Name: تسليط الضوء على المؤلف: تطوير طريقة فعالة ومجدية لتجميد الخلايا الظهارية الصباغية في شبكية العين
Uploaded: 2023-11-03T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81970816) إلى مي جيانغ. المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82201223) إلى Xinyue Zhu ؛ وخطة عمل الابتكار العلمي والتكنولوجي للجنة شنغهاي للعلوم والتكنولوجيا (2014090067000) إلى Haiyun Liu.

1. تفكك الخلية
<ol><li>الحفاظ على خلايا RPE كما هو موضح سابقا17,22. ملاحظة: تزرع جميع الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو CO2 بنسبة 5٪ طوال مدة البروتوكولات.</li>
	<li>قم بإعداد الكمية المطلوبة من PBS ووسط الثقافة في حمام مائي 37 درجة مئوية وضع كاشف تفكك الخلية في ...

تطوير التخزين بالتبريد للخلايا الظهارية الصبغية الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية

<ol>
	<li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).</li><li>Mcbain, V. A., Townend, J., Lois, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+retinal+pigment+epithelial+atrophy+in+stargardt+disease.">Progression of retinal pigment epithelial atrophy in stargardt disease.</a> American Journal of Ophthamology. 154 (1), 146-154 (2012).</li><li>George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium:+Development,+injury+responses,+and+regenerative+potential+in+mammalian+and+non-mammalian+systems.">The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).</li><li>Rizzolo, L. J., Nasonkin, I. O., Adelman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+cell+transplantation,+biomaterials,+and+in+vitro+models+for+developing+next-generation+therapies+of+age-related+macular+degeneration.">Retinal cell transplantation, biomaterials, and in vitro models for developing next-generation therapies of age-related macular degeneration.</a> Stem Cells Translational Medicine. 11 (3), 269-281 (2022).</li><li>Bertolotti, E., Neri, A., Camparini, M., Macaluso, C., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+as+source+for+retinal+pigment+epithelium+transplantation.">Stem cells as source for retinal pigment epithelium transplantation.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 130-144 (2014).</li><li>Da Cruz, ., L, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+1+clinical+study+of+an+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+in+age-related+macular+degeneration.">Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).</li><li>Mehat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells+in+macular+degeneration.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration.</a> Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).</li><li>Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+retinal+pigmented+epithelium.">Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (5), 384-393 (2013).</li><li>Li, Q. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+cryopreserved+clinical+grade+hESC-RPE+cells+as+a+qualified+cell+source+for+stem+cell+therapy+of+retinal+degenerative+diseases.">Functional assessment of cryopreserved clinical grade hESC-RPE cells as a qualified cell source for stem cell therapy of retinal degenerative diseases.</a> Experimental Eye Research. 202, 108305 (2021).</li><li>Francois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunosuppressive+properties+as+a+result+of+heat-shock+response+and+impaired+interferon-gamma+licensing.">Cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunosuppressive properties as a result of heat-shock response and impaired interferon-gamma licensing.</a> Cytotherapy. 14 (2), 147-152 (2012).</li><li>Moll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunomodulatory+and+therapeutic+properties.">Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties.</a> Stem Cells. 32 (9), 2430-2442 (2014).</li><li>Ekpo, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+cryopreservation+evaluations+into+the+design+of+cell-based+drug+delivery+systems:+an+opinion+paper.">Incorporating cryopreservation evaluations into the design of cell-based drug delivery systems: an opinion paper.</a> Frontiers in Immunology. 13, 967731 (2022).</li><li>Bailey, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+osmolytes+in+cryopreserving+adherent+neuroblastoma+(Neuro-2a)+cells.">Protective effects of osmolytes in cryopreserving adherent neuroblastoma (Neuro-2a) cells.</a> Cryobiology. 71 (3), 472-480 (2015).</li><li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+a+cryopreservation+of+cultured+human+corneal+endothelial+cells.">Feasibility of a cryopreservation of cultured human corneal endothelial cells.</a> PLoS One. 14 (6), e0218431 (2019).</li><li>Pennington, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-free+cryopreservation+of+adherent+retinal+pigmented+epithelium+yields+viable+and+functional+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Xeno-free cryopreservation of adherent retinal pigmented epithelium yields viable and functional cells in vitro and in vivo.</a> Scientific Reports. 11 (1), 6286 (2021).</li><li>Woods, E. J., Thirumala, S., Badhe-Buchanan, S. S., Clarke, D., Mathew, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off+the+shelf+cellular+therapeutics:+Factors+to+consider+during+cryopreservation+and+storage+of+human+cells+for+clinical+use.">Off the shelf cellular therapeutics: Factors to consider during cryopreservation and storage of human cells for clinical use.</a> Cytotherapy. 18 (6), 697-711 (2016).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+optimal+stage+for+cryopreservation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells.">Determining the optimal stage for cryopreservation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 13 (1), 454 (2022).</li><li>Leach, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigmented+epithelium:+a+comparative+study+between+cell+lines+and+differentiation+Methods.">Induced pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium: a comparative study between cell lines and differentiation Methods.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 317-330 (2016).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+cells+in+Xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in Xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li><li>Brandl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+characterisation+of+retinal+pigment+epithelium+(RPE)+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+(hiPSC).">In-depth characterisation of retinal pigment epithelium (RPE) cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC).</a> Neuromolecular Medicine. 16 (3), 551-564 (2014).</li><li>Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-+and+feeder-free+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+two+distinct+ocular+epithelial+cell+types+using+simple+modifications+of+one+method.">Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 291 (2017).</li><li>Foltz, L. P., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+directed+differentiation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+human+embryonic+or+induced+pluripotent+stem+cells.">Rapid, directed differentiation of retinal pigment epithelial cells from human embryonic or induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), 10.3791/56274 (2017).</li><li>Marcantonini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+cryoprotective+and+cytoprotective+agents+in+cryopreservation:+a+focus+on+melatonin.">Natural cryoprotective and cytoprotective agents in cryopreservation: a focus on melatonin.</a> Molecules. 27 (10), 3254 (2022).</li></ol>

