Name: Advancing Research Through Single Cell Sequencing and Spatial Histology in Placental Tissues (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-09-08T14:05:00
Duration: 1 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing Research Through Single Cell Sequencing and Spatial Histology in Placental Tissues at JoVE.com

Les auteurs remercient Bettina Amtmann et Petra Winkler pour leur excellent soutien technique pour l’échantillonnage des tissus. Cette recherche a été financée par le Fonds scientifique autrichien FWF (DOC 31-B26) et l’Université de médecine de Graz, en Autriche, dans le cadre du programme de doctorat sur les troubles inflammatoires de la grossesse (DP-iDP).

Le comité d’éthique de l’Université de médecine de Graz a approuvé cette étude (31-019 ex 18/19 version 1.2 et 29-319 ex 16/17). Le consentement éclairé de tous les sujets participant à l’étude a été obtenu.
1. Préparation de l’expérience d’écoulement
NOTE : Les expériences sont menées dans un bioréacteur avec des pompes péristaltiques intégrées (voir tableau des matériaux). L’humidité, la température et le niveau de gaz à l’intérieur du bioréacteur peuvent être ajustés.
<ol><li>Allumez le bioréacteur et prenez toutes les dispositions préalables (par exemple, l’étalonnage des pompes, le préchauffage, les conditions de gaz et l’humidité) pour l’expérience conformément au manuel du bioréacteur. Avant de commencer l’expérience, les réglages requis (température, teneur en gaz, humidité) doivent être stabilisés pendant quelques heures ou toute la nuit. Pour ce faire, démarrez le bioréacteur et le logiciel, puis cliquez sur Modifier les points de consigne sous l’élément de menu « Incubateur ».</li>
	<li>Préchauffer le PBS et le milieu requis (milieu de croissance des cellules endothéliales complété par les suppléments fournis hEGF-5, HC-500 ainsi que 5 % de sérum de veau fœtal appauvri en exosomes, 1 % de pénicilline/streptomycine) (voir tableau des matériaux) jusqu’à 37 °C. ​</li>
</ol>2. Dissection d’un échantillon placentaire
<ol><li>Immédiatement après l’accouchement, prélevez trois fois 2 cm 3 échantillons placentaires dans la région médio-placentaire, comme décrit dans Kupper etcoll.3 Brièvement, conservez les échantillons dans le PBS. Éliminez la plaque choriale, les caduques maternelles et les zones d’infarctus visibles de l’échantillon.</li>
	<li>Disséquer le reste de l’échantillon de tissu en explants villeux d’un diamètre de section transversale d’environ 0,5 cm (poids humide d’environ 7,5 mg). Transférez-les dans une boîte de Pétri avec du PBS frais.</li>
	<li>Lavez les explants dans du PBS en les secouant doucement dans le liquide avec une pince à épiler pour éliminer les résidus de sang. REMARQUE : Disséquez les échantillons dans une boîte de Pétri avec du PBS pour les prélaver et les empêcher de se dessécher et utilisez des outils stérilisés/autoclavés pour traiter les tissus.</li>
</ol>3. Expérience d’écoulement
<ol><li>Sous une hotte stérile, connectez cinq chambres en série à la bouteille réservoir à l’aide des verrous Luer conformément au manuel d’utilisation des chambres d’écoulement (voir tableau des matériaux). REMARQUE : Stérilisez et/ou autocchez tous les matériaux avant utilisation, conformément au manuel respectif. Utilisez un filtre à air sur le flacon-réservoir pour un échange gazeux stérile. Pour ouvrir et fermer les chambres, pressez doucement les pattes des chambres. Étape 3.1. peut également être préparé plus tôt.</li>
	<li>Retournez les chambres et ouvrez-les en retirant le fond. Utilisez une pince pour transférer les plaques métalliques au centre de la partie supérieure des chambres avec les goupilles pointant vers le haut.</li>
	<li>Remplir les chambres avec 1 mL de milieu préchauffé (37 °C). Remplissez ensuite le réservoir avec 20 ml supplémentaires. Le circuit nécessite un total de 25 mL, y compris le volume dans chaque chambre d’écoulement, dans les tubes et la bouteille réservoir. Sous l’écoulement, le volume final du milieu dans une chambre remplie est de 2 mL.</li>
