Name: Advancing Research Through Single Cell Sequencing and Spatial Histology in Placental Tissues (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-09-08T14:05:00
Duration: 1 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advancing Research Through Single Cell Sequencing and Spatial Histology in Placental Tissues at JoVE.com

लेखक कृतज्ञतापूर्वक ऊतक नमूनाकरण के लिए बेट्टीना एमटमैन और पेट्रा विंकलर के उत्कृष्ट तकनीकी समर्थन की सराहना करते हैं। इस शोध को ऑस्ट्रियाई साइंस फंड एफडब्ल्यूएफ (डीओसी 31-बी 26) और मेडिकल यूनिवर्सिटी ऑफ ग्राज़, ऑस्ट्रिया द्वारा पीएचडी प्रोग्राम इंफ्लेमेटरी डिसऑर्डर इन प्रेग्नेंसी (डीपी-आईडीपी) के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था।

ग्राज़ के मेडिकल यूनिवर्सिटी की आचार समिति ने इस अध्ययन को मंजूरी दे दी (31-019 पूर्व 18/19 संस्करण 1.2 और 29-319 पूर्व 16/17)। अध्ययन में शामिल सभी विषयों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी।
1. प्रवाह प्रयोग के लिए तैयारी
नोट: प्रयोगों एकीकृत क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंपों ( सामग्री की तालिका) के साथ एक बायोरिएक्टर में आयोजित कर रहे हैं. बायोरिएक्टर के अंदर आर्द्रता, तापमान और गैस के स्तर को समायोजित किया जा सकता है।
<ol><li>बायोरिएक्टर चालू करें और बायोरिएक्टर के मैनुअल के अनुसार प्रयोग के लिए सभी पूर्व-व्यवस्था (जैसे, पंपों का अंशांकन, पूर्व-वार्मिंग, गैस की स्थिति और आर्द्रता) करें। प्रयोग शुरू करने से पहले, आवश्यक सेटिंग्स (तापमान, गैस सामग्री, आर्द्रता) को कुछ घंटों या रात भर के लिए स्थिर किया जाना चाहिए। ऐसा करने के लिए, बायोरिएक्टर और सॉफ्टवेयर शुरू करें और फिर मेनू आइटम "इनक्यूबेटर" के तहत चेंज सेटपॉइंट्स पर क्लिक करें।</li>
	<li>प्री-वार्म पीबीएस और आवश्यक माध्यम (एंडोथेलियल सेल ग्रोथ मीडियम प्रदान किए गए पूरक एचईजीएफ -5, एचसी -500 के साथ-साथ 5% एक्सोसोम-समाप्त भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) ( सामग्री की तालिकादेखें) से 37 डिग्री सेल्सियस। ​</li>
</ol>2. प्लेसेंटल नमूना विच्छेदन
<ol><li>प्रसव के तुरंत बाद, मध्य अपरा क्षेत्र से तीन बार 2 सेमी 3 अपरा के नमूनों को काट लें जैसा कि कुपर एटअल.3 में वर्णित है संक्षेप में, नमूनों को पीबीएस में रखें। कोरियोनिक प्लेट, मातृ decidua और नमूना से दिखाई रोधगलन के क्षेत्रों त्यागें.</li>
	<li>शेष ऊतक नमूने को लगभग 0.5 सेमी (लगभग 7.5 मिलीग्राम का गीला वजन) के क्रॉस-सेक्शनल व्यास के साथ विलस एक्सप्लांट्स में विच्छेदित करें। उन्हें ताजा पीबीएस के साथ एक पेट्री डिश में स्थानांतरण.</li>
	<li>पीबीएस में एक्सप्लांट्स को धीरे-धीरे रक्त अवशेषों को हटाने के लिए चिमटी के साथ तरल में हिलाकर धो लें। नोट: पीबीएस के साथ पेट्री डिश में नमूनों को पूर्व-धोने के लिए विच्छेदन करें और उन्हें सूखने से रोकें और ऊतक प्रसंस्करण के लिए निष्फल/आटोक्लेव उपकरण का उपयोग करें।</li>
</ol>3. प्रवाह प्रयोग
