu protokolün ve beraberindeki cihaz tasarımının ana avantajı, özelleştirilebilirliği ve maliyet etkinliğidir. Aynı anda 12 dokuya kadar işlem yapabilme özelliği, işlem sürelerini azaltır.Bu düşük maliyetli alternatif, bu teknolojiyi daha düşük kaynaklı araştırma ortamlarında daha erişilebilir hale getirir.

mechanical-dissociation-tissues-for-single-cell-analysis-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Mechanical Dissociation of Tissues for Single Cell Analysis Using a Motorized Device

Being able to isolate and prepare single cells for the analysis of tissue samples has rapidly become crucial for new biomedical discoveries and research. Manual protocols for single-cell isolations are highly time-consuming and prone to user variability. Automated mechanical protocols are able to reduce processing time and sample variability but aren't easily accessible or cost-effective in lower-resourced research settings. The device described here was designed for semi-automated tissue dissociation using commercially available materials as a low-cost alternative for academic laboratories. Instructions to fabricate, assemble, and operate the device design have been provided. The dissociation protocol reliably produces single-cell suspensions with comparable cell yields and sample viability to manual preparations across multiple mouse tissues. The protocol provides the ability to process up to 12 tissue samples simultaneously per device, making studies requiring large sample sizes more manageable. The accompanying software also allows for customization of the device protocol to accommodate varying tissues and experimental constraints.

A general protocol for the combined enzymatic and semi-automated mechanical dissociation of tissues to generate single-cell suspensions for downstream analyses, such as flow cytometry, is provided. Instructions for the fabrication, assembly, and operation of the low-cost mechanical device developed for this protocol are included.

Biyomühendislik

Semi-Automated Mechanical Dissociation of Mouse Tissues to Generate Single-Cell Suspensions

To begin, place the dissected mouse tissue in a cold cell culture medium containing 5%FBS. Using sharp dissection scissors, chop the tissue until approximately five millimeters fragments are obtained. Transfer the chopped fragments to a C-tube and add one milliliter of cell culture media.Load the C-tube onto the motorized device and fit the tube holder plate over the D-shaped tube bottoms. Latch the tension arms into the acrylic plate to secure the tubes to the motor plate. To set a custom program on the motorized device from the main menu, press the blue button to choose custom mode.In the first custom mode menu, press the green button to specify the duration of forward rotation to 30 seconds. Then press the blue button to select the on screen value. In the second custom mode menu, press the green button to specify the duration of reverse rotation to 10 seconds.Then press the blue button to select the on screen value. In the third custom mode menu, press the red button to specify the selection loops to four times. Then press the blue button to select the on screen value.Adjust the voltage control dial to 200 RPM and start the custom program. Next, add digestion enzyme in four milliliters of cold culture media containing dissected tissues. Again, load the C-tube onto the device and repeat the custom program as demonstrated previously.After the run, transfer the device with the loaded tubes to a 37 degree Celsius incubator for 45 minutes. Next, load the C-tube onto the device and set the custom program at 50 RPM with forward rotation to 270 seconds. Reverse rotation to 30 seconds and looping nine times.Add EDTA to a five millimolar final concentration to the sample. Set the custom program at 100 RPM with forward rotation to 30 seconds. Reverse rotation to 10 seconds and looping twice.Next, pass the cell suspension through a 70 micrometer cell strainer and collect the filtrate in a 50 or 15 milliliter tube. Centrifuge the collected cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees Celsius and discard the supernatant. Re-suspend the pellet in one milliliter of red blood cell lysis buffer, and incubate for one minute.Neutralize the lysis buffer with nine milliliters of cold PBS. Again, centrifuge the cells and re-suspend the pellet in the desired buffer or media. Cell suspension prepared with motorized device and manual dissociation exhibited comparable cell viability and yields across mouse lung, kidney, and heart tissues.Immune cell populations like T-cells and dendritic cells were not significantly affected by the isolation protocol. Surface marker expression also showed similar frequencies of isolated T-cells in mean fluorescence intensity for the antigen presentation marker MHC II in dendritic cells between manual and device isolation.