Name: Expression and Purification of Human Solute Carrier Transporters Using Codon-Optimized Genes (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-09-29T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression and Purification of Human Solute Carrier Transporters Using Codon-Optimized Genes at JoVE.com

Este trabajo se realizó dentro del proyecto RESOLUTE. RESOLUTE ha recibido financiación de la Empresa Común para la Iniciativa sobre Medicamentos Innovadores 2 en virtud del acuerdo de subvención n.º 777372. Esta Empresa Común cuenta con el apoyo del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea y de la EFPIA. Este artículo refleja únicamente las opiniones de los autores y ni el IMI ni la Unión Europea y EFPIA son responsables del uso que pueda hacerse de la información contenida en el mismo. El plásmido pHTBV fue amablemente proporcionado por el Prof. Frederick Boyce (Harvard).

NOTA: Todos los genes RESOLUTE SLC optimizados para codones se han depositado en AddGene43, cuyos enlaces están disponibles en la lista de reactivos públicos RESOLUTE44. Estos genes se han clonado en el plásmido pDONR221 y permiten la clonación directa de los genes en el vector de destino mediante clonación por recombinación45. Para maximizar el paralelismo, las células bacterianas, de insectos y de mamíferos se cultivan en formato de bloque ...

Strategies for Expressing and Purifying Solute Carrier Transporters

El desarrollo de terapias dirigidas al SLC se ha visto obstaculizado debido a la ausencia de una caracterización sistemática de la función transportadora. Esto ha llevado a un número desproporcionadamente menor de fármacos dirigidos a esta clase de proteínas en relación con los GPCR y los canales iónicos63, a pesar de sus numerosas funciones en los procesos normales y fisiopatológicos. RESOLUTE es un consorcio internacional destinado a desarrollar técnicas y herramientas de investigació...

