Name: Advancing Research Through Single Cell Sequencing and Spatial Histology in Placental Tissues (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-09-08T14:05:00
Duration: 1 min 8 s
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Los autores agradecen el excelente apoyo técnico de Bettina Amtmann y Petra Winkler para la toma de muestras de tejidos. Esta investigación fue financiada por el Fondo Austriaco para la Ciencia FWF (DOC 31-B26) y la Universidad Médica de Graz, Austria, a través del Programa de Doctorado Trastornos Inflamatorios en el Embarazo (DP-iDP).

El comité de ética de la Universidad Médica de Graz aprobó este estudio (31-019 ex 18/19 versión 1.2 y 29-319 ex 16/17). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos involucrados en el estudio.
1. Preparación para el experimento de flujo
NOTA: Los experimentos se llevan a cabo en un biorreactor con bombas peristálticas integradas (ver Tabla de Materiales). La humedad, la temperatura y el nivel de gas dentro del biorreactor se pueden ajustar.
<ol><li>Encienda el biorreactor y haga todos los arreglos previos (por ejemplo, calibración de las bombas, precalentamiento, condiciones de gas y humedad) para el experimento de acuerdo con el manual del biorreactor. Antes de comenzar el experimento, los ajustes requeridos (temperatura, contenido de gas, humedad) deben estabilizarse durante unas horas o durante la noche. Para hacer esto, inicie el biorreactor y el software y luego haga clic en Cambiar puntos de ajuste en la opción de menú "Incubadora".</li>
	<li>Precalentar PBS y el medio requerido (medio de crecimiento de células endoteliales suplementado con los suplementos provistos hEGF-5, HC-500, así como suero fetal bovino empobrecido al 5%, penicilina/estreptomicina al 1%) a 37 °C. ​</li>
</ol>2. Disección de la muestra placentaria
<ol><li>Inmediatamente después del parto, corte tres veces 2 cm 3 muestras de placenta de la región media de la placenta como se describe en Kupper et al.3 Brevemente, mantenga las muestras en PBS. Deseche la placa coriónica, la decidua materna y las áreas de infartos visibles del espécimen.</li>
	<li>Diseccionar la muestra de tejido restante en explantes vellosos con un diámetro de sección transversal de aproximadamente 0,5 cm (peso húmedo de aproximadamente 7,5 mg). Transfiéralos a una placa de Petri con PBS fresco.</li>
	<li>Lave los explantes en PBS agitándolos suavemente en el líquido con pinzas para eliminar los residuos de sangre. NOTA: Diseccione las muestras en una placa de Petri con PBS para prelavarlas y evitar que se sequen y use herramientas esterilizadas/esterilizadas en autoclave para procesar el tejido.</li>
</ol>3. Experimento de flujo
<ol><li>Bajo una campana estéril, conecte cinco cámaras en serie a la botella de depósito utilizando los cierres luer de acuerdo con el manual de usuario de las cámaras de flujo (consulte la Tabla de materiales). NOTA: Esterilice y/o autoclave todos los materiales antes de su uso, de acuerdo con el manual respectivo. Utilice un filtro de aire en la botella del depósito para el intercambio de gases estériles. Para abrir y cerrar las cámaras, apriete suavemente las lengüetas de las cámaras. Paso 3.1. también se puede preparar antes.</li>
	<li>Dale la vuelta a las cámaras y ábrelas quitando la parte inferior. Use pinzas para transferir las placas de metal en el centro de la parte superior de las cámaras con los clavos apuntando hacia arriba.</li>
	<li>Llene las cámaras con 1 ml de medio precalentado (37 °C). A continuación, llene el depósito con 20 ml adicionales. El circuito requiere un total de 25 mL, incluyendo el volumen en cada cámara de flujo, en los tubos y en la botella de depósito. Bajo el flujo, el volumen final del medio en una cámara llena es de 2 mL.</li>
