Name: quantifying antibody-dependent cellular cytotoxicity in a tumor spheroid model: application for drug discovery
Uploaded: 2024-04-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in a Tumor Spheroid Model: Application for Drug Discovery at JoVE.com

LV는 GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE, OTKA K132193 및 K147482. 이 프로젝트는 HUN-REN 헝가리 연구 네트워크로부터 자금을 지원받았습니다. CD16.176V.NK-92 세포는 Kerry S. Campbell 박사(Brink Biologics, lnc. San Diego, CA)는 전 세계 특허에 의해 보호되며 Nantkwest, lnc의 라이선스를 받았습니다. (www.nantkwest.com). 저자들은 NK-92 세포주와 TR-F(ab')2의 사용에 도움을 주고 기술적 조언을 해준 György Vereb과 Árpád Szöőr에게 감사의 뜻을 전합니다.

1. JIMT-1-강화 형광 단백질(EGFP) 스페로이드 모델 설정
<ol><li>U자형 세포 발수성 바닥을 형성하려면 96웰 플레이트를 0.5% 아가로스-PBS 용액(30μL/웰)으로 코팅합니다. 플레이트를 실온에서 약 30-45분 동안 배양합니다.</li>
	<li>JIMT-1-EGFP 세포를 2mL의 멸균 PBS로 2회 세척합니다(JIMT1-EGFP 세포주의 생성은 이전 간행물17에서 보고됨). 세포 배양을 위해 T25 조직 배양 플라스크 및...