في هذه الدراسة ، تم وصف بروتوكول تجميد ذوبان ناجح لخلايا RPE المشتقة من hESC للبحث والاحتياجات السريرية. على عكس خط خلايا RPE الخالد ، ARPE-19 ، فإن خلايا RPE ذات النمط الظاهري الظهاري المميز المناسب والوظيفة ، مثل الخلايا الجذعية المشتقة من RPE ، أكثر حساسية للحفظ بالتبريد. بقي أقل من 32٪ من الخلايا في...

ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) هي طبقة أحادية مصطبغة من الخلايا اللازمة للحفاظ على الوظيفة المناسبة للشبكية1. يرتبط الخلل الوظيفي RPE والوفاة ارتباطا وثيقا بالعديد من الأمراض التنكسية للشبكية ، بما في ذلك التنكس البقعي المرتبط بالعمر والتهاب الشبكية الصباغي ومرض Stargardt 2,3. العلاج ببدائل RPE هو واحد من أكثر أنظمة العلاج الواعدة لهذه الأمراض4،5،6،7. يعد الإمداد المستقر بخلايا RPE المانحة أمرا حيويا للعلاج بالخلايا. تعد خلايا RPE المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) مصدرا مثاليا للخلايا للعلاج بالخلايا لأنها تحاكي وظيفة خلايا RPE الأولية ويمكن أن تنتج إمدادا غير محدود نظريا8. ومع ذلك ، فإن عملية التمايز شاقة والعمر الافتراضي لخلايا RPE التي تم الحصول عليها قصير نسبيا بسبب الانتقال الظهاري الوسيطة اللاحق (EMT). لذلك ، يعد الحفظ بالتبريد لخلايا RPE المشتقة من hESC خطوة لا غنى عنها مطلوبة للتخزين طويل الأجل والتوزيع عند الطلب9.
يمكن أن يؤدي التلف الخلوي الناجم عن الحفظ بالتبريد إلى الإضرار عن غير قصد بالفعالية العلاجية10,11. لذلك ، اقترحت الدراسات الحديثة حول الحفظ بالتبريد أنه يجب تحديد ظروف التخزين المبردة المثلى عند تصميم العلاجات الخلوية12. يضمن الحفظ بالتبريد الناجح استعادة الخلايا بكفاءة ، والقدرة العالية على البقاء ، واستعادة وظيفة الخلية بعد دورة التجميد والذوبان. ومع ذلك ، فقد أبلغت الدراسات السابقة حول الحفظ بالتبريد للطبقات الأحادية الملتصقة لخلايا الثدييات عن معدلات بقاء متغيرة للغاية (35٪ -95٪) بعد ذوبانالجليد 13،14،15. تؤثر العديد من العوامل بشكل كبير على نتائج الحفظ بالتبريد ، خاصة خلال مرحلة التجميد16,17. أظهرت الأبحاث الحديثة أن خلايا RPE المجمدة في نقاط زمنية مختلفة أظهرت تعافيا متنوعا بعد ذوبانالجليد 17. على حد علمنا ، لا توجد دراسات حول تحديد الإطار الزمني الأمثل للتجميد لخلايا RPE المشتقة من الخلايا الجذعية. في دراسات مختلفة ، تم تجميد الخلايا في مراحل مختلفة: تم تجميد بعض الخلايا بعد فترة وجيزة من المرور أو قبل التقاء أو تصبغ8،15،18 ، بينما تم تجميد البعض الآخر في نقاط زمنية أخرى9،19،20،21. علاوة على ذلك ، لا يوجد دليل واضح على ما إذا كانت مرحلة أو مرحلة خلايا RPE المستخدمة في الحفظ بالتبريد تؤثر على وظيفة RPE بعد الذوبان. في دراستنا السابقة ، أثبتنا لأول مرة أن المرحلة الأسية لنمو الخلايا (P2D5) هي أفضل مرحلة للحفظ بالتبريد لخلايا RPE المشتقة من hESC من حيث صلاحية الخلية واستعادة الخصائص والوظائف الخلوية17.
تهدف الطريقة التي تم إنشاؤها هنا إلى الحفاظ على RPE المشتق من hESC بالتبريد في المرحلة المثلى لتحقيق أفضل حفظ من حيث صلاحية الخلية ووظيفتها بعد الذوبان. باستخدام مقايسة وضع العلامات 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) للكشف عن المرحلة الأسية لتخليق الحمض النووي قبل الحفظ بالتبريد ، أظهرت خلايا RPE المذابة >80٪ من الصلاحية ومعدل التعلق ، والتعبير الجيني الخاص ب RPE ، ومورفولوجيا الخلية المستقطبة ، وإفراز العامل المشتق من ظهارة الصباغ ، والمقاومة المناسبة عبر الظهارة ، والقدرة البلعمية8،17،22. على الرغم من أن هذا البروتوكول يركز على خلايا RPE المشتقة من hESC ولا يتم حفظ جميع الخلايا العلاجية بالتبريد على قدم المساواة ، يمكن تطبيق استراتيجية التجميد في المرحلة الأسية على العديد من الخلايا العلاجية الأخرى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40 &#956;m Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo freezing container</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>Biolife Solutions</td>
			<td>07930</td>
			<td>cryopreservation medium #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genxin</td>
			<td>Selcell</td>
			<td>YB050050</td>
			<td>cryopreservation medium #2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic stem cells</td>
			<td>provided by Wicell, USA</td>
			<td>H9 cell line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System</td>
			<td>BioLife Solutions</td>
			<td>AST-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryPLE Select</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12563029</td>
			<td>cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XVIVO-10 medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BEBP04-743Q</td>
			<td>RPE culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryopreservation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells at the optimal stage

الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية (RPE) المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) هي مصادر خلايا متفوقة للعلاج باستبدال الخلايا لدى الأفراد المصابين بأمراض تنكسية في شبكية العين. ومع ذلك ، فإن الدراسات حول البنوك المستقرة والآمنة لهذه الخلايا العلاجية نادرة. تعد قابلية بقاء الخلايا المتغيرة للغاية والاسترداد الوظيفي لخلايا RPE بعد الحفظ بالتبريد من أكثر المشكلات شيوعا. في البروتوكول الحالي ، كنا نهدف إلى تحقيق أفضل معدل لاستعادة الخلايا بعد الذوبان عن طريق اختيار مرحلة الخلية المثلى للتجميد بناء على الظروف التجريبية الأصلية. تم تجميد الخلايا في المرحلة الأسية المحددة باستخدام مقايسة وضع العلامات 5-ethynyl-2′-deoxyuridine ، مما أدى إلى تحسين صلاحية الخلية ومعدل الشفاء بعد الذوبان. تم الحصول على خلايا مستقرة ووظيفية بعد فترة وجيزة من ذوبان الجليد ، مستقلة عن عملية تمايز طويلة. تسمح الطرق الموضحة هنا بحفظ وذوبان خلايا RPE المشتقة من hESC بشكل بسيط وفعال وغير مكلف. على الرغم من أن هذا البروتوكول يركز على خلايا RPE ، يمكن تطبيق استراتيجية التجميد هذه على العديد من الأنواع الأخرى من الخلايا المتمايزة.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a pigmented monolayer of cells required for maintaining the proper function of the retina1. RPE dysfunction and death are closely associated with many retinal degenerative diseases, including age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and Stargardt disease2,3. RPE replacement therapy is one of the most promising treatment regimens for these diseases4,5,6,7. A stable supply of donor RPE cells is vital for cell therapy. Human embryonic stem cell (hESC)-derived RPE cells are an ideal cell source for cell therapy because they mimic the function of primary RPE cells and can produce a theoretically unlimited supply8. However, the differentiation process is laborious and the shelf-life of the obtained RPE cells is relatively short because of subsequent epithelial-mesenchymal transition (EMT). Therefore, the cryopreservation of hESC-derived RPE cells is an indispensable step required for long-term storage and on-demand distribution9.
Cryopreservation-induced cellular damage can inadvertently compromise therapeutic efficacy10,11. Therefore, recent studies on cryopreservation have proposed that optimal cryogenic storage conditions should be determined when designing cell therapies12. Successful cryopreservation guarantees efficient cell recovery, high viability, and cell function restoration after the freeze-thaw cycle. However, previous studies on the cryopreservation of the adherent monolayers of mammalian cells have reported highly variable (35%-95%) survival rates after thawing13,14,15. Many factors considerably affect the outcomes of cryopreservation, particularly during the freezing stage16,17. Recent research showed that RPE cells frozen at different time points exhibited varied recovery after thawing17. To the best of our knowledge, studies on the determination of the optimal freezing time window for stem cell-derived RPE cells are lacking. In different studies, the cells were frozen at various stages: some cells were frozen shortly after passaging or before confluency or pigmentation8,15,18, whereas others were frozen at other time points9,19,20,21. Furthermore, there is no clear evidence of whether the phase or stage of RPE cells used for cryopreservation affects RPE function after thawing. In our previous study, we demonstrated for the first time that the exponential phase of cell growth (P2D5) is the best stage for the cryopreservation of hESC-derived RPE cells in terms of cell viability and the recovery of cellular properties and functions17.
The method established here aims to cryopreserve hESC-derived RPE at an optimal stage to achieve the best preservation in terms of cell viability and function after thawing. Using the 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) labeling assay to detect the exponential phase of DNA synthesis before cryopreservation, thawed RPE cells exhibited &#62;80% viability and attachment rate, RPE-specific gene expression, polarized cell morphology, pigment epithelium-derived factor secretion, appropriate transepithelial resistance, and phagocytic ability8,17,22. Although this protocol focuses&#160;on hESC-derived RPE cells and not all therapeutic cells are equally cryopreserved, the strategy of freezing in the exponential phase may be applied to many other therapeutic cells.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير طريقة فعالة ومجدية لتجميد الخلايا الظهارية الصباغية في شبكية العين