	<li>Use fórceps y transfiera un explante velloso tras otro entre las agujas de la placa de metal en la cámara. Deje que las agujas se deslicen entre las vellosidades placentarias para evitar la punción del tejido. Transfiera cuatro explantes a una cámara. Cierre las cámaras volviendo a colocar el fondo con cuidado. Un circuito completo contiene un total de 20 explantes. Las cámaras deben permanecer en posición invertida. NOTA: Sujete los explantes suavemente con las pinzas; Trate de no apretarlos. Asegúrese de que las cámaras y el circuito estén completamente sellados para evitar fugas. Las cámaras siempre se utilizan al revés. El número de explantes por cámara y el número de cámaras en sí son variables. El procedimiento para el tejido del primer trimestre es similar al del tejido del tercer trimestre con una pequeña adición: para fijar las vellosidades, doblar las agujas ligeramente sobre los explantes después de que el tejido se haya transferido a la placa metálica (comunicación personal Brugger et al.). Esto fija el tejido frágil en la placa de metal y evita que las muestras se deslicen.</li>
	<li>Transfiera el conjunto de flujo al biorreactor.</li>
	<li>Conecte el circuito de flujo a la bomba peristáltica dentro del biorreactor conectando la tubería de la bomba a la bomba. Fíjalo en la4ª etapa (se oirá hacer clic cuatro veces).</li>
	<li>Si se requiere un control estático, coloque también la placa de pocillos en el biorreactor. NOTA: Para el cultivo estático, se llenan cinco pocillos de una placa de seis pocillos con 4 mL de medio por pocillo y 4 explantes vellosos por pocillo. La placa de pocillo llena también se coloca en el biorreactor y se cultiva en la misma atmósfera que los explantes de cultivo de flujo. Más detalles se describen en Kupper et al.3</li>
	<li>Ajuste el modo de bomba a Manual en la opción de menú "Bombas". A continuación, ajuste la velocidad de la bomba a 1 ml/min y comience a bombear el medio en el tubo haciendo clic en Ejecutar. Mientras se llena el circuito con medio, sostenga las cámaras en ángulo para que estén completamente llenas de medio. NOTA: Véase la Tabla Suplementaria 1 para conocer los ajustes experimentales para el flujo velloso placentario y el cultivo estático. Las especificaciones del sistema de flujo y estático se proporcionan en la Tabla Suplementaria 2. PRECAUCIÓN: Incline con cuidado la cámara durante el llenado para evitar que las muestras se salgan de las agujas.</li>
	<li>Una vez completado el llenado, las cámaras permanecen en su posición invertida. Asegúrese de que las cámaras estén de pie de forma segura y en posición vertical, y cierre ambas tapas del biorreactor. NOTA: El volumen final del medio en una cámara de flujo llena es de 2 ml. Los ajustes experimentales y las especificaciones de las cámaras de flujo y las placas de pocillos utilizadas en los experimentos se describen en Kupper et al.3</li>
	<li>Incubar el tejido durante el tiempo deseado. NOTA: La temperatura, el nivel de gas y el caudal se pueden controlar en el ordenador sin necesidad de volver a abrir la tapa del biorreactor.</li>
	<li>Detenga la bomba después de la incubación del tejido durante el tiempo deseado haciendo clic en Abortar en la opción de menú "Bombas". Abra las dos tapas del biorreactor y luego una cámara de flujo a la vez. Retire con cuidado los explantes de la placa de metal con pinzas.</li>
	<li>Procese el tejido y el sobrenadante de acuerdo con el análisis posterior seleccionado. En este caso, se realizó tinción inmunohistoquímica y microscopía electrónica3. Consulte la Tabla suplementaria 3 para obtener los detalles de los anticuerpos utilizados para la inmunohistoquímica y la inmunofluorescencia. NOTA: Después de retirar el pañuelo, drene el medio del circuito girando la bomba en sentido contrario a las agujas del reloj.</li>
	<li>Desmonte y limpie el circuito de flujo de acuerdo con las instrucciones del fabricante para las cámaras de flujo y la tubería.</li>
</ol>

