Name: लेखक स्पॉटलाइट: रेटिना वर्णक उपकला सेल ठंड के एक कुशल और व्यवहार्य विधि का विकास
Uploaded: 2023-11-03T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage at JoVE.com

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81970816) द्वारा मेई जियांग को वित्त पोषित किया गया था; चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82201223) Xinyue झू को; और शंघाई विज्ञान और प्रौद्योगिकी आयोग (2014090067000) की विज्ञान और प्रौद्योगिकी नवाचार कार्य योजना हैयुन लियू को।

1. सेल पृथक्करण
<ol><li>आरपीई कोशिकाओं को बनाए रखें जैसा कि पहले17,22 वर्णित है। नोट: सभी कोशिकाओं को प्रोटोकॉल की अवधि के दौरान 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर उगाया जा?...

मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के क्रायोस्टोरेज को आगे बढ़ाना

<ol>
	<li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium.">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).</li><li>Mcbain, V. A., Townend, J., Lois, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+retinal+pigment+epithelial+atrophy+in+stargardt+disease.">Progression of retinal pigment epithelial atrophy in stargardt disease.</a> American Journal of Ophthamology. 154 (1), 146-154 (2012).</li><li>George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium:+Development,+injury+responses,+and+regenerative+potential+in+mammalian+and+non-mammalian+systems.">The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).</li><li>Rizzolo, L. J., Nasonkin, I. O., Adelman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+cell+transplantation,+biomaterials,+and+in+vitro+models+for+developing+next-generation+therapies+of+age-related+macular+degeneration.">Retinal cell transplantation, biomaterials, and in vitro models for developing next-generation therapies of age-related macular degeneration.</a> Stem Cells Translational Medicine. 11 (3), 269-281 (2022).</li><li>Bertolotti, E., Neri, A., Camparini, M., Macaluso, C., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+as+source+for+retinal+pigment+epithelium+transplantation.">Stem cells as source for retinal pigment epithelium transplantation.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 130-144 (2014).</li><li>Da Cruz, ., L, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+1+clinical+study+of+an+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+in+age-related+macular+degeneration.">Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).</li><li>Mehat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells+in+macular+degeneration.">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration.</a> Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).</li><li>Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+retinal+pigmented+epithelium.">Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (5), 384-393 (2013).</li><li>Li, Q. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+cryopreserved+clinical+grade+hESC-RPE+cells+as+a+qualified+cell+source+for+stem+cell+therapy+of+retinal+degenerative+diseases.">Functional assessment of cryopreserved clinical grade hESC-RPE cells as a qualified cell source for stem cell therapy of retinal degenerative diseases.</a> Experimental Eye Research. 202, 108305 (2021).</li><li>Francois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunosuppressive+properties+as+a+result+of+heat-shock+response+and+impaired+interferon-gamma+licensing.">Cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunosuppressive properties as a result of heat-shock response and impaired interferon-gamma licensing.</a> Cytotherapy. 14 (2), 147-152 (2012).</li><li>Moll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunomodulatory+and+therapeutic+properties.">Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties.</a> Stem Cells. 32 (9), 2430-2442 (2014).</li><li>Ekpo, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+cryopreservation+evaluations+into+the+design+of+cell-based+drug+delivery+systems:+an+opinion+paper.">Incorporating cryopreservation evaluations into the design of cell-based drug delivery systems: an opinion paper.</a> Frontiers in Immunology. 13, 967731 (2022).</li><li>Bailey, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+osmolytes+in+cryopreserving+adherent+neuroblastoma+(Neuro-2a)+cells.">Protective effects of osmolytes in cryopreserving adherent neuroblastoma (Neuro-2a) cells.</a> Cryobiology. 71 (3), 472-480 (2015).</li><li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+a+cryopreservation+of+cultured+human+corneal+endothelial+cells.">Feasibility of a cryopreservation of cultured human corneal endothelial cells.</a> PLoS One. 14 (6), e0218431 (2019).</li><li>Pennington, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-free+cryopreservation+of+adherent+retinal+pigmented+epithelium+yields+viable+and+functional+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Xeno-free cryopreservation of adherent retinal pigmented epithelium yields viable and functional cells in vitro and in vivo.</a> Scientific Reports. 11 (1), 6286 (2021).</li><li>Woods, E. J., Thirumala, S., Badhe-Buchanan, S. S., Clarke, D., Mathew, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off+the+shelf+cellular+therapeutics:+Factors+to+consider+during+cryopreservation+and+storage+of+human+cells+for+clinical+use.">Off the shelf cellular therapeutics: Factors to consider during cryopreservation and storage of human cells for clinical use.</a> Cytotherapy. 18 (6), 697-711 (2016).</li><li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+optimal+stage+for+cryopreservation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells.">Determining the optimal stage for cryopreservation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 13 (1), 454 (2022).</li><li>Leach, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigmented+epithelium:+a+comparative+study+between+cell+lines+and+differentiation+Methods.">Induced pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium: a comparative study between cell lines and differentiation Methods.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 317-330 (2016).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+cells+in+Xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in Xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li><li>Brandl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+characterisation+of+retinal+pigment+epithelium+(RPE)+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+(hiPSC).">In-depth characterisation of retinal pigment epithelium (RPE) cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC).</a> Neuromolecular Medicine. 16 (3), 551-564 (2014).</li><li>Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xeno-+and+feeder-free+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+two+distinct+ocular+epithelial+cell+types+using+simple+modifications+of+one+method.">Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 291 (2017).</li><li>Foltz, L. P., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+directed+differentiation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+human+embryonic+or+induced+pluripotent+stem+cells.">Rapid, directed differentiation of retinal pigment epithelial cells from human embryonic or induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), 10.3791/56274 (2017).</li><li>Marcantonini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+cryoprotective+and+cytoprotective+agents+in+cryopreservation:+a+focus+on+melatonin.">Natural cryoprotective and cytoprotective agents in cryopreservation: a focus on melatonin.</a> Molecules. 27 (10), 3254 (2022).</li></ol>