<ol><li>एक बाँझ हुड के तहत, प्रवाह कक्षों के उपयोगकर्ता मैनुअल के अनुसार luer ताले का उपयोग करके जलाशय की बोतल में श्रृंखला में पांच कक्षों को कनेक्ट करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। नोट: संबंधित मैनुअल के अनुसार, उपयोग करने से पहले सभी सामग्रियों को स्टरलाइज़ और/या आटोक्लेव करें। बाँझ गैस विनिमय के लिए जलाशय की बोतल पर एक एयर फिल्टर का उपयोग करें। कक्षों को खोलने और बंद करने के लिए, धीरे से कक्षों के लग्स में निचोड़ें। चरण 3.1. पहले भी तैयार किया जा सकता है।</li>
	<li>कक्षों को उल्टा कर दें और नीचे को हटाकर उन्हें खोलें। ऊपर की ओर इशारा करते हुए पिन के साथ कक्षों के शीर्ष भाग में केंद्रीय धातु प्लेटों हस्तांतरण संदंश का प्रयोग करें.</li>
	<li>पूर्व-गर्म माध्यम (37 डिग्री सेल्सियस) के 1 एमएल के साथ कक्षों को भरें। फिर जलाशय को अतिरिक्त 20 एमएल से भरें। सर्किट को कुल 25 एमएल की आवश्यकता होती है, जिसमें प्रत्येक प्रवाह कक्ष में मात्रा, ट्यूबों और जलाशय की बोतल शामिल है। प्रवाह के तहत, एक भरे हुए कक्ष में माध्यम की अंतिम मात्रा 2 एमएल है।</li>
	<li>संदंश का प्रयोग करें और कक्ष में धातु की थाली की सुइयों के बीच एक के बाद एक villous explant हस्तांतरण. ऊतक के पंचर से बचने के लिए सुइयों को अपरा विली के बीच स्लाइड करने दें। चार एक्सप्लांट को एक कक्ष में स्थानांतरित करें। नीचे सावधानी से refitting द्वारा कक्षों बंद करें. एक पूर्ण सर्किट में कुल 20 एक्सप्लांट होते हैं। कक्षों को उल्टा स्थिति में रहने की जरूरत है। नोट: संदंश के साथ धीरे explants समझ; उन्हें निचोड़ने की कोशिश न करें। सुनिश्चित करें कि रिसाव को रोकने के लिए कक्षों और सर्किट को पूरी तरह से सील कर दिया गया है। कक्षों का उपयोग हमेशा उल्टा किया जाता है। प्रति कक्ष एक्सप्लांट की संख्या और कक्षों की संख्या स्वयं परिवर्तनशील हैं। पहली-तिमाही ऊतक के लिए प्रक्रिया एक छोटे से जोड़ के साथ तीसरे-तिमाही ऊतक के समान है: विली को ठीक करने के लिए, ऊतक को धातु की प्लेट में स्थानांतरित करने के बाद एक्सप्लांट पर सुइयों को थोड़ा मोड़ें (व्यक्तिगत संचार ब्रुगर एट अल। यह धातु की प्लेट पर नाजुक ऊतक को ठीक करता है और नमूनों को फिसलने से रोकता है।</li>
	<li>प्रवाह विधानसभा को बायोरिएक्टर में स्थानांतरित करें।</li>
	<li>पंप टयूबिंग को पंप से जोड़कर बायोरिएक्टर के भीतर प्रवाह सर्किट को क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप से कनेक्ट करें। इसे 4वें चरण पर ठीक करें (एक इसे चार बार क्लिक करते हुए सुनेगा)।</li>
	<li>यदि एक स्थिर नियंत्रण की आवश्यकता है, तो अच्छी तरह से प्लेट को बायोरिएक्टर में भी रखें। नोट: स्थैतिक संस्कृति के लिए, छह-अच्छी प्लेट के पांच कुओं को प्रति अच्छी तरह से मध्यम के 4 एमएल और प्रति अच्छी तरह से 4 विलस एक्सप्लांट्स से भरा जाता है। भरी हुई अच्छी प्लेट को बायोरिएक्टर में भी रखा जाता है और उसी वातावरण में सुसंस्कृत किया जाता है जैसे प्रवाह संस्कृति का उत्सर्जन होता है। अधिक विवरण कुपर एट अल में वर्णित हैं।</li>