<ol>
	<li>Jubelin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+culture+models+in+oncology+research.">Three-dimensional in vitro culture models in oncology research.</a> Cell Biosci. 12 (1), 155 (2022).</li><li>Mittler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+monitoring+of+drug+effects+in+a+3D+spheroid+model.">High-content monitoring of drug effects in a 3D spheroid model.</a> Front Oncol. 7, 293 (2017).</li><li>Badr-Eldin, S. M., Aldawsari, H. M., Kotta, S., Deb, P. K., Venugopala, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+for+efficient+drug+discovery:+Progress+so+far+and+future+prospects.">Three-dimensional in vitro cell culture models for efficient drug discovery: Progress so far and future prospects.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (8), 926 (2022).</li><li>Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Could+3D+models+of+cancer+enhance+drug+screening.">Could 3D models of cancer enhance drug screening.</a> Biomaterials. 232, 119744 (2020).</li><li>Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroids+as+in+vitro+preclinical+models+for+cancer+research.">Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research.</a> Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).</li><li>Fitzgerald, A. A., Li, E., Weiner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+systems+for+exploring+cancer+immunology.">3D culture systems for exploring cancer immunology.</a> Cancers (Basel). 13 (1), 56 (2020).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening:+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci Rep. 6, 19103 (2016).</li><li>Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+models+and+their+use+for+the+testing+of+immunotherapies.">3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies.</a> Front Immunol. 11, 603640 (2020).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+on+immunotherapy+for+breast+cancer:+Tumor+microenvironment,+nanotechnology+and+more.">Recent progress on immunotherapy for breast cancer: Tumor microenvironment, nanotechnology and more.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 680315 (2021).</li><li>Lo Nigro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK-mediated+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+in+solid+tumors:+Biological+evidence+and+clinical+perspectives.">NK-mediated antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in solid tumors: Biological evidence and clinical perspectives.</a> Ann Transl Med. 7 (5), 105 (2019).</li><li>Sun, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+and+preventions+of+breast+cancer.">Risk factors and preventions of breast cancer.</a> Int J Biol Sci. 13 (11), 1387-1397 (2017).</li><li>Liu, P. H., Wei, J. C., Wang, Y. H., Yeh, M. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+development+of+immunotherapies+for+HER2(+)+breast+cancer:+A+review+of+HER2-directed+monoclonal+antibodies+and+beyond.">Clinical development of immunotherapies for HER2(+) breast cancer: A review of HER2-directed monoclonal antibodies and beyond.</a> NPJ Breast Cancer. 6, 10 (2020).</li><li>Musolino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+fcgamma+receptors+in+HER2-targeted+breast+cancer+therapy.">Role of fcgamma receptors in HER2-targeted breast cancer therapy.</a> J Immunother Cancer. 10 (1), e003171 (2022).</li><li>Petricevic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trastuzumab+mediates+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+and+phagocytosis+to+the+same+extent+in+both+adjuvant+and+metastatic+HER2/NEU+breast+cancer+patients.">Trastuzumab mediates antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity and phagocytosis to the same extent in both adjuvant and metastatic HER2/NEU breast cancer patients.</a> J Transl Med. 11, 307 (2013).</li><li>Guti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multitargeted+receptor+tyrosine+kinase+inhibitor+sunitinib+induces+resistance+of+HER2+positive+breast+cancer+cells+to+Trastuzumab-mediated+ADCC.">The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to Trastuzumab-mediated ADCC.</a> Cancer Immunol Immunother. 71 (9), 2151-2168 (2022).</li><li>Barok, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trastuzumab+decreases+the+number+of+circulating+and+disseminated+tumor+cells+despite+Trastuzumab+resistance+of+the+primary+tumor.">Trastuzumab decreases the number of circulating and disseminated tumor cells despite Trastuzumab resistance of the primary tumor.</a> Cancer Lett. 260 (1-2), 198-208 (2008).</li><li>Toth, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+Trastuzumab+and+Pertuzumab+administered+at+approved+doses+may+delay+development+of+Trastuzumab+resistance+by+additively+enhancing+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity.">The combination of Trastuzumab and Pertuzumab administered at approved doses may delay development of Trastuzumab resistance by additively enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity.</a> MAbs. 8 (7), 1361-1370 (2016).</li><li>Ehlers, F. a. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADCC-inducing+antibody+Trastuzumab+and+selection+of+KIR-HLA+ligand+mismatched+donors+enhance+the+NK+cell+anti-breast+cancer+response.">ADCC-inducing antibody Trastuzumab and selection of KIR-HLA ligand mismatched donors enhance the NK cell anti-breast cancer response.</a> Cancers (Basel). 13 (13), 3232 (2021).</li><li>Gangadhara, S., Smith, C., Barrett-Lee, P., Hiscox, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3d+culture+of+Her2++breast+cancer+cells+promotes+AKT+to+MAPK+switching+and+a+loss+of+therapeutic+response.">3d culture of Her2+ breast cancer cells promotes AKT to MAPK switching and a loss of therapeutic response.</a> BMC Cancer. 16, 345 (2016).</li><li>Balalaeva, I. V., Sokolova, E. A., Puzhikhina, A. D., Brilkina, A. A., Deyev, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroids+of+Her2-positive+breast+adenocarcinoma+for+studying+anticancer+immunotoxins+in+vitro.">Spheroids of Her2-positive breast adenocarcinoma for studying anticancer immunotoxins in vitro.</a> Acta Naturae. 9 (1), 38-43 (2017).</li><li>Selis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pegylated+Trastuzumab+fragments+acquire+an+increased+in+vivo+stability+but+show+a+largely+reduced+affinity+for+the+target+antigen.">Pegylated Trastuzumab fragments acquire an increased in vivo stability but show a largely reduced affinity for the target antigen.</a> Int J Mol Sci. 17 (4), 491 (2016).</li><li>Johnston, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening+application+for+cell-type+specific+behaviour+in+heterogeneous+primary+breast+epithelial+subpopulations.">High content screening application for cell-type specific behaviour in heterogeneous primary breast epithelial subpopulations.</a> Breast Cancer Res. 18 (1), 18 (2016).</li><li>Kandaswamy, C., Silva, L. M., Alexandre, L. A., Santos, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+analysis+of+breast+cancer+using+single-cell+deep+transfer+learning.">High-content analysis of breast cancer using single-cell deep transfer learning.</a> J Biomol Screen. 21 (3), 252-259 (2016).</li><li>Esquer, H., Zhou, Q., Abraham, A. D., Labarbera, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+high-content-screening+applications+of+clonogenicity+in+cancer.">Advanced high-content-screening applications of clonogenicity in cancer.</a> SLAS Discov. 25 (7), 734-743 (2020).</li><li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+Her2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab.">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced Her2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li></ol>

지난 수십 년 동안 BC 치료가 크게 개선되었음에도 불구하고 환자들은 여전히 정기적으로 약물 내성을 일으키거나 부작용을 경험한다24. BC주와 관련된 높은 이환율과 사망률은 치료제 개발에 사용할 수 있는 새로운 분자를 식별하기 위한 강력한 스크리닝 플랫폼과 마찬가지로 근본적인 분자 메커니즘에 대한 지속적인 연구를 요구한다25. 이러한 전략에는 세포 ...