Las proteínas de membrana han sido durante mucho tiempo objetivos tanto para los investigadores como para las industrias farmacéuticas. De estos, los portadores de solutos (SLC) son una familia de más de 400 genes transportadores secundarios codificados dentro del genomahumano. Estos transportadores están involucrados en la importación y exportación de numerosas moléculas, incluidos iones2, neurotransmisores3, lípidos 4,5,6,7, aminoácidos8, nutrientes 9,10,11 y productos farmacéuticos 12. Con tal amplitud de sustratos, estas proteínas también están implicadas en una serie de fisiopatologías a través del transporte de toxinas13, el transporte y la inhibición por drogas de abuso 14,15 o mutaciones deletéreas16. Los homólogos bacterianos han servido como prototipos para el mecanismo de transporte fundamental de varias familias de SLC 17,18,19,20,21,22,23,24,25. A diferencia de las proteínas humanas, los ortólogos procariotas a menudo se expresan mejor en el bien conocido sistema de expresión de Escherichia coli 26,27 y son más estables en los detergentes más pequeños que producen cristales bien ordenados para la cristalografía de rayos X 28. Sin embargo, las diferencias de secuencia y funcionales complican el uso de estas proteínas lejanamente relacionadas para el descubrimiento de fármacos29,30. En consecuencia, a menudo se necesita un estudio directo de la proteína humana para descifrar el mecanismo de acción de los fármacos dirigidos a las SLC 31,32,33,34,35. Si bien los avances recientes en criomicroscopía electrónica (Cryo-EM) han permitido la caracterización estructural de las SLC en condiciones más nativas36,37, la dificultad para expresar y purificar estas proteínas sigue siendo un desafío para el desarrollo de terapias y diagnósticos dirigidos.
Para paliar este reto, el consorcio RESOLUTE (re-solute.eu) ha desarrollado recursos y protocolos para la expresión y purificación a gran escala de proteínas humanas de la familia SLC38. A partir de genes optimizados para codones, hemos desarrollado métodos para la clonación de alto rendimiento y el cribado de construcciones de SLC. Estos métodos se aplicaron sistemáticamente a toda la familia de SLC, los genes se clonaron en el sistema de expresión viral BacMam y la expresión de proteínas se probó en líneas celulares humanas39 sobre la base de métodos descritos anteriormente para la clonación de alto rendimiento y las pruebas de expresión40. En resumen, el gen SLC se clona a partir del plásmido pDONR221 en un vector pHTBV1.1. Esta construcción se utiliza posteriormente para transponer el gen de interés en un vector bacmid para la transfección de células de insectos, que incluye un promotor de citomegalovirus y elementos potenciadores para su expresión en células de mamíferos. El baculovirus resultante se puede utilizar para transducir células de mamíferos para la expresión de la proteína SLC diana.
Además, desarrollamos métodos estandarizados para la expresión a gran escala y la purificación estable de SLC seleccionadas (Figura 1). Este protocolo incluye varios puntos de control para facilitar la resolución eficaz de problemas y minimizar la variabilidad entre experimentos. En particular, el monitoreo rutinario de la expresión y localización de proteínas, así como la optimización a pequeña escala de las condiciones de purificación para objetivos individuales, se vieron ayudados por las etiquetas Strep y Green Fluorescent Protein (GFP)41,42.
En última instancia, estas muestras de proteínas químicamente puras y estructuralmente homogéneas se pueden utilizar para la determinación estructural mediante cristalografía de rayos X o criomicroscopía electrónica (Cryo-EM), ensayos bioquímicos de compromiso con dianas, inmunización para la generación de aglutinantes y estudios funcionales libres de células mediante la reconstitución en liposomas químicamente definidos.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>3C protease</td>
			<td>Produced in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Cyclohexyl-1-Pentyl-&#946;-D-Maltoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C325</td>
			<td>CYMAL-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well bacmid purification kit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>LSKP09604</td>
			<td>Montage Plasmid Miniprep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well block (2 mL)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>780271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive plastic seals</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td>Tape Pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose size exclusion chromatography column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29091596</td>
			<td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase DNAse</td>
			<td>Produced in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BisTris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>CH210</td>
			<td>CHS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt metal affinity resin</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>635653</td>
			<td>TALON Metal Affinity Resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Biotin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>851209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-agarose size exclusion chromatography column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Apollo Scientific</td>
			<td>BID3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder (40 mL)</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>357546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>4693132001</td>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fos-Choline-12</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>F308S</td>
			<td>FS-12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glyco-diosgenin</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>GDN101</td>
			<td>GDN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gravity flow columns</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>WZ-06479-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12338018</td>
			<td>FreeStyle 293 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Apollo Scientific</td>
			<td>BI8181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophilic, neutral silica UHPLC column</td>
			<td>Sepax</td>
			<td>231300-4615</td>
			<td>Unix-C SEC-300 4.6 x 150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect transfection reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71259</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauryl Maltose Neopentyl Glycol</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310</td>
			<td>LMNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-expression shaker</td>
			<td>Glas-Col</td>
			<td>107A DPMINC24CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Decyl-&#946;-D-Maltoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D322</td>
			<td>DM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310</td>
			<td>DDM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D360</td>
			<td>LDAO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Nonyl-&#946;-D-Glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>N324S</td>
			<td>NG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-d17-&#946;-D-Glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311D</td>
			<td>OGNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octaethylene Glycol Monododecyl 
			Ether</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O330</td>
			<td>C12E8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Glucose Neopentyl Glycol</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG311</td>
			<td>OGNG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>AP1210</td>
			<td>C12E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>APO129</td>
			<td>C12E9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porous seal for tissue culture plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60941-084</td>
			<td>Rayon Films for Biological Cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombination enzyme mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11791020</td>
			<td>Gateway LR Clonase II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum-free insect media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10902088</td>
			<td>Sf-900 II serum-free media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Butyrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>303410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator 24-head probe</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>630-0579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator power unit</td>
			<td>Sonics</td>
			<td>VCX 750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin resin</td>
			<td>IBA Life Sciences</td>
			<td>2-5030-025</td>
			<td>Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose Monododecanoate</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S350</td>
			<td>DDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suspension-adapted HEK293 cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A14527</td>
			<td>Expi293F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection reagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>70967</td>
			<td>GeneJuice Transfection Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput expression and purification of human solute carriers for structural and biochemical studies