वर्तमान अध्ययन में, अनुसंधान और नैदानिक आवश्यकताओं के लिए एचईएससी-व्युत्पन्न आरपीई कोशिकाओं के लिए एक सफल फ्रीज-पिघलना प्रोटोकॉल वर्णित है। अमर आरपीई सेल लाइन के विपरीत, एआरपीई -19, उचित विशेषता उपकला ?...

रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) रेटिना1 के उचित कार्य को बनाए रखने के लिए आवश्यक कोशिकाओं का एक रंजित मोनोलेयर है। आरपीई शिथिलता और मृत्यु बारीकी से उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन, रेटिनाइटिस pigmentosa, और Stargardt रोग 2,3 सहित कई रेटिना अपक्षयी रोगों के साथ जुड़े रहे हैं. आरपीई रिप्लेसमेंट थेरेपीइन बीमारियों 4,5,6,7के लिए सबसे आशाजनक उपचार के नियमों में से एक है। सेल थेरेपी के लिए दाता आरपीई कोशिकाओं की एक स्थिर आपूर्ति महत्वपूर्ण है। मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी) व्युत्पन्न आरपीई कोशिकाओं सेल थेरेपी के लिए एक आदर्श सेल स्रोत हैं क्योंकि वे प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं के समारोह की नकल और एक सैद्धांतिक रूप से असीमित आपूर्ति8 उत्पादन कर सकते हैं. हालांकि, भेदभाव प्रक्रिया श्रमसाध्य है और प्राप्त आरपीई कोशिकाओं का शेल्फ-जीवन बाद के उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) के कारण अपेक्षाकृत कम है। इसलिए, एचईएससी-व्युत्पन्न आरपीई कोशिकाओं का क्रायोप्रिजर्वेशन दीर्घकालिक भंडारण और ऑन-डिमांड वितरण9के लिए आवश्यक एक अनिवार्य कदम है।
क्रायोप्रिजर्वेशन-प्रेरित सेलुलर क्षति अनजाने में चिकित्सीय प्रभावकारिता10,11 से समझौता कर सकती है। इसलिए, क्रायोप्रिजर्वेशन पर हाल के अध्ययनों ने प्रस्तावित किया है कि सेल थेरेपी12 को डिजाइन करते समय इष्टतम क्रायोजेनिक भंडारण स्थितियों को निर्धारित किया जाना चाहिए। सफल क्रायोप्रिजर्वेशन फ्रीज-पिघलना चक्र के बाद कुशल सेल रिकवरी, उच्च व्यवहार्यता और सेल फ़ंक्शन बहाली की गारंटी देता है। हालांकि, स्तनधारी कोशिकाओं के आसन्न मोनोलेयर्स के क्रायोप्रिजर्वेशन पर पिछले अध्ययनों ने 13,14,15 को विगलन के बाद अत्यधिक परिवर्तनशील (35% -95%) जीवित रहने की दर की सूचना दी है। कई कारक क्रायोप्रिजर्वेशन के परिणामों को काफी प्रभावित करते हैं, खासकर ठंडचरण 16,17के दौरान। हाल के शोध से पता चला है कि आरपीई कोशिकाओं अलग अलग समय बिंदुओं पर जमे हुए17 पिघलना के बाद विभिन्न वसूली का प्रदर्शन. हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, स्टेम सेल व्युत्पन्न आरपीई कोशिकाओं के लिए इष्टतम ठंड समय खिड़की के निर्धारण पर अध्ययन की कमी है. विभिन्न अध्ययनों में, कोशिकाओं को विभिन्न चरणों में जमे हुए थे: कुछ कोशिकाओं को गुजरने के तुरंत बाद या संगम या रंजकता 8,15,18 से पहले जमे हुए थे, जबकि अन्य अन्य समय बिंदुओं 9,19,20,21पर जमे हुए थे। इसके अलावा, इस बात