	<li>Utilisez une pince et transférez un explant villeux après l’autre entre les aiguilles de la plaque métallique dans la chambre. Laissez glisser les aiguilles entre les villosités placentaires pour éviter la perforation du tissu. Transférez quatre explants dans une chambre. Fermez les chambres en remettant le fond en place avec précaution. Un circuit complet contient un total de 20 explants. Les chambres doivent rester à l’envers. REMARQUE : Saisissez doucement les explants avec la pince ; Essayez de ne pas les serrer. Assurez-vous que les chambres et le circuit sont complètement scellés pour éviter les fuites. Les chambres sont toujours utilisées à l’envers. Le nombre d’explants par chambre et le nombre de chambres elles-mêmes sont variables. La procédure pour le tissu du premier trimestre est similaire à celle du tissu du troisième trimestre avec un petit ajout : pour fixer les villosités, pliez légèrement les aiguilles sur les explants après que le tissu a été transféré sur la plaque métallique (communication personnelle Brugger et al.). Cela permet de fixer les tissus fragiles sur la plaque métallique et d’éviter que les échantillons ne glissent.</li>
	<li>Transférez l’ensemble d’écoulement dans le bioréacteur.</li>
	<li>Connectez le circuit d’écoulement à la pompe péristaltique à l’intérieur du bioréacteur en connectant le tube de la pompe à la pompe. Fixez-le sur la 4èmeétape ( on l’entendra cliquer quatre fois).</li>
	<li>Si un contrôle statique est nécessaire, placez également la plaque de puits dans le bioréacteur. NOTA : Pour la culture statique, cinq puits d’une plaque à six puits sont remplis de 4 mL de milieu par puits et de 4 explants de villes par puits. La plaque de puits remplie est également placée dans le bioréacteur et cultivée dans la même atmosphère que les explants de culture en flux. De plus amples détails sont décrits dans Kupper et al.3</li>
	<li>Réglez le mode de pompe sur Manuel sous l’élément de menu « Pompes ». Réglez ensuite la vitesse de la pompe à 1 mL/min et commencez à pomper le fluide dans le tube en cliquant sur Exécuter. Pendant que le circuit est rempli de fluide, tenez les chambres à un angle de manière à ce qu’elles soient complètement remplies de fluide. NOTA : Voir le tableau supplémentaire 1 pour les paramètres expérimentaux de l’écoulement villeux placentaire et de la culture statique. Les spécifications du système d’écoulement et du système statique sont fournies dans le tableau supplémentaire 2. ATTENTION : Inclinez soigneusement la chambre pendant le remplissage pour éviter que les échantillons ne glissent des aiguilles.</li>
	<li>Une fois le remplissage terminé, les chambres restent à l’envers. Assurez-vous que les chambres sont bien droites et bien droites, et fermez les deux couvercles du bioréacteur. REMARQUE : Le volume final du fluide dans une chambre d’écoulement remplie est de 2 mL. Les paramètres expérimentaux et les spécifications des chambres d’écoulement et des plaques de puits utilisées dans les expériences sont décrits dans Kupper et al.3</li>
	<li>Incubez le tissu pendant le temps souhaité. REMARQUE : La température, le niveau de gaz et le débit peuvent être surveillés sur l’ordinateur sans ouvrir à nouveau le couvercle du bioréacteur.</li>
	<li>Arrêtez la pompe après l’incubation du tissu pendant le temps souhaité en cliquant sur Abandonner sous l’élément de menu « Pompes ». Ouvrez les deux couvercles du bioréacteur, puis une chambre d’écoulement à la fois. Retirez délicatement les explants de la plaque métallique à l’aide d’une pince.</li>
	<li>Traiter le tissu et le surnageant selon l’analyse en aval sélectionnée. Dans ce cas, une coloration immunohistochimique et une microscopie électronique ont été réalisées3. Voir le tableau supplémentaire 3 pour plus de détails sur les anticorps utilisés pour l’immunohistochimie et l’immunofluorescence. REMARQUE : Après avoir retiré le tissu, vidangez le fluide du circuit en tournant la pompe dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.</li>
	<li>Démontez et nettoyez le circuit d’écoulement conformément aux instructions du fabricant pour les chambres d’écoulement et les tuyaux.</li>
</ol>

Improving Ex Vivo Placental Explant Culture Using a Flow-Based Approach

<ol>