다세포 종양 스페로이드(MCTS)는 부착 세포가 응집하는 경향으로 인해 형성되는 널리 사용되는 3차원(3D) 모델로, 암세포 생물학에 대한 기계론적 통찰력을 얻기 위한 중요한 도구입니다. 액체 기반 및 스캐폴드 기반 3D 배양과 같은 다양한 기술을 통해 광범위한 세포 유형에서 생성할 수 있습니다1. 단층 2D 모델에 비해 가장 큰 장점은 종양 세포의 생물학적 거동, 특히 치료 탈출 및 약물 내성으로 이어지는 메커니즘을 모방하여 생체 내 종양의 주요 특징, 즉 구조적 조직 및 저산소증을 요약한다는 것입니다2. 따라서 MCTS는 독성 및 약물 감수성의 예측 가능성을 향상시킬 수 있기 때문에 3D에서 암을 연구하는 데 널리 사용되며 다양한 유형의 암에 대한 효과적인 약물 개발을 향상시킬 수 있습니다3.
모든 질병을 연구하려면 관련성 있고 편리한 모델이 매우 필요합니다. 암 면역학 연구를 위한 모델을 설정하는 것은 면역 체계가 여러 세포 유형으로 구성되어 있기 때문에 어렵습니다. 각 세포 유형에는 여러 하위 유형과 광범위한 활성화 상태가 있습니다. 이러한 다양한 면역 세포 유형은 암세포 및 기타 종양 구성 요소와 상호 작용하여 궁극적으로 질병의 결과에 영향을 미칩니다. 2D in vitro 세포 배양 방법은 번역성이 부족하고 시스템 수준(예: 조직)에서 약물의 작용을 예측할 수 없기 때문에 이러한 복잡한 세포 상호 작용을 재현하지 못합니다4,5. 더욱이 마우스 모델은 인간과 쥐의 면역 체계 사이의 근본적인 차이로 인해 심각한 한계를 가지고 있습니다. 따라서 3D 배양 시스템은 현재 사용 가능한 모델의 격차를 메우고 대체 방법을 제공하고 암 면역학에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다6. 구체적으로, 스페로이드 모델은 면역요법을 시험하는 데 사용될 수 있는데, 이는 주로 스페로이드 표적에 대한 면역세포 침윤 및 항종양 효과를 향상시키기 위한 약물 스크리닝 및 치료용 항체의 효율성을 평가하기 위한 것이다7. 또한, 기질 세포(예: 림프구, 대식세포, 섬유아세포)와 암세포 간의 상호작용을 연구하고 새로운 항암 전략을 개발하기 위한 다양한 대사 및 증식 상태의 세포로 구성된 MCTS의 잠재력은 충분히 입증되었습니다8. 따라서 종양 미세환경의 병태생리학을 고려하여 약물 테스트 프로세스를 강화하기 위해 예측 가능하고 정확한 플랫폼을 확증할 필요가 있습니다.
유방암(BC)은 전 세계적으로 여성에게 가장 많이 진단되는 암입니다. 이 이종 질환의 임상적 분류는 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2) 단백질/종양유전자의 과발현 또는 증폭과 함께 에스트로겐(ER) 및 프로게스테론(PR) 수용체(총칭하여 호르몬 수용체, HR라고 함)와 같은 막관통 수용체의 존재를 기반으로 합니다. 이러한 수용체의 면역조직화학적 발현에 기초하여 일반적으로 루미날 A(HR+/HER2-), 루미날 B(HR+/HER2+), HER2 양성(HR-/HER2+) 및 삼중음성 유방암(HR-/HER2-)의 4가지 아형이 인식됩니다. HER2+ 그룹은 BC 증례의 10-15%를 차지하며, ER 및 PR이 없는 상태에서 HER2 발현이 높고, 내강 종양에 비해 예후가 나쁘며, HER2/neu 단백질에 대한 특정 약물이 필요한 것이 특징이다9.
BC 발달은 다단계 과정이며, 질병의 성공적인 치료를 위해서는 조기 진단이 필수적이다10. 그러나 최근 등장한 맞춤형 BC 치료 옵션(예: 내분비 및 항-HER2 항체 요법)에도 불구하고 BC는 계속해서 종양학자들에게 도전 과제를 안겨주고 있습니다. 수술, 화학요법 및 방사선 요법과 마찬가지로 이러한 맞춤형 치료법도 심각한 부작용을 일으킬 수 있으며 환자는 이러한 약제에 대한 내성을 갖게 될 수 있으므로 최상의 전략을 결정하는 것이 장기적으로 어려운 과제가 될 수 있다11,12. 따라서, 종양과 미세환경 사이의 상호작용에 대한 이해의 향상이 필수적이며, 다양한 BC 아형의 특이성을 고려한 새로운 치료법의 개발을 위한 새로운 방향을 제공할 것으로 기대된다13. 항체 약물 접합체, 입양 T 세포 치료제, 백신 및 새로운 HER2 지향 단클론 항체(mAb)와 같은 새로운 면역 요법이 HER2 발현 종양이 있는 광범위한 환자 집단에서 연구되고 있다14.
예를 들어, 트라스투주맙(Trastuzumab)은 HER2+ BC에 대한 효율적인 치료 방식을 나타냅니다. 작용 방식의 일환으로 트라스투주맙은 단편 결정화 가능한 감마 수용체(FcγR) 의존성 활성을 매개합니다. FcγR은 Fc 분절에 대한 친화력과 이들이 개시하는 면역 반응으로 구별됩니다. 자연살해(NK) 세포에서 FcγRIIIa(CD16A)를 활성화하는 것은 항체 의존성 세포 독성(ADCC)을 매개하는 데 중요하며, 대식세포에서 FcγRIIa(CD32A) 및 FcγRIIIa를 유발하면 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP)을 유도합니다15. 동물 모델에 대한 연구에 따르면 FcγRI(CD64) 및 FcγRIII(CD16) 수용체가 결핍된 마우스는 종양 특이적 항원에 대한 보호 면역 반응을 시작할 수 없었으며, 이는 ADCC가 mAb Trastuzumab16의 주요 작용 기전일 가능성이 있음을 보여주었습니다.
NK 세포는 ADCC에 의한 암세포 사멸을 위해 종양 세포 결합 Abs에 의존하기 때문에 Fc 수용체의 발현은 Trastuzumab17 의 효율적인 치료에 매우 중요합니다(그림 1). 더욱이, 이들의 작용은 활성화 및 억제 수용체, 예를 들어, 킬러 세포 면역글로불린 유사(KIR) 수용체(18)의 자극에 의해 효율적으로 균형을 이룬다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65922/65922fig01.jpg"> 그림 1. 항종양 반응의 맥락에서 ADCC의 메커니즘. 자연살해(NK) 세포의 Fcγ 수용체는 이전에 암세포의 표면 항원에 결합했던 항체의 Fc 영역을 인식합니다. 이 면역학적 시냅스는 NK 세포의 탈과립화로 이어지고, NK 세포는 그랜자임(granzymes)과 퍼포린(perforin)과 같은 세포독성 매개체를 방출합니다. 이 분자는 세포막의 기공 형성에 기여하고 세포 사멸 경로를 활성화하여 표적 세포의 프로그램된 세포 사멸을 유발합니다( Biorender.com 로 생성된 이미지). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65922/65922fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