का कोई स्पष्ट प्रमाण नहीं है कि क्रायोप्रेज़र्वेशन के लिए उपयोग की जाने वाली आरपीई कोशिकाओं का चरण या चरण विगलन के बाद आरपीई फ़ंक्शन को प्रभावित करता है या नहीं। हमारे पिछले अध्ययन में, हम सेल विकास के घातीय चरण (पी 2 डी 5) सेल व्यवहार्यता और सेलुलर गुणों और कार्यों17 की वसूली के मामले में एचईएससी व्युत्पन्न आरपीई कोशिकाओं के क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए सबसे अच्छा चरण है कि पहली बार के लिए प्रदर्शन किया.
यहां स्थापित विधि का उद्देश्य विगलन के बाद सेल व्यवहार्यता और कार्य के मामले में सर्वोत्तम संरक्षण प्राप्त करने के लिए एक इष्टतम चरण में एचईएससी-व्युत्पन्न आरपीई को क्रायोप्रिजर्व करना है। क्रायोप्रिजर्वेशन से पहले डीएनए संश्लेषण के घातीय चरण का पता लगाने के लिए 5-एथिनिल-2'-डीऑक्सीयूरिडाइन (ईडीयू) लेबलिंग परख का उपयोग करते हुए, पिघले हुए आरपीई कोशिकाओं ने >80% व्यवहार्यता और लगाव दर, आरपीई-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति, ध्रुवीकृत सेल आकृति विज्ञान, वर्णक उपकला-व्युत्पन्न कारक स्राव, उपयुक्त ट्रांसपीथेलियल प्रतिरोध, और फागोसाइटिक क्षमता 8,17,22 का प्रदर्शन किया. यद्यपि यह प्रोटोकॉल एचईएससी-व्युत्पन्न आरपीई कोशिकाओं पर केंद्रित है और सभी चिकित्सीय कोशिकाएं समान रूप से क्रायोप्रिजर्व नहीं हैं, घातीय चरण में ठंड की रणनीति कई अन्य चिकित्सीय कोशिकाओं पर लागू की जा सकती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40 &#956;m Cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo freezing container</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>Biolife Solutions</td>
			<td>07930</td>
			<td>cryopreservation medium #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genxin</td>
			<td>Selcell</td>
			<td>YB050050</td>
			<td>cryopreservation medium #2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human embryonic stem cells</td>
			<td>provided by Wicell, USA</td>
			<td>H9 cell line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, hESC-Qualified Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System</td>
			<td>BioLife Solutions</td>
			<td>AST-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryPLE Select</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12563029</td>
			<td>cell dissociation reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XVIVO-10 medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BEBP04-743Q</td>
			<td>RPE culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryopreservation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells at the optimal stage

मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी) से प्राप्त रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) कोशिकाएं रेटिना अपक्षयी रोगों वाले व्यक्तियों में सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी के लिए बेहतर सेल स्रोत हैं; हालांकि, इन चिकित्सीय कोशिकाओं के स्थिर और सुरक्षित बैंकिंग पर अध्ययन दुर्लभ हैं। क्रायोप्रेज़र्वेशन के बाद आरपीई कोशिकाओं की अत्यधिक परिवर्तनशील सेल व्यवहार्यता और कार्यात्मक वसूली सबसे अधिक सामना किए जाने वाले मुद्दे हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम मूल प्रयोगात्मक शर्तों के आधार पर ठंड के लिए इष्टतम सेल चरण का चयन करके पिघलना के बाद सबसे अच्छा सेल वसूली दर प्राप्त करने का लक्ष्य है. कोशिकाओं को 5-एथिनिल-2′-डीऑक्सीयूरिडीन लेबलिंग परख का उपयोग करके निर्धारित घातीय चरण में जमे हुए थे, जिसने विगलन के बाद सेल व्यवहार्यता और वसूली दर में सुधार किया। स्थिर और कार्यात्मक कोशिकाओं को विगलन के तुरंत बाद प्राप्त किया गया था, एक लंबी भेदभाव प्रक्रिया से स्वतंत्र। यहां वर्णित विधियां एचईएससी-व्युत्पन्न आरपीई कोशिकाओं के सरल, कुशल और सस्ती संरक्षण और विगलन की अनुमति देती हैं। यद्यपि यह प्रोटोकॉल आरपीई कोशिकाओं पर केंद्रित है, इस ठंड रणनीति को कई अन्य प्रकार के विभेदित कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है।

The retinal pigment epithelium (RPE) is a pigmented monolayer of cells required for maintaining the proper function of the retina1. RPE dysfunction and death are closely associated with many retinal degenerative diseases, including age-related macular degeneration, retinitis pigmentosa, and Stargardt disease2,3. RPE replacement therapy is one of the most promising treatment regimens for these diseases4,5,6,7. A stable supply of donor RPE cells is vital for cell therapy. Human embryonic stem cell (hESC)-derived RPE cells are an ideal cell source for cell therapy because they mimic the function of primary RPE cells and can produce a theoretically unlimited supply8. However, the differentiation process is laborious and the shelf-life of the obtained RPE cells is relatively short because of subsequent epithelial-mesenchymal transition (EMT). Therefore, the cryopreservation of hESC-derived RPE cells is an indispensable step required for long-term storage and on-demand distribution9.
Cryopreservation-induced cellular damage can inadvertently compromise therapeutic efficacy10,11. Therefore, recent studies on cryopreservation have proposed that optimal cryogenic storage conditions should be determined when designing cell therapies12. Successful cryopreservation guarantees efficient cell recovery, high viability, and cell function restoration after the freeze-thaw cycle. However, previous studies on the cryopreservation of the adherent monolayers of mammalian cells have reported highly variable (35%-95%) survival rates after thawing13,14,15. Many factors considerably affect the outcomes of cryopreservation, particularly during the freezing stage16,17. Recent research showed that RPE cells frozen at different time points exhibited varied recovery after thawing17. To the best of our knowledge, studies on the determination of the optimal freezing time window for stem cell-derived RPE cells are lacking. In different studies, the cells were frozen at various stages: some cells were frozen shortly after passaging or before confluency or pigmentation8,15,18, whereas others were frozen at other time points9,19,20,21. Furthermore, there is no clear evidence of whether the phase or stage of RPE cells used for cryopreservation affects RPE function after thawing. In our previous study, we demonstrated for the first time that the exponential phase of cell growth (P2D5) is the best stage for the cryopreservation of hESC-derived RPE cells in terms of cell viability and the recovery of cellular properties and functions17.
The method established here aims to cryopreserve hESC-derived RPE at an optimal stage to achieve the best preservation in terms of cell viability and function after thawing. Using the 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) labeling assay to detect the exponential phase of DNA synthesis before cryopreservation, thawed RPE cells exhibited &#62;80% viability and attachment rate, RPE-specific gene expression, polarized cell morphology, pigment epithelium-derived factor secretion, appropriate transepithelial resistance, and phagocytic ability8,17,22. Although this protocol focuses&#160;on hESC-derived RPE cells and not all therapeutic cells are equally cryopreserved, the strategy of freezing in the exponential phase may be applied to many other therapeutic cells.