	<li>Villee, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolism+of+human+placenta+in+vitro.">The metabolism of human placenta in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 205 (1), 113-123 (1953).</li><li>Miller, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+placental+explants+in+culture:+Approaches+and+assessments.">Human placental explants in culture: Approaches and assessments.</a> Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).</li><li>Kupper, N., Pritz, E., Siwetz, M., Guettler, J., Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+villous+explant+culture+2.0:+flow+culture+allows+studies+closer+to+the+in+vivo+situation.">Placental villous explant culture 2.0: flow culture allows studies closer to the in vivo situation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7464 (2021).</li><li>Reti, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+high+oxygen+on+placental+function+in+short-term+explant+cultures.">Effect of high oxygen on placental function in short-term explant cultures.</a> Cell and Tissue Research. 328 (3), 607-616 (2007).</li><li>Sim&#225;n, C. M., Sibley, C. P., Jones, C. J. P., Turner, M. A., Greenwood, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+regeneration+of+syncytiotrophoblast+in+cultured+explants+of+term+placenta.">The functional regeneration of syncytiotrophoblast in cultured explants of term placenta.</a> American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 280 (4), R1116-R1122 (2001).</li><li>Toro, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+is+an+anti-apoptotic+effector+in+placental+cells+involving+p53+downregulation.">Leptin is an anti-apoptotic effector in placental cells involving p53 downregulation.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99187 (2014).</li><li>Morley, L. C., Debant, M., Walker, J. J., Beech, D. J., Simpson, N. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+blood+flow+sensing+and+regulation+in+fetal+growth+restriction.">Placental blood flow sensing and regulation in fetal growth restriction.</a> Placenta. 113, 23-28 (2021).</li><li>Wang, Y. Z. S., Wang, Y., Zhao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+blood+circulation.">Placental blood circulation.</a> Vascular biology of the placenta. Chapter 2, (2010).</li><li>Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+of+the+normal+placenta.">The anatomy of the normal placenta.</a> Journal of Clinical Pathology. 61 (12), 1296-1302 (2008).</li><li>Weiss, G., Sundl, M., Glasner, A., Huppertz, B., Moser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trophoblast+plug+during+early+pregnancy:+a+deeper+insight.">The trophoblast plug during early pregnancy: a deeper insight.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (6), 749-756 (2016).</li><li>Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+and+physiological+consequences+of+conversion+of+the+maternal+spiral+arteries+for+uteroplacental+blood+flow+during+human+pregnancy.">Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy.</a> Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).</li><li>Gude, N. M., Roberts, C. T., Kalionis, B., King, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+function+of+the+normal+human+placenta.">Growth and function of the normal human placenta.</a> Thrombosis Research. 114 (5-6), 397-407 (2004).</li><li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+biology+of+the+placenta.">Vascular biology of the placenta.</a> Colloquium Series on Integrated Systems Physiology: From Molecule to Function. 2 (1), 1-98 (2010).</li><li>Moser, G., Windsperger, K., Pollheimer, J., de Sousa Lopes, S. C., Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+trophoblast+invasion:+new+and+unexpected+routes+and+functions.">Human trophoblast invasion: new and unexpected routes and functions.</a> Histochemistry and Cell Biology. 150 (4), 361-370 (2018).</li><li>Kupper, N., Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endogenous+exposome+of+the+pregnant+mother:+Placental+extracellular+vesicles+and+their+effect+on+the+maternal+system.">The endogenous exposome of the pregnant mother: Placental extracellular vesicles and their effect on the maternal system.