	<li>मेनू आइटम "पंप्स" के तहत पंप मोड को मैनुअल पर सेट करें। फिर पंप की गति को 1 एमएल/मिनट पर सेट करें और रन पर क्लिक करके माध्यम को टयूबिंग में पंप करना शुरू करें। जबकि सर्किट को माध्यम से भरा जा रहा है, कक्षों को एक कोण पर पकड़ें ताकि वे पूरी तरह से माध्यम से भर जाएं। नोट: अपरा विलस प्रवाह और स्थिर संस्कृति के लिए प्रयोगात्मक सेटिंग्स के लिए पूरक तालिका 1 देखें। प्रवाह और स्थैतिक प्रणाली के विनिर्देश पूरक तालिका 2 में प्रदान किए गए हैं। चेतावनी: सुइयों से फिसलने से नमूनों को रोकने के लिए भरने के दौरान कक्ष को सावधानी से झुकाएं।</li>
	<li>भरने के पूरा होने के बाद, कक्ष अपनी उल्टी स्थिति में रहते हैं। सुनिश्चित करें कि कक्ष सुरक्षित और सीधे खड़े हैं, और बायोरिएक्टर के दोनों ढक्कन बंद कर दें। नोट: एक भरे हुए प्रवाह कक्ष में माध्यम की अंतिम मात्रा 2 एमएल है। प्रयोगात्मक सेटिंग्स और प्रवाह कक्षों और अच्छी तरह से प्रयोगों में इस्तेमाल प्लेटों के विनिर्देशों Kupper एट अल 3 में वर्णित हैं</li>
	<li>वांछित समय के लिए ऊतक सेते हैं. नोट: बायोरिएक्टर के ढक्कन को फिर से खोले बिना कंप्यूटर पर तापमान, गैस स्तर और प्रवाह दर की निगरानी की जा सकती है।</li>
	<li>मेनू आइटम "पंप्स" के तहत गर्भपात पर क्लिक करके वांछित समय के लिए ऊतक के इनक्यूबेशन के बाद पंप बंद करो। बायोरिएक्टर के दो ढक्कन खोलें और फिर एक समय में एक प्रवाह कक्ष। ध्यान से संदंश का उपयोग धातु की थाली से explants हटा दें.</li>
	<li>चयनित बहाव विश्लेषण के अनुसार ऊतक और सतह पर तैरनेवाला प्रक्रिया. इस मामले में, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी3 प्रदर्शन किया गया. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के विवरण के लिए पूरक तालिका 3 देखें। नोट: ऊतक को हटाने के बाद, पंप के वामावर्त घुमाव द्वारा सर्किट से माध्यम को सूखा दें।</li>
	<li>प्रवाह कक्षों और टयूबिंग के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रवाह सर्किट को अलग और साफ करें।</li>
</ol>

Improving Ex Vivo Placental Explant Culture Using a Flow-Based Approach

<ol>
	<li>Villee, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolism+of+human+placenta+in+vitro.">The metabolism of human placenta in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 205 (1), 113-123 (1953).</li><li>Miller, R. 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लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

यह अध्ययन गर्भाशय पर्यावरण 3,23 में गतिशील को दोहराने के लिए डिज़ाइन किए गए प्लेसेंटल एक्सप्लांट्स के लिए एक प्रवाह संस्कृति तकनीक पर एक अद्वितीय परिप्रेक्ष्य का परिचय देता है। निष्कर्षों से पता चलता है कि प्रवाह की स्थिति के तहत सुसंस्कृत ऊतक की आकृति विज्ञान पारंपरिक स्थैतिक खेती विधि3 की तुलना में बेहतर संरक्षित है। विशेष रूप से, भले ही न तो स्थिर और न ही प्रवाह संस्कृति की स्थिति अपरा वाहिकाओं के छिड़काव की सुविधा, खलनायक स्ट्रोमा के अंदर भ्रूण-अपरा रक्त वाहिकाओं के विनाश मुख्य रूप से स्थिर संस्कृति में मनाया गया था, जबकि रक्त वाहिकाओं की अखंडता बेहतरप्रवाह संस्कृति 3 में एक लंबी अवधि से अधिक बनाए रखा जा करने के लिए दिखाई दिया.