الحفظ بالتبريد للخلايا الظهارية الصبغية الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في المرحلة المثلى

Our lab aims to better understand the molecular mechanism of retinal diseases, with a focus on unmet medical needs of patients. We aim to develop effective treatments, such as stem-cell-based therapies, for them. Cryopreservation of stem-cell-derived RPE cells is an important step for RPE replacement therapy.Currently, the cells are frozen at various stages, resulting in highly variable survival rates for thawing. This is needed to determine the optimal cell stage for freezing these cells. Our protocol provides a simple, efficient, and inexpensive ways of freezing RPE cells by determining the exponential phase of RPE cells for freezing.It's less dependent of differentiated methods or cell lines.

هنا ، تم تمرير خلايا RPE المشتقة من hESC في P1D35 وبذرها بكثافة 105 / سم2. في غضون أسبوع من البذر ، فقدت التشكل السداسي المميز والتصبغ خلال مرحلة التأخر (حوالي 2 أيام). أعادت خلايا RPE تدريجيا اعتماد التشكل السداسي في المرحلة الأسية (حوالي 5 أيام ، الشكل 1 أ) ودخلت مرحلة التبا?...

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage at JoVE.com

توفر هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا للحفظ بالتبريد الفعال للخلايا الظهارية الصبغية الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية.

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in ...

يهدف مختبرنا إلى فهم الآلية الجزيئية لأمراض الشبكية بشكل أفضل ، مع التركيز على الاحتياجات الطبية غير الملباة للمرضى. نحن نهدف إلى تطوير علاجات فعالة ، مثل العلاجات القائمة على الخلايا الجذعية ، لهم. يعد الحفظ بالتبريد لخلايا RPE المشتقة من الخلايا الجذعية خطوة مهمة للعلاج ببدائل RPE.حاليا ، يتم تجميد الخلايا في مراحل مختلفة ، مما يؤدي إلى معدلات بقاء متغيرة للغاية للذوبان. هذا ضروري لتحديد مرحلة الخلية المثلى لتجميد هذه الخلايا. يوفر بروتوكولنا طرقا بسيطة وفعالة وغير مكلفة لتجميد خلايا RPE من خلال تحديد المرحلة الأسية لخلايا RPE للتجميد.إنه أقل اعتمادا على الطرق المتمايزة أو خطوط الخلايا.