Improving Ex Vivo Placental Explant Culture Using a Flow-Based Approach

<ol>
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Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Este estudio presenta una perspectiva única sobre una técnica de cultivo de flujo para explantes placentarios diseñada para replicar la dinámica en el ambiente uterino 3,23. Los hallazgos revelan que la morfología de los tejidos cultivados en condiciones de flujo está mejor conservada en comparación con el método tradicional de cultivo estático3. Cabe destacar que, a pesar de que ni las condiciones estáticas ni las de cultivo de flujo facilitan la perfusión de los vasos placentarios, la destrucción de los vasos sanguíneos feto-placentarios dentro del estroma velloso se observó predominantemente en el cultivo estático, mientras que la integridad de los vasos sanguíneos pareció mantenerse mejor durante un período más largo en el cultivo de flujo3.
Una posible explicación para esta observación podría estar relacionada con el crucial papel protector y endocrino del sincitiotrofoblasto, una función bien documentada en la literatura 12,24,25,26. Teniendo en cuenta esto, es concebible que la integridad general de la capa externa de las vellosidades contribuya significativamente al mantenimiento del estroma subyacente, incluidos los vasos sanguíneos. En consecuencia, la integridad celular sostenida de los vasos sanguíneos en condiciones de flujo podría atribuirse al flujo continuo del medio. Este movimiento ayuda en el movimiento pasivo de los explantes, facilitando el intercambio de gases, nutrientes y nanopartículas (como vesículas extracelulares) a través de la barrera placentaria. Esto, a su vez, podría tener un impacto positivo en la preservación de la morfología de los vasos sanguíneos. Además, el fenómeno de la mecanosensación desempeña un papel en la morfogénesis tisular en varios tejidos27,28. Los estudios han demostrado que la mecanosensibilidad influye en los procesos celulares en múltiples niveles, desencadenando una serie de respuestas bioquímicas que, en última instancia, influyen en la funcionalidad de los tejidos y órganos29. Cabe destacar que las proteínas mecanosensibles son expresadas por el sincitiotrofoblasto a lo largo de la gestación28. Además, el estudio sugiere que las microvellosidades en la superficie del tejido pueden estar implicadas en este contexto28.
Una perspectiva adicional que vale la pena considerar es el papel potencial de las mitocondrias en la respuesta celular al flujo. Por ejemplo, en las células endoteliales, las mitocondrias sirven como transductores de señales para las respuestas celulares a los estímulos ambientales30. El aumento de la acumulación de gotas lipídicas, observado en el tejido cultivado estático a través de TEM3, se ha asociado con la inducción de apoptosis debido a la disfunción mitocondrial31. Se necesitan más investigaciones para desvelar los mecanismos subyacentes y los factores clave, vinculándolos a las vías de señalización posteriores. Esta exploración podría mejorar nuestra comprensión de cómo el tejido percibe y reacciona al estrés cortante, lo que se traduce en una mejor viabilidad e integridad de los explantes vellosos en cultivo23.
Varios pasos críticos del protocolo deben reiterarse y ejecutarse con cuidado. Después de la expulsión de la placenta, el tejido debe cultivarse lo más rápido posible. Durante la preparación del explante, es crucial evitar las áreas con infartos visibles. Es importante manipular suavemente los explantes con fórceps para evitar que se aprieten. Se recomienda mantener el tejido cubierto de líquido durante todo el procedimiento y llevarlo a cabo rápidamente.
Es importante reconocer que este estudio no puede especificar el esfuerzo cortante exacto dentro del sistema de flujo presentado, lo que debe ser considerado como una limitación en futuras investigaciones 3,23. Sin embargo, es importante reconocer que la velocidad precisa del flujo y el esfuerzo cortante para una vellosidad placentaria específica in vivo están influenciados por numerosos parámetros, como las características geométricas del espacio intervelloso, la ubicación de las vellosidades dentro de este espacio y su proximidad y ángulo a las arterias espirales maternas y las venas uterinas 3,19,23,32 . También hay que tener en cuenta la complejidad de la estructura geométrica de la placenta, que varía entre los individuos23,32. Ya existen modelos matemáticos que estiman el flujo sanguíneo dentro del espacio intervelloso32 y cálculos sobre el esfuerzo cortante de la pared en el sincitiotrofoblasto 19,28. Curiosamente, un estudio predijo que el esfuerzo cortante en el sincitiotrofoblasto es menor en el tercer trimestre en comparación con el primer trimestre28, mientras que otro demostró un esfuerzo cortante de pared espacialmente heterogéneo en el sincitiotrofoblasto19. Determinar la velocidad de flujo precisa y el esfuerzo cortante para una vellosidad placentaria específica sigue siendo un desafío 3,19,23,32. Estos cálculos ofrecen una aproximación del rango de esfuerzo cortante para futuras investigaciones, pero pueden requerir ajustes anatómicos continuos y optimización23. Además, los estudios futuros pueden desarrollar nuevas y refinadas técnicas de cultivo de flujo continuo que tengan en cuenta la intrincada geometría del espacio intervelloso y estrategias para aumentar el número de especímenes por experimento3. Se prevé un progreso y desarrollo continuos del sistema de flujo, que podrían emplear cámaras de flujo alternativas (Brugger et al., datos no publicados, 2023).
En conclusión, este estudio sienta una base sólida al demostrar una técnica de cultivo de flujo ex vivo fácilmente implementable que mantiene la integridad estructural de los explantes vellosos cultivados. Subraya la importancia de las técnicas dinámicas en los estudios de biología funcional placentaria, allanando el camino para nuevos avances en los sistemas de cultivo de flujo y la generación de nuevas ideas e hipótesis 3,23.