इस अवलोकन के लिए एक संभावित स्पष्टीकरण syncytiothoblast की महत्वपूर्ण सुरक्षात्मक और अंतःस्रावी भूमिका से जोड़ा जा सकता है, एक समारोह साहित्य 12,24,25,26 में अच्छी तरह से प्रलेखित. इसे देखते हुए, यह बोधगम्य है कि विली की बाहरी परत की समग्र अखंडता रक्त वाहिकाओं सहित अंतर्निहित स्ट्रोमा के रखरखाव में महत्वपूर्ण योगदान देती है। नतीजतन, प्रवाह की स्थिति के तहत रक्त वाहिकाओं की निरंतर सेलुलर अखंडता को माध्यम के निरंतर प्रवाह के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। यह आंदोलन एक्सप्लांट्स की निष्क्रिय गति में सहायता करता है, जिससे प्लेसेंटल बाधा के पार गैसों, पोषक तत्वों और नैनोकणों (जैसे बाह्य पुटिकाओं) के आदान-प्रदान की सुविधा मिलती है। यह, बदले में, रक्त वाहिका आकृति विज्ञान के संरक्षण को सकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, mechanosensation की घटना विभिन्न ऊतकों27,28 भर में ऊतक morphogenesis में एक भूमिका निभाता है. अध्ययनों से पता चला है कि mechanosensitivity कई स्तरों पर सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित करता है, जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं है कि अंततः ऊतक और अंग कार्यक्षमता29 को प्रभावित की एक श्रृंखला ट्रिगर. विशेष रूप से, mechanosensitive प्रोटीन गर्भ28 भर syncytiotrophoblast द्वारा व्यक्त कर रहे हैं. इसके अलावा, अध्ययन से पता चलता है कि ऊतक की सतह पर माइक्रोविली इस संदर्भ28 में फंसाया जा सकता है.
विचार करने लायक एक अतिरिक्त परिप्रेक्ष्य प्रवाह के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया में माइटोकॉन्ड्रिया की संभावित भूमिका है। उदाहरण के लिए, एंडोथेलियल कोशिकाओं में, माइटोकॉन्ड्रिया पर्यावरणीय उत्तेजनाओं30 के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं के लिए सिग्नल ट्रांसड्यूसर के रूप में कार्य करते हैं। टीईएम3 के माध्यम से स्थिर सुसंस्कृत ऊतक में मनाया लिपिड बूंदों की वृद्धि संचय, माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता31 के कारण एपोप्टोसिस प्रेरण के साथ जुड़ा हुआ है। अंतर्निहित तंत्र और प्रमुख कारकों का अनावरण करने के लिए आगे की जांच आवश्यक है, उन्हें डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग मार्गों से जोड़ना। यह अन्वेषण हमारी समझ को बढ़ा सकता है कि ऊतक कैसे मानता है और कतरनी तनाव पर प्रतिक्रिया करता है, संस्कृति23 में विलस एक्सप्लांट्स की बेहतर व्यवहार्यता और अखंडता में अनुवाद करता है।
कई महत्वपूर्ण प्रोटोकॉल कदम दोहराया और देखभाल के साथ निष्पादित किया जाना चाहिए. प्लेसेंटल डिलीवरी के बाद, ऊतक को यथासंभव तेजी से सुसंस्कृत किया जाना चाहिए। एक्सप्लांट की तैयारी के दौरान, दृश्यमान रोधगलन वाले क्षेत्रों से बचना महत्वपूर्ण है। धीरे निचोड़ को रोकने के लिए संदंश के साथ explants संभाल महत्वपूर्ण है. पूरी प्रक्रिया में ऊतक को तरल से ढंककर रखने और इसे तेजी से संचालित करने की सिफारिश की जाती है।
यह स्वीकार करना महत्वपूर्ण है कि इस अध्ययन प्रस्तुत प्रवाह प्रणाली, जो भविष्य की जांच 3,23 में एक सीमा के रूप में माना जाना चाहिए के भीतर सटीक कतरनी तनाव निर्दिष्ट करने में असमर्थ है. फिर भी, यह पहचानना महत्वपूर्ण है कि विवो में एक विशिष्ट प्लेसेंटल विलस के लिए सटीक प्रवाह वेग और कतरनी तनाव कई मापदंडों से प्रभावित होते हैं, जैसे कि इंटरविलस स्पेस की ज्यामितीय विशेषताएं, इस स्थान के भीतर विलस का स्थान, और इसकी निकटता और मातृ सर्पिल धमनियों और गर्भाशय नसों के लिए कोण 