</a> Molecular Aspects of Medicine. 87 (October 2020), 100955 (2022).</li><li>Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFPA+award+in+placentology+lecture:+biology+of+the+placental+syncytiotrophoblast+-+myths+and+facts.">IFPA award in placentology lecture: biology of the placental syncytiotrophoblast - myths and facts.</a> Placenta. 31 (SUPPL), S75-S81 (2010).</li><li>Gauster, M., Moser, G., Wernitznig, S., Kupper, N., Huppertz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+human+trophoblast+development:+from+morphology+to+function.">Early human trophoblast development: from morphology to function.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (6), 345 (2022).</li><li>Lecarpentier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+stress+promotes+placental+growth+factor+upregulation+in+human+syncytiotrophoblast+through+the+cAMP-pKA+signaling+pathway.">Fluid shear stress promotes placental growth factor upregulation in human syncytiotrophoblast through the cAMP-pKA signaling pathway.</a> Hypertension. 68 (6), 1438-1446 (2016).</li><li>Lecarpentier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+fluid+dynamic+simulations+of+maternal+circulation:+wall+shear+stress+in+the+human+placenta+and+its+biological+implications.">Computational fluid dynamic simulations of maternal circulation: wall shear stress in the human placenta and its biological implications.</a> PLOS ONE. 11 (1), e0147262 (2016).</li><li>Miura, S., Sato, K., Kato-Negishi, M., Teshima, T., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+shear+triggers+microvilli+formation+via+mechanosensitive+activation+of+TRPV6.">Fluid shear triggers microvilli formation via mechanosensitive activation of TRPV6.</a> Nature Communications. 6 (1), 8871 (2015).</li><li>Jauniaux, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+maternal+arterial+blood+flow+and+placental+oxidative+stress.">Onset of maternal arterial blood flow and placental oxidative stress.</a> The American Journal of Pathology. 157 (6), 2111-2122 (2000).</li><li>Sodha, R. J., Proegler, M., Schneider, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+and+metabolism+of+norepinephrine+studied+from+maternal-to-fetal+and+fetal-to-maternal+sides+in+the+in+vitro+perfused+human+placental+lobe.">Transfer and metabolism of norepinephrine studied from maternal-to-fetal and fetal-to-maternal sides in the in vitro perfused human placental lobe.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 148 (4), 474-481 (1984).</li><li>Kupper, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Extracellular vesicles from advanced placental explant flow culture and their role in preeclampsia [Dissertation]. , (2022).</li><li>Burton, G. J., Fowden, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+placenta:+a+multifaceted,+transient+organ.">The placenta: a multifaceted, transient organ.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1663), 20140066 (2015).</li><li>Arora, N., Sadovsky, Y., Dermody, T. S., Coyne, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+vertical+transmission+during+human+pregnancy.">Microbial vertical transmission during human pregnancy.</a> Cell Host &amp; Microbe. 21 (5), 561-567 (2017).</li><li>Cheong, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Positive+feedback+loop+between+glial+cells+missing+1+and+human+chorionic+gonadotropin+(hCG)+regulates+placental+hCG&#946;+expression+and+cell+differentiation.">A Positive feedback loop between glial cells missing 1 and human chorionic gonadotropin (hCG) regulates placental hCG&#946; expression and cell differentiation.</a> Molecular and Cellular Biology. 36 (1), 197-209 (2016).</li><li>Heisenberg, C. P., Bella&#239;che, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+in+tissue+morphogenesis+and+patterning.">Forces in tissue morphogenesis and patterning.</a> Cell. 153 (5), 948-962 (2013).</li><li>Lee, T. C., Moulvi, A., James, J. L., Clark, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+modelling+of+shear+stress+on+the+syncytiotrophoblast:+could+maternal+blood+flow+impact+placental+function+across+gestation.">Multi-scale modelling of shear stress on the syncytiotrophoblast: could maternal blood flow impact placental function across gestation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 51 (6), 1256-1269 (2023).