cryopreservation-human-embryonic-stem-cell-derived-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Medicine

Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in individuals with retinal degenerative diseases; however, studies on the stable and secure banking of these therapeutic cells are scarce. Highly variable cell viability and functional recovery of&#160;RPE cells after cryopreservation are the most commonly encountered issues. In the present protocol, we aimed to achieve the best cell recovery rate after thawing by selecting the optimal cell phase for freezing based on the original experimental conditions. Cells were frozen in the exponential phase determined by using the 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine labeling assay, which improved cell viability and recovery rate after thawing. Stable and functional cells were obtained shortly after thawing, independent of a long differentiation process. The methods described here allow the simple, efficient, and inexpensive preservation and thawing of hESC-derived RPE cells. Although this protocol focuses on RPE cells, this freezing strategy may be applied to many other types of differentiated cells.

This study provides a detailed protocol for the efficient cryopreservation of human stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.

Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cell Dissociation and Optimal Cryopreservation Stage Determination

To begin, dilute a vial of thawed cold basement membrane matrix with 12 milliliters of DM EM F12. Mix the suspension well. Add one cover slip into each well of a 24-well plate.Then, pipette 250 microliters of the dilute matrix solution into each well. Discard the culture medium of the cultured hESC derived retinal pigment epithelial cell plates. Wash the plates two times with one milliliter of preheated PBS per well.Next, add 0.5 milliliters of the cell dissociation reagent to the wells of the culture plates, and incubate them at 37 degrees Celsius for 15 minutes to initiate digestion. After incubation, observe the cells under the microscope to confirm the end of digestion. Now with a one milliliter pipette, gently pipette the cell suspension up and down 10 times.Add preheated culture medium to dilute the suspension. Then, centrifuge it at 250 G for three minutes at room temperature. Pour out the supernatant from the centrifuge tube.Then, re-suspend the cell pellet in two milliliters of the culture medium. Use a pipette to mix the cells 10 to 15 times. Filter the cell suspension through a 40 micrometer cell strainer.Next, count the retinal pigment epithelial cells. Aspirate the coating solution before plating. Then, add one milliliter of the culture medium into each well and seed the cells on the cover slips.After EDU incorporation and staining, capture the images of five random fields with a fluorescence microscope. Calculate the percentage of EDU positive cells. Then, plot the corresponding proportion time curves to generate a growth curve.Lastly, determine the freezing window from the exponential phase for each cell line. The retinal pigment epithelial cells initially lost their characteristic hexagonal morphology, but later regained it in the exponential phase of growth. When the cells were cultured for an additional week, cell proliferation decreased.EDU proliferation assay confirmed that P2 day five cells exhibited a higher proliferation rate, whereas P2 day 11 cells had entered the deceleration phase.

تفكك الخلايا الظهارية الصباغية الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية وتحديد مرحلة الحفظ بالتبريد الأمثل

Preservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells with Optimized Cryopreservation

To begin, dissociate the hESC-derived retinal pigment epithelial cells, prepare the cell suspension, and then count the cells. Now, centrifuge the cells at 250g for three minutes at room temperature. Pour out the supernatant, then, resuspend the cell pellet in cryopreservation medium.Next, transfer one milliliter of the cell suspension to a 1.2-milliliter cryogenic vial. Place the cryogenic vials in a freezing container and freeze overnight at minus 80 degrees Celsius. Transfer the vials to liquid nitrogen for long-term storage.To thaw the frozen vials, first heat the culture medium in metallic beads heated to 37 degrees Celsius, pre-fill 10 milliliters of the warmed culture medium into a 15-milliliter tube. Now, remove the cryogenic vials from the liquid nitrogen and place them in an automated thawing system for rapid thawing. Drop 0.5 to one milliliter of the preheated culture medium into the cryogenic vial to ensure gradual cell adaptation.Then, pipet 1.5 to two milliliters of the cell suspension to the 15-milliliter tube with medium. Centrifuge the cells at 250g for three minutes at room temperature. Then, discard the supernatant.Resuspend the pellet in two milliliters of warm medium. Load the cells in a hemocytometer and count them to determine the recovery and survival rates. Culture the thawed cells on basement membrane coated plates in a culture medium with Y27632.The retinal pigment epithelial cells that were frozen on day five in their exponential phase displayed a higher attachment rate after thawing. Relative to their characteristic hexagonal morphology, the cells frozen at other time points had a fibroblastic phenotype. P2 day-five cells displayed higher expression and more properly localized cell markers 28 days after thawing.It was noted that different cryopreservation media performed equally well in achieving high cell viability and attachment post-thawing.