3,19,23,32 . नाल की ज्यामितीय संरचना, जो व्यक्तियों के बीच भिन्न होता है की जटिलता,23,32 के रूप में अच्छी तरह से खाते में लिया जाना चाहिए. गणितीय मॉडल intervillous अंतरिक्ष32 के भीतर रक्त के प्रवाह का अनुमान और syncytiotrophoblast19,28 पर दीवार कतरनी तनाव पर गणना पहले से ही मौजूद हैं. दिलचस्प बात यह है कि एक अध्ययन ने भविष्यवाणी की है कि सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट पर कतरनी तनाव पहली तिमाही28 की तुलना में तीसरी तिमाही में कम है, जबकि दूसरे ने सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट19 पर स्थानिक रूप से विषम दीवार कतरनी तनाव का प्रदर्शन किया। एक विशिष्ट अपरा विलस के लिए सटीक प्रवाह वेग और कतरनी तनाव का निर्धारण एक चुनौती 3,19,23,32 बनी हुई है। इस तरह की गणना भविष्य की जांच के लिए कतरनी तनाव सीमा का एक सन्निकटन प्रदान करते हैं, लेकिन वे चल रहे शारीरिक समायोजन और अनुकूलन23 की आवश्यकता हो सकती है. इसके अलावा, भविष्य के अध्ययन नई और परिष्कृत प्रवाह के माध्यम से संस्कृति तकनीक है कि intervillous अंतरिक्ष और रणनीतियों के जटिल ज्यामिति के लिए खाते प्रयोग3 प्रति नमूनों की संख्या में वृद्धि विकसित कर सकते हैं. प्रवाह प्रणाली की चल रही प्रगति और विकास का अनुमान है, संभावित रूप से वैकल्पिक प्रवाह कक्षों को नियोजित करना (ब्रुगर एट अल., अप्रकाशित डेटा, 2023)।
अंत में, यह अध्ययन आसानी से लागू करने योग्य पूर्व विवो प्रवाह संस्कृति तकनीक का प्रदर्शन करके एक मजबूत नींव रखता है जो सुसंस्कृत विलस एक्सप्लांट्स की संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखता है। यह अपरा कार्यात्मक जीव विज्ञान अध्ययन में गतिशील तकनीकों के महत्व को रेखांकित करता है, प्रवाह संस्कृति प्रणालियों में आगे की प्रगति और नए विचारों औरपरिकल्पनाओं की पीढ़ी 3,23 के लिए मार्ग प्रशस्त करता है।

1960 के दशक के बाद से, एक अच्छी तरह से प्लेट के तल पर अपरा explant खेती भ्रूण-मातृ इंटरफ़ेस 1,2,3 का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है. यह विधि अच्छी तरह से स्थापित और सीधी है, जो एकल कोशिकाओं 2,3 की संस्कृतियों के अलावा, विभिन्न अध्ययनों के लिए मानव ऊतक के उपयोग को सक्षम करती है। समय के साथ, अपरा explant संस्कृतियों के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन ऑक्सीजन एकाग्रता4 के संबंध में संशोधित किया गया है और अच्छी तरह से थाली के नीचे 2,5,6 पर बसने से ऊतक को रोकने के लिए. हालांकि, इस विधि को गर्भाशय के भीतर विवो स्थितियों में अनुकूलित नहीं किया गया है, विशेष रूप से एक निरंतर प्रवाह3 की उपस्थिति।
गर्भावस्था की सफलता मातृ रक्त के साथ इंटरविलस स्पेस के पर्याप्त और सुसंगत छिड़काव पर टिका है, जो रक्त और रक्त जनित पदार्थों के निरंतर प्रवाह और बहिर्वाह के साथ एक गतिशील सर्किट स्थापित करता है 7,8,9,10,11,12. नाल दो अलग रक्त की आपूर्ति प्रणाली, मातृ रक्त के लिए एक और भ्रूण के रक्त के लिए एक, दोनों भ्रूण और मातृ प्रणालियों13 द्वारा दोहरी छिड़काव में जिसके परिणामस्वरूप. मातृ रक्त पहली तिमाही के अंत में नाल के अंतःक्रियात्मक स्थान को छिड़कना शुरू कर देता है, धीरे-धीरे चौड़ी गर्भाशय सर्पिल धमनियों10,11,14के माध्यम से बहता है। नतीजतन, अपरा विलस पेड़ों को मातृ रक्त में स्नान किया जाता है, भ्रूण को पोषक तत्व और ऑक्सीजन प्रदान करता है। यह मातृ रक्त गर्भाशय नसों के माध्यम से मातृ परिसंचरण में लौटने से पहले इंटरविलस स्पेस से बहता है। इंटरविलस स्पेस के माध्यम से इसके पारित होने के