लेखक स्पॉटलाइट: रेटिना वर्णक उपकला सेल ठंड के एक कुशल और व्यवहार्य विधि का विकास

इष्टतम चरण में मानव भ्रूण स्टेम सेल-व्युत्पन्न रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं का क्रायोप्रिजर्वेशन

Our lab aims to better understand the molecular mechanism of retinal diseases, with a focus on unmet medical needs of patients. We aim to develop effective treatments, such as stem-cell-based therapies, for them. Cryopreservation of stem-cell-derived RPE cells is an important step for RPE replacement therapy.Currently, the cells are frozen at various stages, resulting in highly variable survival rates for thawing. This is needed to determine the optimal cell stage for freezing these cells. Our protocol provides a simple, efficient, and inexpensive ways of freezing RPE cells by determining the exponential phase of RPE cells for freezing.It's less dependent of differentiated methods or cell lines.

यहां, पी 1 डी 35 पर एचईएससी-व्युत्पन्न आरपीई कोशिकाओं को पारित किया गया था और 105 / सेमी2 के घनत्व पर वरीयता दी गई थी। बीजारोपण के एक सप्ताह के भीतर, विशेषता हेक्सागोनल आकृति विज्ञान और रंजकता अंतराल ?...

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यह अध्ययन मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के कुशल क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है।

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in ...

हमारी प्रयोगशाला का उद्देश्य रोगियों की अपूर्ण चिकित्सा आवश्यकताओं पर ध्यान देने के साथ रेटिना रोगों के आणविक तंत्र को बेहतर ढंग से समझना है। हम उनके लिए स्टेम-सेल-आधारित चिकित्सा जैसे प्रभावी उपचार विकसित करना चाहते हैं। स्टेम-सेल-व्युत्पन्न आरपीई कोशिकाओं का क्रायोप्रिजर्वेशन आरपीई प्रतिस्थापन चिकित्सा के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है।वर्तमान में, कोशिकाओं को विभिन्न चरणों में जमे हुए हैं, जिसके परिणामस्वरूप विगलन के लिए अत्यधिक परिवर्तनशील जीवित रहने की दर है। यह इन कोशिकाओं ठंड के लिए इष्टतम सेल चरण निर्धारित करने के लिए आवश्यक है. हमारा प्रोटोकॉल ठंड के लिए आरपीई कोशिकाओं के घातीय चरण का निर्धारण करके आरपीई कोशिकाओं को फ्रीज करने का एक सरल, कुशल और सस्ता तरीका प्रदान करता है।यह विभेदित विधियों या सेल लाइनों पर कम निर्भर है।

cryopreservation-human-embryonic-stem-cell-derived-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Medicine

Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in individuals with retinal degenerative diseases; however, studies on the stable and secure banking of these therapeutic cells are scarce. Highly variable cell viability and functional recovery of&#160;RPE cells after cryopreservation are the most commonly encountered issues. In the present protocol, we aimed to achieve the best cell recovery rate after thawing by selecting the optimal cell phase for freezing based on the original experimental conditions. Cells were frozen in the exponential phase determined by using the 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine labeling assay, which improved cell viability and recovery rate after thawing. Stable and functional cells were obtained shortly after thawing, independent of a long differentiation process. The methods described here allow the simple, efficient, and inexpensive preservation and thawing of hESC-derived RPE cells. Although this protocol focuses on RPE cells, this freezing strategy may be applied to many other types of differentiated cells.