HER2+ BC에 대한 면역 요법 개발은 진화하는 분야입니다. 이 경우 면역 체계의 다양한 구성 요소 간의 상호 작용을 고려해야 합니다. 또한, 이전 간행물에서는 시너지 효과를 내는 조합을 확인하기 위해 모든 유형의 전통적 치료법, 면역 요법 또는 세포 치료법을 포함하는 병용 요법을 광범위하게 테스트했다19.
HER2+ BC의 여러 3D 모델은 이전에 신약 개발에 사용되었습니다. 예를 들어, Balalaeva 등은 HER2를 과발현하는 SKBR-3 스페로이드를 사용하여 HER2 표적 면역독소 4D5scFv-PE40의 세포 독성을 평가했습니다20. 또 다른 연구에서는 트라스투주맙 및 내분비제에 대한 반응으로 세포 성장을 측정하기 위해 3D Matrigel 기반 HER2+ BC 배양 시스템을 구축했습니다21. 이러한 연구는 치료 반응을 임상적으로 개선하기 위한 효과적인 전략을 나타내는 데 있어 암세포를 과발현하는 HER2의 종양 스페로이드 모델의 중요성을 강조합니다22.
우리 그룹은 이전에 2D 배양 분석에서 JIMT-1 HER2+ BC 세포에서 트라스투주맙 의존성 ADCC의 억제제로 다중표적 티로신 키나아제 억제제인 Sunitinib을 확인했습니다. 이 연구는 수니티닙이 자가포식을 유도하고 NK 세포 사멸 기능을 손상시켜 HER2 발현을 하향 조절하고 JIMT-1 세포의 표면 부착을 향상시킨다는 것을 밝혔다17.
여기에서 우리는 고처리량 스크리닝 응용 분야에 사용할 새로운 3D 스페로이드 ADCC 모델(NK.92.CD16+Trastuzumab+JIMT-1-EGFP 암세포)을 확립했으며, 위에서 언급한 결과를 검증하기 위해 Sunitinib을 모델 화합물로 사용했습니다. 먼저, JIMT-1 세포를 발현하는 EGFP를 생성하고,이들 세포로부터 스페로이드를 성장시켰다. ADCC는 트라스투주맙과 함께 NK 세포에 의해 유도되었으며, 스페로이드는 시험 화합물의 유무에 관계없이 24시간 동안 배양된 상태로 유지되었습니다(그림 2). ADCC의 정량화는 High-Content Analysis 시스템을 사용한 자가사멸 암세포 사멸(Annexin V 염색) 검출을 기반으로 합니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65922/65922fig02.jpg"> 그림 2. 3D 스페로이드 공동 배양 시스템의 ADCC. 당사의 실험 설정은 2D 모델에 비해 생체 내 미세환경을 더 정확하게 모델링할 수 있는 3D 스페로이드 시스템을 기반으로 합니다. JIMT-1 EGFP 유방암 세포를 오목한 세포 퇴치제 바닥에 파종하여 스페로이드라고 하는 둥근 모양의 세포 클러스터를 형성했습니다. 그런 다음 NK92를 추가하여 ADCC를 시작했습니다. CD16 자연살해세포(E:T 비율 = 20:1) 및 항-HER2 단클론 항체인 트라스투주맙. 실험 모델은 ADCC 변형 테스트 화합물( Biorender.com 로 생성된 이미지)의 식별에 효율적이고 쉽게 적용할 수 있는 것으로 입증되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65922/65922fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
우리는 이러한 방식으로 데이터를 수집할 수 있으며 암 약물 발견에서 high-content 스크리닝에 사용하기 위해 통계적으로 견고하다는 것을 입증했습니다. 중요한 것은 이 모델을 사용하면 더 큰 화합물 세트에 대한 확장된 검증이 가능하며 관심 있는 여러 분석에 적용할 수 있다는 것입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well glass bottom Cell Carrier Ultra microplates</td>
			<td>PerkinElmer, Waltham, MA, USA</td>
			<td>LLC 6055302</td>
			<td>for spheroids measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92096</td>
			<td>for cell seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8042</td>
			<td>in NK medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>for spheroids seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-Alexa Fluo 647 conjugate</td>
			<td>Invitrogen-ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A23204</td>
			<td>for apoptosis measurement with HCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16.176 V.NK-92 cells</td>
			<td>Dr. Kerry S. Campbell (the Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA on behalf of Brink Biologics, Inc. San Diego, CA)</td>
			<td>ATCC CRL-2407</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Blue</td>
			<td>Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)</td>
			<td>C2110</td>