दौरान, भ्रूण के रक्त में ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के प्रसार और सक्रिय तेज से मातृ रक्त12,15में ऑक्सीजन और पोषक तत्वों का स्तर कम हो जाता है। हालांकि, इंटरविलस स्पेस के रक्त को पूरी तरह से ताजा, ऑक्सीजन युक्त रक्त द्वारा प्रति मिनट लगभग दो से तीन बार बदल दिया जाता है, जिससे पोषक तत्वों और गैसोंकी निरंतर आपूर्ति सुनिश्चित होती है। विशेष रूप से, सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट, प्लेसेंटल बाधा का सबसे बाहरी हिस्सा, प्लेसेंटल विलस पेड़ का एकमात्र घटक है जो सीधे मातृ रक्त15,16,17के संपर्क में आता है। नतीजतन, syncytiotrophoblast बह मातृ रक्त 3,14 से एक निरंतर हल्के कतरनी तनाव का अनुभव.
अपरा प्रवाह पर्यावरण और आधुनिक तकनीकी प्रगति के बारे में वर्तमान वैज्ञानिक ज्ञान अब प्रवाह की स्थिति के तहत प्लेसेंटल एक्सप्लांट्स की एक अनुकूलित और शारीरिक रूप से अनुमानित खेती की अनुमति देता है। इसके अलावा, सबूत बताते हैं कि कतरनी बल सिंकिटियोट्रोफोब्लास्ट 18,19,20,21के जैविक कार्यों को प्रभावित करते हैं। एक प्रसिद्ध दृष्टिकोण है कि रक्त प्रवाह के लिए खातों अपरा दोहरी पालि छिड़काव प्रणाली22 है. हालांकि, इन प्रयोगों महत्वपूर्ण विशेषज्ञता की आवश्यकता है, समय प्रतिबंधित (केवल कुछ घंटों के लिए आयोजित) कर रहे हैं, और केवल तीसरे तिमाही अपरा नमूने 3,23 के साथ संभव हैं. इसके विपरीत, हमने निरंतर प्रवाह सेटिंग्स के तहत पूर्व विवो प्लेसेंटल विलस एक्सप्लांट कल्चर के लिए एक सीधी और गैर-घुसपैठ तकनीक विकसित की है, जिसमें पहली और तीसरी तिमाही के अपरा ऊतक3 दोनों को समायोजित किया गया है। इस सेटअप में, प्लेसेंटल एक्सप्लांट्स की खेती पांच श्रृंखला-जुड़े प्रवाह कक्षों में की जाती है। पतली धातु प्लेटों पर सुई के आकार की ऊंचाई का उपयोग करके कक्ष के तल पर विलस एक्सप्लांट्स को सुरक्षित किया जाता है। निर्मित प्रवाह सर्किट को बाद में एक बायोरिएक्टर में स्थानांतरित किया जाता है, जहां ऑक्सीजन एकाग्रता और प्रवाह दर दोनों को विनियमित किया जाताहै 3. प्रवाह संस्कृति के परिणाम प्रदर्शित करते हैं कि ऊतक अखंडता बेहतर आम तौर पर इस्तेमाल किया स्थिर विधि3 की तुलना में संरक्षित है. इसके अलावा, इस गतिशील दृष्टिकोण ऊतक explant संवर्धन के लिए उपन्यास और अनुकूलित प्रयोगात्मक डिजाइन सक्षम बनाता है, इन विट्रो प्रयोगों है कि और अधिक बारीकी से प्राकृतिक वातावरण3 की नकल में अनुमति देता है.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21422</td>
			<td>Diluted in PBS, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody diluent</td>
			<td>Dako, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>S3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin (AC-15)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>ab6276</td>
			<td>Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioreactor TEB500</td>
			<td>TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 Class II (QBEnd-10)</td>
			<td>Dako, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>M7165</td>
			<td>Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPD 030 critically point dryer</td>
			<td>Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein)</td>
			<td></td>
			<td>Critically point dryer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>D21490</td>
			<td>Diluted in PBS, 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebers TEB505 Series Software</td>