</li><li>Kluge, M. A., Fetterman, J. L., Vita, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+and+endothelial+function.">Mitochondria and endothelial function.</a> Circulation Research. 112 (8), 1171-1188 (2013).</li><li>Boren, J., Brindle, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-induced+mitochondrial+dysfunction+causes+cytoplasmic+lipid+droplet+formation.">Apoptosis-induced mitochondrial dysfunction causes cytoplasmic lipid droplet formation.</a> Cell Death &amp; Differentiation. 19 (9), 1561-1570 (2012).</li><li>Chernyavsky, I. L., Jensen, O. E., Leach, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mathematical+model+of+intervillous+blood+flow+in+the+human+placentone.">A Mathematical model of intervillous blood flow in the human placentone.</a> Placenta. 31 (1), 44-52 (2010).</li></ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Cette étude présente une perspective unique sur une technique de culture en flux pour les explants placentaires conçue pour reproduire la dynamique de l’environnement in utero 3,23. Les résultats révèlent que la morphologie des tissus cultivés dans des conditions d’écoulement est mieux préservée par rapport à la méthode traditionnelle de culture statique3. Notamment, même si ni les conditions de culture statique ni les conditions de culture en flux ne facilitent la perfusion des vaisseaux placentaires, la destruction des vaisseaux sanguins fœto-placentaires à l’intérieur du stroma villeux a été principalement observée en culture statique, alors que l’intégrité des vaisseaux sanguins semblait être mieux maintenue sur une plus longue durée en culture en flux3.
Une explication possible de cette observation pourrait être liée au rôle protecteur et endocrinien crucial du syncytiotrophoblaste, une fonction bien documentée dans la littérature 12,24,25,26. Compte tenu de cela, il est concevable que l’intégrité globale de la couche externe des villosités contribue de manière significative au maintien du stroma sous-jacent, y compris les vaisseaux sanguins. Par conséquent, l’intégrité cellulaire soutenue des vaisseaux sanguins dans des conditions d’écoulement pourrait être attribuée à l’écoulement continu du milieu. Ce mouvement facilite le mouvement passif des explants, facilitant l’échange de gaz, de nutriments et de nanoparticules (comme les vésicules extracellulaires) à travers la barrière placentaire. Ceci, à son tour, pourrait avoir un impact positif sur la préservation de la morphologie des vaisseaux sanguins. De plus, le phénomène de mécanosensation joue un rôle dans la morphogenèse tissulaire à travers divers tissus27,28. Des études ont démontré que la mécanosensibilité influence les processus cellulaires à plusieurs niveaux, déclenchant une gamme de réponses biochimiques qui influencent finalement la fonctionnalité des tissus et des organes29. Notamment, les protéines mécanosensibles sont exprimées par le syncytiotrophoblaste tout au long de la gestation28. De plus, l’étude suggère que les microvillosités à la surface des tissus peuvent être impliquées dans ce contexte28.
Une autre perspective qui mérite d’être prise en compte est le rôle potentiel des mitochondries dans la réponse cellulaire au flux. Par exemple, dans les cellules endothéliales, les mitochondries servent de transducteurs de signaux pour les réponses cellulaires aux stimuli environnementaux30. L’accumulation accrue de gouttelettes lipidiques, observée dans les tissus en culture statique par TEM3, a été associée à l’induction de l’apoptose en raison d’un dysfonctionnement mitochondrial31. D’autres recherches sont nécessaires pour dévoiler les mécanismes sous-jacents et les facteurs clés, en les reliant aux voies de signalisation en aval. Cette exploration pourrait améliorer notre compréhension de la façon dont le tissu perçoit et réagit à la contrainte de cisaillement, ce qui se traduirait par une amélioration de la viabilité et de l’intégrité des explants villeux en culture23.