			<td>for staining of NK cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td>in JIMT1-EGFP medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>for coating HCS plate before transfering the spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1090/500</td>
			<td>JIMT-1-EGFP and NK medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35,050&#8211;061</td>
			<td>in NK medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0.1</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>for statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony software</td>
			<td>PerkinElmer, Waltham, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>for HCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>Proleukin, Novartis Hung&#225;ria Kft., Budapest, Hungary</td>
			<td>PHC0026</td>
			<td>in NK medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (Humulin R)</td>
			<td>Eli Lilly</td>
			<td>HI0219</td>
			<td>JIMT-1-EGFP medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JIMT-1 breast cancer cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11,140&#8211;050</td>
			<td>in NK medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-115E</td>
			<td>in NK medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix High-Content Analysis equipment</td>
			<td>PerkinElmer, Waltham, MA, USA</td>
			<td>HH14001000</td>
			<td>for HCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Posphate buffered saline)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-517Q</td>
			<td>for washing the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>LM-A4118</td>
			<td>JIMT-1-EGFP and NK medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFP</td>
			<td>Invitrogen, (Prof. J&#243;zsef T<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65922/65922eq01v2.jpg" style="margin: auto;" />zs&#233;r, University of Debrecen)</td>
			<td></td>
			<td>for JIMT-1-EGFP cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic-F127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td>for coating HCS plate before transfering the spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunitinib malate</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>PZ0012</td>
			<td>for treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab Ab (humanized anti-HER2 monoclonal antibody)</td>
			<td>Herzuma&#174;, EGIS Pharmaceuticals, Budapest, Hungary</td>
			<td>NDC-63459-303-43</td>
			<td>for treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab-F(ab&#39;)2</td>
			<td>Gift from Prof. Gy&#246;rgy Vereb and &#193;rp&#225;d Sz&#246;<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65922/65922eq01v2.jpg" style="margin: auto;" />r&#160;</td>
			<td>Department of Biophysics and Cell Biology, University of Debrecen</td>
			<td>for treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4% solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 1X in PBS</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>LM-T1706</td>
			<td>for cells detachment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying antibody-dependent cellular cytotoxicity in a tumor spheroid model: application for drug discovery