			<td>TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Series Software 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV</td>
			<td>PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany;&#160;</td>
			<td>C-22120</td>
			<td>Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelsior AS Tissue Processor&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A2720803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histolab Clear</td>
			<td>Histolab, Askim, Sweden</td>
			<td>14250-TY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Block</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>TA125H202Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaiser&#8217;s Glycerin Gelatine</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1092420100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM 6000 B microscope</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with an Olympus DP 72 Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal plate with needles</td>
			<td>In-house construction</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome&#160;</td>
			<td>Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Miele, Guetersloh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope&#160; (BX63)</td>
			<td>Olympus, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Serial Number: 1A52421</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>2585627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody enhancer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>TL-125-PB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pumping tube</td>
			<td>Tygon, Bartelt, Graz, Austria</td>
			<td>6.078 175</td>
			<td>&#160;1.02 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QV500 Flow chambers</td>
			<td>Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK</td>
			<td>QV500&#160;</td>
			<td>Other chambers would work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCD 500, sputter coater</td>
			<td>Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein</td>
			<td></td>
			<td>Sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>ab64252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides&#160;</td>
			<td>Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter</td>
			<td>Corning Incorporated, NY, USA</td>
			<td>431219</td>
			<td>0.2 &#181;m Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAAB epoxy resin</td>
			<td>Agar Scientific, Stansted, Essex, UK</td>
			<td>T001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>TL-125-HL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraVision Protein Block</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>TA125BPQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss EM 900 transmission electron microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope</td>
			<td>Zeiss, Cambridge, UK</td>
			<td></td>
			<td>Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo placental explant flow culture - mimicking the dynamic conditions in utero