Plusieurs étapes critiques du protocole doivent être réitérées et exécutées avec soin. Après l’expulsion placentaire, les tissus doivent être mis en culture le plus rapidement possible. Lors de la préparation de l’explantation, il est crucial d’éviter les zones présentant des infarctus visibles. Il est important de manipuler délicatement les explants avec des pinces pour éviter qu’ils ne se serrent. Il est recommandé de garder le tissu recouvert de liquide tout au long de la procédure et de le mener rapidement.
Il est important de reconnaître que cette étude n’est pas en mesure de spécifier la contrainte de cisaillement exacte dans le système d’écoulement présenté, ce qui devrait être considéré comme une limitation dans les recherches futures 3,23. Néanmoins, il est important de reconnaître que la vitesse d’écoulement précise et la contrainte de cisaillement pour un villosité placentaire spécifique in vivo sont influencées par de nombreux paramètres, tels que les caractéristiques géométriques de l’espace intervilleux, l’emplacement des villosités dans cet espace, ainsi que sa proximité et son angle avec les artères spirales maternelles et les veines utérines 3,19,23,32 . La complexité de la structure géométrique du placenta, qui varie d’un individu à l’autre, doit également être prise en compte23,32. Il existe déjà des modèles mathématiques estimant le flux sanguin dans l’espace intervilleux32 et des calculs sur la contrainte de cisaillement de la paroi sur le syncytiotrophoblaste 19,28. Il est intéressant de noter qu’une étude a prédit que la contrainte de cisaillement sur le syncytiotrophoblaste est plus faible au troisième trimestre par rapport au premier trimestre28, tandis qu’une autre a démontré une contrainte de cisaillement de paroi spatialement hétérogène sur le syncytiotrophoblaste19. Déterminer avec précision la vitesse d’écoulement et la contrainte de cisaillement pour une villosité placentaire spécifique reste un défi 3,19,23,32. De tels calculs offrent une approximation de la plage de contrainte de cisaillement pour des études futures, mais ils peuvent nécessiter des ajustements anatomiques continus et une optimisation23. De plus, les études futures pourraient mettre au point des techniques de culture en flux continu nouvelles et raffinées qui tiennent compte de la géométrie complexe de l’espace intervilleux et des stratégies pour augmenter le nombre de spécimens par expérience3. On s’attend à ce que le système d’écoulement progresse et se développe, avec l’utilisation possible d’autres chambres d’écoulement (Brugger et coll., données inédites, 2023).
En conclusion, cette étude jette des bases solides en démontrant une technique de culture ex vivo en flux facilement réalisable qui maintient l’intégrité structurelle des explants de villes en culture. Il souligne l’importance des techniques dynamiques dans les études de biologie fonctionnelle placentaire, ouvrant la voie à de nouvelles avancées dans les systèmes de culture en flux et à la génération de nouvelles idées et hypothèses 3,23.

Depuis les années 1960, la culture d’explants placentaires au fond d’une plaque de puits est utilisée pour étudier l’interface fœto-maternelle 1,2,3. Cette méthode est bien établie et simple, permettant l’utilisation de tissus humains pour diverses études, en plus des cultures de cellules individuelles 2,3. Au fil du temps, les plans expérimentaux pour les cultures d’explants placentaires ont été modifiés en ce qui concerne la concentration en oxygène4 et pour empêcher le tissu de se déposer au fond de la plaque du puits 2,5,6. Cependant, cette méthode n’a pas été adaptée aux conditions in vivo dans l’utérus, en particulier la présence d’un flux constant3.