종양 항원을 표적으로 하는 단클론 항체 기반 면역 요법은 현재 암 치료의 중심입니다. 항체의 임상적으로 관련된 작용 기전 중 하나는 항체 의존성 세포 독성(ADCC)으로, 항체가 암세포에 결합하고 면역 체계의 세포 구성 요소(예: 자연 살해(NK) 세포)와 결합하여 종양 세포를 죽입니다. 이러한 치료법의 효과는 암세포의 민감도 또는 면역 세포의 효능을 증가시키는 보조 화합물을 식별함으로써 향상될 수 있습니다. 또한, 이전 질환 또는 암 관련 증상에 대해 병용투여한 암 환자에서 발견되지 않은 약물 상호작용이 항체 치료의 성공을 결정할 수 있습니다. 따라서 이러한 원치 않는 약물 상호 작용을 제거해야 합니다. 이러한 목표를 염두에 두고 암 ADCC 모델을 만들었으며 ADCC 조절 약물을 찾기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 암세포 스페로이드와 같은 3D 모델은 항암 치료에 대한 종양의 in vivo 반응을 예측하는 데 있어 2D 배양보다 우수하기 때문에 EGFP 발현 HER2+ JIMT-1 유방암 세포와 NK92의 스페로이드 공동 배양. CD16 세포주를 설정하고 HER2 양성 유방암에 대해 임상적으로 승인된 단일클론 항체인 트라스투주맙(Trastuzumab)으로 유도했습니다. JIMT-1 스페로이드는 세포 발수성 U-바닥 96웰 플레이트에서 형성되도록 허용되었습니다. 3일째에는 NK세포와 트라스투주맙을 추가하였다. 그런 다음 스페로이드를 Annexin V-Alexa 647로 염색하여 자가사멸 세포 사멸을 측정하고, 자동 현미경으로 스페로이드의 주변 영역에서 정량화했습니다. ADCC 조절 분자를 식별하기 위한 분석의 적용 가능성은 전이성 암에 대해 FDA가 승인한 수용체 티로신 키나아제 억제제인 Sunitinib이 ADCC를 거의 완전히 폐지한다는 것을 보여줌으로써 입증되었습니다. 스페로이드 생성과 이미지 획득 및 분석 파이프라인은 암세포 스페로이드의 ADCC 조절 화합물에 대한 고처리량 스크리닝과 호환됩니다.