Desde la década de 1960, el cultivo de explantes placentarios en el fondo de una placa de pocillose ha utilizado para estudiar la interfase feto-materna 1,2,3. Este método está bien establecido y es sencillo, lo que permite la utilización de tejido humano para diversos estudios, además de cultivos de células individuales 2,3. A lo largo del tiempo, los diseños experimentales de cultivos de explantes placentarios se han modificado con respecto a la concentración de oxígeno4 y para evitar que el tejido se asiente en el fondo de la placa del pocillo 2,5,6. Sin embargo, este método no se ha adaptado a las condiciones in vivo dentro del útero, específicamente a la presencia de un flujo constante3.
El éxito de un embarazo depende de una adecuada y consistente perfusión del espacio intervelloso con la sangre materna, estableciendo un circuito dinámico con entrada y salida continua de sangre y sustancias transmitidas por la sangre 7,8,9,10,11,12. La placenta presenta dos sistemas distintos de irrigación sanguínea, uno para la sangre materna y otro para la sangre fetal, lo que resulta en una doble perfusión por parte de los sistemas fetal y materno13. La sangre materna comienza a perfundir el espacio intervelloso de la placenta al final del primer trimestre, fluyendo lentamente a través de las arterias espirales uterinas ensanchadas10,11,14. En consecuencia, los árboles vellosos placentarios se bañan en sangre materna, entregando nutrientes y oxígeno al feto. Esta sangre materna fluye a través del espacio intervelloso antes de regresar a la circulación materna a través de las venas uteroplacentarias. Durante su paso a través del espacio intervelloso, la difusión y la absorción activa de oxígeno y nutrientes en la sangre fetal conducen a niveles más bajos de oxígeno y nutrientes en la sangre materna12,15. Sin embargo, la sangre del espacio intervelloso es completamente reemplazada por sangre fresca y rica en oxígeno aproximadamente dos o tres veces por minuto, lo que garantiza un suministro continuo de nutrientes y gases13. Cabe destacar que el sincitiotrofoblasto, la parte más externa de la barrera placentaria, es el único componente del árbol velloso placentario directamente expuesto a la sangre materna15,16,17. En consecuencia, el sincitiotrofoblasto experimenta un leve estrés de cizallamiento constante debido al flujo de sangre materna 3,14.
Los conocimientos científicos actuales sobre el entorno del flujo placentario y los avances técnicos modernos permiten ahora un cultivo adaptado y fisiológicamente aproximado de explantes placentarios en condiciones de flujo. Además, la evidencia sugiere que las fuerzas de cizallamiento influyen en las funciones biológicas del sincitiotrofoblasto 18,19,20,21. Un enfoque bien conocido que tiene en cuenta el flujo sanguíneo es el sistema de perfusión placentaria de doble lóbulo22. Sin embargo, estos experimentos requieren una experiencia significativa, están restringidos en el tiempo (se realizan solo durante unas pocas horas) y son factibles solo con muestras de placenta del tercer trimestre 3,23. Por el contrario, hemos desarrollado una técnica sencilla y no intrusiva para el cultivo ex vivo de explantes de vellosidades placentarias en entornos de flujo constante, que se adapta a los tejidos placentarios del primer y tercer trimestre3. En esta configuración, los explantes placentarios se cultivan en cinco cámaras de flujo conectadas en serie. Los explantes vellosos se fijan al fondo de la cámara mediante elevaciones en forma de aguja sobre placas metálicas delgadas. El circuito de flujo construido se transfiere posteriormente a un biorreactor, donde se regulan tanto la concentración de oxígeno como el caudal3. Los resultados del cultivo de flujo demuestran que la integridad de los tejidos se conserva mejor en comparación con el método estático utilizado normalmente3. Además, este enfoque dinámico permite diseños experimentales novedosos y adaptados para el cultivo de explantes de tejidos, lo que permite experimentos in vitro que imitan más de cerca el entorno natural3.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A21422</td>
			<td>Diluted in PBS, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody diluent</td>
			<td>Dako, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>S3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin (AC-15)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>ab6276</td>
			<td>Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioreactor TEB500</td>
			<td>TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain</td>
			<td></td>
			<td>Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34 Class II (QBEnd-10)</td>
			<td>Dako, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>M7165</td>
			<td>Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPD 030 critically point dryer</td>
			<td>Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein)</td>
			<td></td>
			<td>Critically point dryer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>D21490</td>
			<td>Diluted in PBS, 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ebers TEB505 Series Software</td>
			<td>TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Series Software 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium MV</td>
			<td>PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany;&#160;</td>
			<td>C-22120</td>
			<td>Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelsior AS Tissue Processor&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exosome-depleted fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A2720803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histolab Clear</td>
			<td>Histolab, Askim, Sweden</td>
			<td>14250-TY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide Block</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>TA125H202Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaiser&#8217;s Glycerin Gelatine</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td>1092420100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM 6000 B microscope</td>
			<td>Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with an Olympus DP 72 Camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica UC7 ultramicrotome</td>
			<td>Leica Microsystems, Vienna, Austria)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal plate with needles</td>
			<td>In-house construction</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome&#160;</td>
			<td>Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Miele, Guetersloh, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus microscope&#160; (BX63)</td>
			<td>Olympus, Hamburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Serial Number: 1A52421</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>2585627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody enhancer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>TL-125-PB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pumping tube</td>
			<td>Tygon, Bartelt, Graz, Austria</td>
			<td>6.078 175</td>
			<td>&#160;1.02 mm diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QV500 Flow chambers</td>
			<td>Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK</td>
			<td>QV500&#160;</td>
			<td>Other chambers would work as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCD 500, sputter coater</td>
			<td>Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein</td>
			<td></td>
			<td>Sputter coater</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>ab64252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides&#160;</td>
			<td>Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter</td>
			<td>Corning Incorporated, NY, USA</td>
			<td>431219</td>
			<td>0.2 &#181;m Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAAB epoxy resin</td>
			<td>Agar Scientific, Stansted, Essex, UK</td>
			<td>T001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>TL-125-HL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraVision Protein Block</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>TA125BPQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss EM 900 transmission electron microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope</td>
			<td>Zeiss, Cambridge, UK</td>
			<td></td>
			<td>Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo placental explant flow culture - mimicking the dynamic conditions in utero