Le succès d’une grossesse dépend d’une perfusion adéquate et constante de l’espace intervilleux avec le sang maternel, établissant un circuit dynamique avec un flux et un écoulement continus de sang et de substances transmissibles par le sang 7,8,9,10,11,12. Le placenta comporte deux systèmes d’approvisionnement en sang distincts, l’un pour le sang maternel et l’autre pour le sang fœtal, ce qui entraîne une double perfusion par les systèmes fœtal et maternel13. Le sang maternel commence à perfuser l’espace intervilleux du placenta à la fin du premier trimestre, s’écoulant lentement à travers les artères spirales utérines élargies10,11,14. Par conséquent, les villosités placentaires sont baignées dans le sang maternel, fournissant des nutriments et de l’oxygène au fœtus. Ce sang maternel circule dans l’espace intervilleux avant de retourner dans la circulation maternelle via les veines utéroplacentaires. Lors de son passage dans l’espace intervilleux, la diffusion et l’absorption active de l’oxygène et des nutriments dans le sang fœtal entraînent une baisse des niveaux d’oxygène et de nutriments dans le sang maternel12,15. Cependant, le sang de l’espace intervilleux est entièrement remplacé par du sang frais et riche en oxygène environ deux à trois fois par minute, ce qui assure un apport continu de nutriments et de gaz13. Notamment, le syncytiotrophoblaste, la partie la plus externe de la barrière placentaire, est le seul composant de l’arbre villeux placentaire directement exposé au sang maternel15,16,17. Par conséquent, le syncytiotrophoblaste subit une légère contrainte de cisaillement constante de la part du sang maternelqui coule 3,14.
Les connaissances scientifiques actuelles concernant l’environnement du flux placentaire et les progrès techniques modernes permettent maintenant une culture adaptée et physiologiquement approximative des explants placentaires dans des conditions d’écoulement. De plus, les preuves suggèrent que les forces de cisaillement influencent les fonctions biologiques du syncytiotrophoblaste 18,19,20,21. Une approche bien connue qui tient compte du flux sanguin est le système de perfusion placentaire à double lobe22. Cependant, ces expériences nécessitent une expertise importante, sont limitées dans le temps (menées pendant quelques heures seulement) et ne sont réalisables qu’avec des échantillons placentaires du troisième trimestre 3,23. En revanche, nous avons développé une technique simple et non intrusive pour la culture ex vivo d’explants de villes placentaires dans des contextes de débit constant, s’adaptant à la fois aux tissus placentaires du premier et du troisième trimestre3. Dans cette configuration, les explants placentaires sont cultivés dans cinq chambres d’écoulement connectées en série. Les explants villeux sont fixés au fond de la chambre à l’aide d’élévations en forme d’aiguille sur de fines plaques métalliques. Le circuit d’écoulement construit est ensuite transféré dans un bioréacteur, où la concentration d’oxygène et le débit sont régulés3. Les résultats de la culture en flux démontrent que l’intégrité des tissus est mieux préservée par rapport à la méthode statique généralement utilisée3. De plus, cette approche dynamique permet d’obtenir des plans expérimentaux nouveaux et adaptés pour la culture d’explants tissulaires, ce qui permet des expériences in vitro qui imitent plus fidèlement l’environnement naturel3.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21422</td>
			<td>Diluted in PBS, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody diluent</td>
			<td>Dako, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>S3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin (AC-15)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>ab6276</td>
			<td>Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioreactor TEB500</td>
			<td>TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 Class II (QBEnd-10)</td>
			<td>Dako, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>M7165</td>
			<td>Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPD 030 critically point dryer</td>
			<td>Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein)</td>
			<td></td>
			<td>Critically point dryer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>D21490</td>
			<td>Diluted in PBS, 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebers TEB505 Series Software</td>
			<td>TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Series Software 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV</td>
			<td>PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany;&#160;</td>
			<td>C-22120</td>
			<td>Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelsior AS Tissue Processor&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A2720803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histolab Clear</td>
			<td>Histolab, Askim, Sweden</td>
			<td>14250-TY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Block</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>TA125H202Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaiser&#8217;s Glycerin Gelatine</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1092420100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM 6000 B microscope</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with an Olympus DP 72 Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal plate with needles</td>