This study provides a detailed protocol for the efficient cryopreservation of human stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.

Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cell Dissociation and Optimal Cryopreservation Stage Determination

To begin, dilute a vial of thawed cold basement membrane matrix with 12 milliliters of DM EM F12. Mix the suspension well. Add one cover slip into each well of a 24-well plate.Then, pipette 250 microliters of the dilute matrix solution into each well. Discard the culture medium of the cultured hESC derived retinal pigment epithelial cell plates. Wash the plates two times with one milliliter of preheated PBS per well.Next, add 0.5 milliliters of the cell dissociation reagent to the wells of the culture plates, and incubate them at 37 degrees Celsius for 15 minutes to initiate digestion. After incubation, observe the cells under the microscope to confirm the end of digestion. Now with a one milliliter pipette, gently pipette the cell suspension up and down 10 times.Add preheated culture medium to dilute the suspension. Then, centrifuge it at 250 G for three minutes at room temperature. Pour out the supernatant from the centrifuge tube.Then, re-suspend the cell pellet in two milliliters of the culture medium. Use a pipette to mix the cells 10 to 15 times. Filter the cell suspension through a 40 micrometer cell strainer.Next, count the retinal pigment epithelial cells. Aspirate the coating solution before plating. Then, add one milliliter of the culture medium into each well and seed the cells on the cover slips.After EDU incorporation and staining, capture the images of five random fields with a fluorescence microscope. Calculate the percentage of EDU positive cells. Then, plot the corresponding proportion time curves to generate a growth curve.Lastly, determine the freezing window from the exponential phase for each cell line. The retinal pigment epithelial cells initially lost their characteristic hexagonal morphology, but later regained it in the exponential phase of growth. When the cells were cultured for an additional week, cell proliferation decreased.EDU proliferation assay confirmed that P2 day five cells exhibited a higher proliferation rate, whereas P2 day 11 cells had entered the deceleration phase.

मानव भ्रूण स्टेम सेल-व्युत्पन्न रेटिना वर्णक उपकला सेल पृथक्करण और इष्टतम क्रायोप्रिजर्वेशन चरण निर्धारण

Preservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells with Optimized Cryopreservation

To begin, dissociate the hESC-derived retinal pigment epithelial cells, prepare the cell suspension, and then count the cells. Now, centrifuge the cells at 250g for three minutes at room temperature. Pour out the supernatant, then, resuspend the cell pellet in cryopreservation medium.Next, transfer one milliliter of the cell suspension to a 1.2-milliliter cryogenic vial. Place the cryogenic vials in a freezing container and freeze overnight at minus 80 degrees Celsius. Transfer the vials to liquid nitrogen for long-term storage.To thaw the frozen vials, first heat the culture medium in metallic beads heated to 37 degrees Celsius, pre-fill 10 milliliters of the warmed culture medium into a 15-milliliter tube. Now, remove the cryogenic vials from the liquid nitrogen and place them in an automated thawing system for rapid thawing. Drop 0.5 to one milliliter of the preheated culture medium into the cryogenic vial to ensure gradual cell adaptation.Then, pipet 1.5 to two milliliters of the cell suspension to the 15-milliliter tube with medium. Centrifuge the cells at 250g for three minutes at room temperature. Then, discard the supernatant.Resuspend the pellet in two milliliters of warm medium. Load the cells in a hemocytometer and count them to determine the recovery and survival rates. Culture the thawed cells on basement membrane coated plates in a culture medium with Y27632.The retinal pigment epithelial cells that were frozen on day five in their exponential phase displayed a higher attachment rate after thawing. Relative to their characteristic hexagonal morphology, the cells frozen at other time points had a fibroblastic phenotype. P2 day-five cells displayed higher expression and more properly localized cell markers 28 days after thawing.It was noted that different cryopreservation media performed equally well in achieving high cell viability and attachment post-thawing.