Los modelos de cultivo de explantes placentarios ex vivo existentes se basan principalmente en sistemas de cultivo estáticos que utilizan placas de pocillos. Sin embargo, estos modelos no reflejan adecuadamente la dinámica en el entorno uterino , donde la placenta se encuentra con un ligero estrés de cizallamiento constante debido al plasma o al flujo sanguíneo. Para hacer frente a esta limitación, se ha ideado un sistema de cultivo de flujo para acercar el cultivo de explantes placentarios ex vivo a las condiciones de flujo intrauterina experimentadas en el cuerpo materno. Dentro de este enfoque, los explantes placentarios se cultivan en una secuencia de cinco cámaras de flujo interconectadas. Este ajuste mantiene las concentraciones fisiológicas de oxígeno y un caudal constante. Los datos recopilados revelan que, en condiciones de flujo, la preservación de la morfología de los tejidos presenta una mejora notable en comparación con los métodos estáticos convencionales. Esta técnica innovadora introduce un medio sencillo de cultivo de explantes placentarios ex vivo, ofreciendo una representación más fiel del entorno dinámico in vivo . Además, este estudio introduce nuevas posibilidades para investigar la dinámica funcional de la interfase feto-materna. Al adoptar metodologías dinámicas factibles, se facilita una comprensión más profunda de la biología placentaria, subrayando su relevancia para la salud materno-fetal.

Ex Vivo Placental Explant Flow Culture - Mimicking the Dynamic Conditions In Utero

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Research Through Single Cell Sequencing and Spatial Histology in Placental Tissues at JoVE.com

Advancing Research Through Single Cell Sequencing and Spatial Histology in Placental Tissues (Video) | JoVE

A continuación se presenta un protocolo para el cultivo de explantes placentarios en condiciones de flujo constante. Este enfoque mejora los sistemas tradicionales de cultivo estático de vellosidades al permitir la replicación de entornos fisiológicos dinámicos.

Ex Vivo Cultivo de flujo de explante placentario: imitación de las condiciones dinámicas en el útero

The existing ex vivo placental explant culture models are primarily grounded in static culture systems using well plates. However, these models ...

Estamos tratando de descubrir por qué algunas mujeres embarazadas desarrollan preeclampsia y otras no. Este síndrome específico del embarazo causa hipertensión y proteinuria de la madre y puede causar la muerte de la madre y el niño. Con nuestra investigación traslacional, esperamos identificar las causas placentarias que conducen a los síntomas maternos.Recientemente, se han utilizado enfoques de secuenciación de ARN de una sola célula para identificar diferencias entre placentas sanas y preeclámpticas. Ahora llega el momento de vincular estos datos con los tejidos originales. Esta es la razón por la que estamos utilizando la histología espacial y la secuenciación de institutos para identificar cambios a nivel de una sola célula.La complejidad individual de la estructura geométrica de la placenta presenta un desafío para determinar la velocidad exacta del flujo y el esfuerzo de cizallamiento para una vellosidad placentaria dada. Con el uso de este sistema de cultivo de flujo, se puede abordar e investigar la importancia de la fuerza de cizallamiento en las funciones biológicas de los tejidos placentarios.