JIMT-1 세포를 발현하는 EGFP를 생성하고, 이들 세포로부터 스페로이드를 성장시켰다. 수니티닙은 이전에 ADCC17의 과정에 영향을 미치는 것으로 나타났기 때문에 시험 화합물로 사용되었습니다. 스페로이드는 72시간 동안 뭉치도록 허용되었습니다. 3일째에, 10μg/mL의 트라스투주맙(또는 등몰 6.6μg/mL TR-F(ab')219) 및 NK 세포(20:1)를 20μM Sunitinib(1시간 전처리)의 ?...

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Quantifying Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in a Tumor Spheroid Model: Application for Drug Discovery

여기에서는 항종양 항체의 중요한 암세포 사멸 기전인 ADCC 기전을 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제시합니다. NK 세포의 세포독성 효과는 트라스투주맙이 있는 유방암 세포 스페로이드에서 측정됩니다. 이미지 분석은 스페로이드에서 살아있는 킬러와 죽은 킬러와 표적 세포를 식별합니다.

종양 스페로이드 모델에서 항체 의존성 세포 독성 정량화: 약물 발견을 위한 응용

Monoclonal antibody-based immunotherapy targeting tumor antigens is now a mainstay of cancer treatment. One of the clinically relevant mechanisms of ...

가장 효과적인 표적 암 치료법 중 하나는 항-HER2 항체 트라스투주맙과 같은 항체를 기반으로 합니다. 트라스투주맙의 항암 작용은 자연살해 또는 NK 세포에 의한 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)을 수반합니다. ADCC와 관련하여 항성장 인자 수용체 항체 요법에 대한 암세포의 민감도를 조절하는 메커니즘을 이해하는 것은 새롭고 보다 효율적인 치료 방식을 개발하는 데 중요할 수 있습니다.암세포 스페로이드와 같은 3D 모델은 다양한 항암 치료에 대한 종양의 면역 반응을 예측하는 데 탁월한 것으로 입증되었습니다. 따라서 NK92 자연살해 세포주, GFP 발현 JIMT-1 유방암 세포, 트라스투주맙을 이용한 ADCC 스페로이드 모델을 구축하였습니다. 항HER2 양성 JIMT-1 유방암 세포를 유도하여 스페로이드라는 3차원 클러스터를 형성하여 ADCC 분석 시스템을 구축했습니다.실험에 사용된 JIMT-1 세포주는 녹색 형광 단백질을 안정적으로 발현합니다. 스페로이드 형성을 위해 96웰 플레이트를 준비하는 것으로 실험을 시작합니다. U자형 및 세포 발수성 바닥을 만들려면 PBS에서 0.5% 아가로스 용액으로 96웰 플레이트를 코팅합니다.플레이트를 실온에서 약 30-45분 동안 배양합니다. 그 동안 트립신화하고 세포 파종을 위해 JIMT-1 세포를 계수합니다. 멸균 PBS 2밀리리터로 세포를 세척합니다.플라스크에 트립신-EDTA 2밀리리터를 넣고 플라스크를 CO2 인큐베이터에 다시 넣고 10분 동안 넣습니다. 배양 후 플라스크를 두드려 JIMT-1 세포가 분리되었는지 확인합니다. 2밀리리터의 JIMT-1 배지로 분해를 멈추고 세포 현탁액을 50밀리리터 튜브에 모읍니다.Burker 약실에 있는 Trypan 파랑을 가진 세포를 세고, 20에 세포 수를 조정하십시오, ml 당 000의 세포. 스페로이드 형성을 위해 각 웰에 100마이크로리터 세포 현탁액을 피펫팅하여 세포를 96웰 플레이트에 파종합니다. CO2 인큐베이터에서 37도에서 3일간의 배양 기간 동안 세포가 뭉치도록 합니다.도립 현미경으로 스페로이드의 크기와 모양을 정기적으로 확인하십시오. 스페로이드 유도 후 3일째에 DMSO에 Pluronic F-127 용액으로 96웰 고함량 스크리닝 플레이트를 코팅합니다. 코팅은 JIMT-1 EGFP 스페로이드가 유리 표면이나 플레이트에 부착되는 것을 방지하는 데 매우 중요합니다.실온에서 45분의 배양 기간을 거친 후 코팅 용액을 흡인하고 DMEM F12 무혈청 배지로 웰을 두 번 세척합니다. 스페로이드를 1밀리리터 피펫을 사용하여 3회에 걸쳐 96웰 고함량 스크리닝 플레이트로 옮깁니다. 웰당 10마이크로리터의 40마이크로몰 농도로 웰에 수니티닙을 추가하고 부피를 높이기 위해 신선한 JIMT-1 배지를 대조군 웰에 피펫팅합니다.37도의 CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 전처리된 스페로이드의 배양이 진행되는 동안 플라스크에서 NK92 세포를 15밀리리터 튜브로 수집합니다. Burker 챔버에서 Trypan Blue로 세포를 계수하고 세포 수를 조정하여 20:1의 effector-target 비율에 도달합니다.NK 세포를 CellTracker Blue의 10마이크로몰 용액으로 염색하고 37도에서 1시간 동안 CO2 인큐베이터에 넣습니다. 과잉의 염료를 세척하려면 NK 세포를 실온에서 3분 동안 150 RCF에서 두 번 원심분리합니다. 그런 다음 세포를 새로운 JIMT-1 배지에 재현탁시킵니다.항-HER2 항체 트라스투주맙과 함께 웰당 55마이크로리터를 피펫팅하여 염색된 NK 세포를 표적 JIMT-1 EGFP 스페로이드에 추가합니다. 트라스투주맙을 JIMT-1 배지에 희석하여 ml당 10마이크로그램의 농도에 도달합니다. 110마이크로리터의 신선한 JIMT-1 배지를 대조 웰에 추가하고 37도의 CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.그 결과, ADCC에 첨가된 처리의 총량은 110마이크로리터이고, 최종 수니티닙 농도는 리터당 20마이크로몰이다. 