			<td>In-house construction</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome&#160;</td>
			<td>Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Miele, Guetersloh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope&#160; (BX63)</td>
			<td>Olympus, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Serial Number: 1A52421</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>2585627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody enhancer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>TL-125-PB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pumping tube</td>
			<td>Tygon, Bartelt, Graz, Austria</td>
			<td>6.078 175</td>
			<td>&#160;1.02 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QV500 Flow chambers</td>
			<td>Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK</td>
			<td>QV500&#160;</td>
			<td>Other chambers would work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCD 500, sputter coater</td>
			<td>Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein</td>
			<td></td>
			<td>Sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>ab64252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides&#160;</td>
			<td>Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter</td>
			<td>Corning Incorporated, NY, USA</td>
			<td>431219</td>
			<td>0.2 &#181;m Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAAB epoxy resin</td>
			<td>Agar Scientific, Stansted, Essex, UK</td>
			<td>T001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>TL-125-HL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraVision Protein Block</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>TA125BPQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss EM 900 transmission electron microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope</td>
			<td>Zeiss, Cambridge, UK</td>
			<td></td>
			<td>Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo placental explant flow culture - mimicking the dynamic conditions in utero

Les modèles existants de culture d’explants placentaires ex vivo sont principalement basés sur des systèmes de culture statique utilisant des plaques de puits. Cependant, ces modèles ne reflètent pas de manière adéquate la dynamique in utero , où le placenta subit une légère contrainte de cisaillement constante due au plasma ou au flux sanguin. Pour remédier à cette limitation, un système de culture en flux a été conçu pour rapprocher la culture ex vivo d’explants placentaires des conditions d’écoulement in utero rencontrées dans le corps maternel. Dans le cadre de cette approche, les explants placentaires sont cultivés dans une séquence de cinq chambres d’écoulement interconnectées. Ce réglage permet de maintenir les concentrations physiologiques d’oxygène et un débit constant. Les données recueillies révèlent que dans des conditions d’écoulement, la préservation de la morphologie tissulaire présente une amélioration notable par rapport aux méthodes statiques conventionnelles. Cette technique innovante introduit un moyen simple de culture d’explants placentaires ex vivo, offrant une représentation plus fidèle de l’environnement dynamique in vivo . De plus, cette étude introduit de nouvelles possibilités pour étudier la dynamique fonctionnelle de l’interface fœto-maternelle. En adoptant des méthodologies dynamiques réalisables, une compréhension plus approfondie de la biologie placentaire est facilitée, soulignant sa pertinence pour la santé materno-fœtale.

Ex Vivo Placental Explant Flow Culture - Mimicking the Dynamic Conditions In Utero

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Research Through Single Cell Sequencing and Spatial Histology in Placental Tissues at JoVE.com

Advancing Research Through Single Cell Sequencing and Spatial Histology in Placental Tissues (Video) | JoVE

Voici un protocole pour la culture d’explants placentaires dans des conditions de débit constant. Cette approche améliore les systèmes traditionnels de culture de villes statiques en permettant la réplication d’environnements physiologiques dynamiques.

Ex Vivo Culture en flux d’explants placentaires - Imiter les conditions dynamiques in utero

The existing ex vivo placental explant culture models are primarily grounded in static culture systems using well plates. However, these models ...

Nous essayons de découvrir pourquoi certaines femmes enceintes développent une prééclampsie et d’autres non. Ce syndrome spécifique à la grossesse provoque une hypertension et une protéinurie de la mère et peut entraîner la mort de la mère et de l’enfant. Grâce à notre recherche translationnelle, nous espérons identifier les causes placentaires à l’origine des symptômes maternels.Récemment, des approches de séquençage de l’ARN unicellulaire ont été utilisées pour identifier les différences entre les placentas sains et pré-éclamptiques. Vient maintenant le temps de relier ces données avec les tissus d’origine. C’est pourquoi nous utilisons l’histologie spatiale et le séquençage en institut pour identifier les changements au niveau de la cellule unique.La complexité individuelle de la structure géométrique du placenta présente un défi pour déterminer la vitesse d’écoulement exacte et la contrainte de cisaillement pour une villosité placentaire donnée. Avec l’utilisation de ce système de culture en flux, l’importance de la force de cisaillement sur les fonctions biologiques des tissus placentaires peut être abordée et étudiée.