मौजूदा पूर्व विवो प्लेसेंटल एक्सप्लांट कल्चर मॉडल मुख्य रूप से अच्छी प्लेटों का उपयोग करके स्थिर संस्कृति प्रणालियों में आधारित हैं। हालांकि, ये मॉडल अपर्याप्त रूप से गर्भाशय सेटिंग में गतिशील को दर्शाते हैं, जहां प्लेसेंटा प्लाज्मा या रक्त प्रवाह के कारण लगातार मामूली कतरनी तनाव का सामना करता है। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, मातृ शरीर के भीतर अनुभव किए गए गर्भाशय प्रवाह की स्थिति के करीब पूर्व विवो प्लेसेंटल एक्सप्लांट खेती लाने के लिए एक प्रवाह संस्कृति प्रणाली तैयार की गई है। इस दृष्टिकोण के भीतर, अपरा explants पांच परस्पर प्रवाह कक्षों के एक अनुक्रम में खेती कर रहे हैं. यह सेटिंग शारीरिक ऑक्सीजन सांद्रता और एक सुसंगत प्रवाह दर बनाए रखती है। एकत्रित आंकड़ों से पता चलता है कि प्रवाह की स्थिति के तहत, ऊतक आकृति विज्ञान का संरक्षण पारंपरिक स्थैतिक तरीकों की तुलना में उल्लेखनीय वृद्धि प्रदर्शित करता है। यह अभिनव तकनीक पूर्व विवो प्लेसेंटल एक्सप्लांट संस्कृति का एक सीधा साधन पेश करती है, जो विवो वातावरण में गतिशील का अधिक वफादार प्रतिनिधित्व प्रदान करती है। इसके अलावा, यह अध्ययन भ्रूण-मातृ इंटरफ़ेस की कार्यात्मक गतिशीलता की जांच के लिए नई संभावनाओं का परिचय देता है। व्यवहार्य गतिशील पद्धतियों को अपनाने से, प्लेसेंटल जीव विज्ञान की गहरी समझ की सुविधा है, जो मातृ-भ्रूण स्वास्थ्य के लिए इसकी प्रासंगिकता को रेखांकित करता है।

Ex Vivo Placental Explant Flow Culture - Mimicking the Dynamic Conditions In Utero

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Research Through Single Cell Sequencing and Spatial Histology in Placental Tissues at JoVE.com

Advancing Research Through Single Cell Sequencing and Spatial Histology in Placental Tissues (Video) | JoVE

यहाँ निरंतर प्रवाह की स्थिति के तहत अपरा explants संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल है. यह दृष्टिकोण गतिशील शारीरिक वातावरण की प्रतिकृति को सक्षम करके पारंपरिक स्थैतिक विलस कल्चर सिस्टम को बढ़ाता है।

पूर्व वीवो प्लेसेंटल एक्सप्लांट फ्लो कल्चर - गर्भाशय में गतिशील स्थितियों की नकल करना

The existing ex vivo placental explant culture models are primarily grounded in static culture systems using well plates. However, these models ...

हम यह पता लगाने की कोशिश कर रहे हैं कि कुछ गर्भवती महिलाएं प्रीक्लेम्पसिया क्यों विकसित करती हैं और अन्य नहीं करती हैं। यह गर्भावस्था-विशिष्ट सिंड्रोम मां के उच्च रक्तचाप और प्रोटीनमेह का कारण बनता है और मां और बच्चे की मृत्यु का कारण बन सकता है। हमारे अनुवाद संबंधी शोध के साथ, हम मातृ लक्षणों के लिए अग्रणी प्लेसेंटल कारणों की पहचान करने की उम्मीद करते हैं।हाल ही में, स्वस्थ और प्री-एक्लेमप्टिक प्लेसेंटा के बीच अंतर की पहचान करने के लिए एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण दृष्टिकोण का उपयोग किया गया है। अब इस डेटा को मूल ऊतकों के साथ जोड़ने का समय आता है। यही कारण है कि हम एकल-कोशिका स्तर पर परिवर्तनों की पहचान करने के लिए स्थानिक ऊतक विज्ञान और संस्थान अनुक्रमण का उपयोग कर रहे हैं।नाल की ज्यामितीय संरचना की व्यक्तिगत जटिलता किसी दिए गए अपरा विलस के लिए सटीक प्रवाह वेग और कतरनी तनाव निर्धारित करने के लिए एक चुनौती प्रस्तुत करती है। इस प्रवाह संस्कृति प्रणाली के उपयोग के साथ, अपरा ऊतकों के जैविक कार्यों पर कतरनी बल के महत्व को संबोधित और जांच की जा सकती है।