처리 후 자가사멸 세포 사멸을 검출하고 측정하려면 JIMT-1 배지에서 Annexin V Alexa Fluor 647 conjugate로 스페로이드를 1시간 동안 염색합니다. 실험 단계가 완료되면 플레이트를 high-content 분석 장치로 옮깁니다.플레이트는 표적 세포에 NK 인자를 첨가한 후 24시간 후에 촬영됩니다. 이미징을 위해 High-Content Analyzer와 이미지 분석 소프트웨어를 사용하고 있습니다. 플레이트 유형(Plate Type) 옵션을 사용하여 플레이트 목록에서 마이크로플레이트 유형을 선택합니다.96웰 High-Content 스크리닝 플레이트를 사용하십시오. 각각 자동 초점 및 대물렌즈 옵션을 사용하여 0.3개의 개구수를 가진 10x 대물렌즈가 있는 플레이트에서 수행된 분석으로 두 개의 피크 자동 초점을 선택합니다. OptiMode 옵션으로 공초점 모드를 선택하고 Binning 옵션을 사용하여 Binning 2를 적용합니다.스페로이드를 이미징하려면 Channel Selection 옵션을 사용하여 적절한 채널을 선택합니다. EGFP 형질 주입된 JIMT-1 세포를 검출하려면 200밀리초 통합 시간, 50% 레이저 출력, 2마이크로미터 스택 높이, 488나노미터 여기, 500, 550나노미터 방출 파장을 가진 EGFP를 선택하십시오. 또한 세포사멸 세포를 검출하기 위해 100밀리초 통합 시간, 50% 레이저 출력, 10마이크로미터 스택 높이, 640나노미터 여기, 650, 760나노미터 방출 파장을 가진 Alexa 647을 사용하십시오.스페로이드 내에서 NK 세포를 시각화하려면 100밀리초 통합 시간, 50% 레이저 출력, 2마이크로미터 스택 높이, 405나노미터 여기, 435, 418나노미터 방출 파장을 가진 DAPI 채널을 선택합니다. Layout Selection 옵션에서 Z 스택을 선택하면 스페로이드의 셀이 현미경의 다른 초점면에 있는 경향이 있기 때문입니다. 10마이크로미터 거리의 평면 10개는 전체 스페로이드 영역을 덮기에 충분합니다.첫 번째 평면과 마지막 평면의 값을 각각 0마이크로미터와 90마이크로미터로 설정합니다. 측정을 시작하기 전에 올바른 설정을 확인하기 위해 스냅샷 기능으로 샘플 이미지를 촬영할 수 있습니다. 정의된 레이아웃(Defined Layout) 옵션을 사용하여 이미징할 웰과 필드의 개수를 설정합니다.Fine Texture Region 옵션을 사용하여 EGFP 형광 또는 JIMT-1 세포로 스페로이드를 식별하고 크기별로 필터링합니다. Select Population 모듈을 사용하여 경계 객체를 제거합니다. Annexin 양성 세포는 말초 스페로이드에 나타나기 때문에 apoptotic ring에서 Annexin 강도를 측정합니다.영역 선택 모듈에서 외부 경계를 빼기 90으로 설정합니다. Annexin 강도 값을 평균 강도로 표현합니다. Annexin V 염색에서 알 수 있듯이 NK 세포와 트라스투주맙을 JIMT-1 세포에 추가하면 종양 스페로이드에서 세포 사멸이 발생했습니다.아넥신 양성 세포자멸 세포는 스페로이드의 주변 영역에서 나타났습니다. 그러나 트라스투주맙이 없는 경우, NK 세포는 종양세포 사멸을 유발하지 않았다. 트라스투주맙의 직접적 또는 ADCC 매개 효과를 구별하기 위해 본 연구에서는 FC 영역 결합 능력이 결여된 트라스투주맙-Fab2를 음성 대조군으로 사용하였다.트라스투주맙-팹2는 이 모델에서 효과가 없었기 때문에 종양세포 사멸은 ADCC를 통해 매개될 가능성이 높다. 또한, 수니티닙을 사용한 전처리는 스페로이드에서 Annexin V 염색을 감소시켜 수니티닙 유도 ADCC 내성을 확인했으며 NK 세포 및 트라스투주맙과 함께 배양한 JIMT-1 스페로이드에서 자가사멸 세포 사멸을 예방하는 것으로 나타났습니다. 이 데이터는 ADCC 모델에서 수니티닙의 세포 보호 효과를 확인했으며 ADCC 기반 면역 요법과 수니티닙의 잠재적 조합에 대한 주의를 촉구합니다.요약하면, 당사의 HCS 분석은 ADCC 부스팅 화합물의 식별에 적합할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

연구

암 연구학

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

3D Organotypic 흑색 종 회전 타원 체 피부 모델

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

GPC3 대상으로 Bispecific 항 체, GPC3-S-팹, 강력한 세포 독성을

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Acellular과 세포 폐 종양 전이 연구 모델

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A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

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종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

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종양-기질 상호 작용 및 약물 발견을 연구하기 위한 새로운 기질 섬유아세포 변조 3D 종양 스페로이드 모델

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A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

교모세포종을 위한 3D 스페로이드 모형

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...