Los transportadores de solutos (SLC) son transportadores de membrana que importan y exportan una variedad de sustratos endógenos y exógenos, incluidos iones, nutrientes, metabolitos, neurotransmisores y productos farmacéuticos. A pesar de haber surgido como dianas terapéuticas atractivas y marcadores de enfermedades, este grupo de proteínas sigue estando relativamente infradrogado por los productos farmacéuticos actuales. Los proyectos de descubrimiento de fármacos para estos transportadores se ven obstaculizados por el limitado conocimiento estructural, funcional y fisiológico, debido en última instancia a las dificultades en la expresión y purificación de esta clase de proteínas incrustadas en la membrana. Aquí, demostramos métodos para obtener cantidades de miligramos de alta pureza de proteínas transportadoras de SLC humanas utilizando secuencias de genes optimizadas para codones. Junto con una exploración sistemática del diseño de constructos y la expresión de alto rendimiento, estos protocolos garantizan la preservación de la integridad estructural y la actividad bioquímica de las proteínas diana. También destacamos los pasos críticos en la expresión de las células eucariotas, la purificación de la afinidad y la cromatografía de exclusión por tamaño de estas proteínas. En última instancia, este flujo de trabajo produce preparaciones de proteínas puras, funcionalmente activas y estables adecuadas para la determinación de estructuras de alta resolución, estudios de transporte, ensayos de compromiso de moléculas pequeñas y cribado in vitro de alto rendimiento.

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

Los genes SLC se pueden clonar a partir de plásmidos pDONR RESOLUTE en vectores BacMam para la expresión en mamíferos Los protocolos descritos para la clonación, la expresión y la purificación han demostrado ser exitosos para muchos transportadores de SLC a través de múltiples pliegues de proteínas. Sin embargo, los procedimientos incluyen varios puntos de control para monitorear el progreso, lo que permite la optimización para tener en cuenta las diferencias en la expresión, el plegamiento...

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Expression and Purification of Human Solute Carrier Transporters Using Codon-Optimized Genes (Video) | JoVE

Los estudios estructurales y bioquímicos de los transportadores de membrana humana requieren cantidades de miligramos de proteína estable, intacta y homogénea. Aquí describimos métodos escalables para seleccionar, expresar y purificar transportadores de solutos humanos utilizando genes optimizados para codones.

Expresión y purificación de alto rendimiento de portadores de solutos humanos para estudios estructurales y bioquímicos

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, ...

Los portadores de solutos, o SLC, son responsables de absorber nutrientes y están involucrados en enfermedades humanas. Sin embargo, hay pocos medicamentos dirigidos a las SLC porque están poco estudiados. Desarrollamos enfoques eficientes para clonar, expresar y purificar SLC.Nuestro flujo de trabajo produce proteínas puras, lo que permite realizar estudios bioquímicos y estructurales y, en última instancia, proporciona información para las campañas de descubrimiento de fármacos. Con las numerosas funciones que desempeñan los procesos biológicos, las enfermedades y la administración de fármacos, las SLC han recibido cada vez más atención y se han convertido en atractivas dianas terapéuticas. Los proyectos privados y públicos de ReSOLUTE IMI generaron recursos y datos de acceso abierto para permitir nuevos descubrimientos en la función, la fisiología, la patología y la orientación terapéutica de SLC.Tradicionalmente, las SLC eran difíciles de estudiar, ya que son proteínas integrales de membrana con diversos sustratos y diversos mecanismos de transporte. Recientemente, Cryo-EM, el sistema de expresión de BacMam y los nuevos reactivos de solubilización han supuesto un cambio radical en su caracterización. Se necesitan muestras de proteínas puras para estudios bioquímicos y estructurales.En humanos, los portadores de solutos a menudo tienen un rendimiento pobre cuando se sobreexpresan y son inestables cuando se purifican. Por lo tanto, en el pasado, cada objetivo requería años para desarrollar estructuras individuales para producir la muestra de proteína para aplicaciones posteriores. Nuestro método está optimizado para el estudio paralelo y rentable de múltiples objetivos o construcciones de un solo objetivo.Por lo tanto, equilibra cuidadosamente la flexibilidad experimental, el costo, el tiempo y los recursos de laboratorio. Además, ofrecemos acceso abierto a todos nuestros protocolos y recursos en este artículo y en el portal web de ReSOLUTE.