Name: quantifying antibody-dependent cellular cytotoxicity in a tumor spheroid model: application for drug discovery
Uploaded: 2024-04-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in a Tumor Spheroid Model: Application for Drug Discovery at JoVE.com

LV recebeu financiamento do National Research, Development and Innovation Office grants GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS", GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE, OTKA K132193 e K147482. Este projeto recebeu financiamento da Rede Húngara de Investigação HUN-REN. As células CD16.176V.NK-92 foram obtidas do Dr. Kerry S. Campbell (Fox Chase Center, Filadélfia, PA, em nome da Brink Biologics, lnc. San Diego, CA), são protegidos por patentes em todo o mundo, e foram licenciados pela Nantkwest, lnc. (www.nantkwest.com). Os autores agradecem a György Vereb e Árpád Szöőr pela ajuda no uso da linhagem celular NK-92 e do TR-F(ab')2, e pelo aconselhamento técnico.

1. Configuração do modelo esferoide de proteína fluorescente reforçada por JIMT-1 (EGFP)
<ol><li>Para formar um fundo repelente de células em forma de U, revestir a placa de 96 poços com solução de agarose-PBS a 0,5% (30 μL/poço). Incubar a placa à temperatura ambiente durante aproximadamente 30-45 min.</li>
	<li>Lavar as células JIMT-1-EGFP duas vezes com 2 mL de PBS estéril (a geração da linhagem celular JIMT1-EGFP foi relatada em publicação anterior17). Utili...

<ol>
	<li>Jubelin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+culture+models+in+oncology+research.">Three-dimensional in vitro culture models in oncology research.</a> Cell Biosci. 12 (1), 155 (2022).</li><li>Mittler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+monitoring+of+drug+effects+in+a+3D+spheroid+model.">High-content monitoring of drug effects in a 3D spheroid model.</a> Front Oncol. 7, 293 (2017).</li><li>Badr-Eldin, S. M., Aldawsari, H. M., Kotta, S., Deb, P. K., Venugopala, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+for+efficient+drug+discovery:+Progress+so+far+and+future+prospects.">Three-dimensional in vitro cell culture models for efficient drug discovery: Progress so far and future prospects.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (8), 926 (2022).</li><li>Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Could+3D+models+of+cancer+enhance+drug+screening.">Could 3D models of cancer enhance drug screening.</a> Biomaterials. 232, 119744 (2020).</li><li>Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroids+as+in+vitro+preclinical+models+for+cancer+research.">Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research.</a> Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).</li><li>Fitzgerald, A. A., Li, E., Weiner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+systems+for+exploring+cancer+immunology.">3D culture systems for exploring cancer immunology.</a> Cancers (Basel). 13 (1), 56 (2020).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening:+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci Rep. 6, 19103 (2016).</li><li>Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+models+and+their+use+for+the+testing+of+immunotherapies.">3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies.</a> Front Immunol. 11, 603640 (2020).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+on+immunotherapy+for+breast+cancer:+Tumor+microenvironment,+nanotechnology+and+more.">Recent progress on immunotherapy for breast cancer: Tumor microenvironment, nanotechnology and more.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 680315 (2021).</li><li>Lo Nigro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK-mediated+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+in+solid+tumors:+Biological+evidence+and+clinical+perspectives.">NK-mediated antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in solid tumors: Biological evidence and clinical perspectives.</a> Ann Transl Med. 7 (5), 105 (2019).</li><li>Sun, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+and+preventions+of+breast+cancer.">Risk factors and preventions of breast cancer.</a> Int J Biol Sci. 13 (11), 1387-1397 (2017).</li><li>Liu, P. H., Wei, J. C., Wang, Y. H., Yeh, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+breast+cancer+incidence+predisposing+risk+factors+identification+using+nationwide+big+data:+A+matched+nested+case-control+study+in+taiwan.">Female breast cancer incidence predisposing risk factors identification using nationwide big data: A matched nested case-control study in taiwan.</a> BMC Cancer. 22 (1), 849 (2022).</li><li>Burguin, A., Diorio, C., Durocher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+treatments:+Updates+and+new+challenges.">Breast cancer treatments: Updates and new challenges.</a> J Pers Med. 11 (8), 808 (2021).</li><li>Costa, R. L. B., Czerniecki, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+development+of+immunotherapies+for+HER2(+)+breast+cancer:+A+review+of+HER2-directed+monoclonal+antibodies+and+beyond.">Clinical development of immunotherapies for HER2(+) breast cancer: A review of HER2-directed monoclonal antibodies and beyond.</a> NPJ Breast Cancer. 6, 10 (2020).</li><li>Musolino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+fcgamma+receptors+in+HER2-targeted+breast+cancer+therapy.">Role of fcgamma receptors in HER2-targeted breast cancer therapy.</a> J Immunother Cancer. 10 (1), e003171 (2022).</li><li>Petricevic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trastuzumab+mediates+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+and+phagocytosis+to+the+same+extent+in+both+adjuvant+and+metastatic+HER2/NEU+breast+cancer+patients.">Trastuzumab mediates antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity and phagocytosis to the same extent in both adjuvant and metastatic HER2/NEU breast cancer patients.</a> J Transl Med. 11, 307 (2013).</li><li>Guti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multitargeted+receptor+tyrosine+kinase+inhibitor+sunitinib+induces+resistance+of+HER2+positive+breast+cancer+cells+to+Trastuzumab-mediated+ADCC.">The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to Trastuzumab-mediated ADCC.</a> Cancer Immunol Immunother. 71 (9), 2151-2168 (2022).</li><li>Barok, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trastuzumab+decreases+the+number+of+circulating+and+disseminated+tumor+cells+despite+Trastuzumab+resistance+of+the+primary+tumor.">Trastuzumab decreases the number of circulating and disseminated tumor cells despite Trastuzumab resistance of the primary tumor.</a> Cancer Lett. 260 (1-2), 198-208 (2008).</li><li>Toth, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+Trastuzumab+and+Pertuzumab+administered+at+approved+doses+may+delay+development+of+Trastuzumab+resistance+by+additively+enhancing+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity.">The combination of Trastuzumab and Pertuzumab administered at approved doses may delay development of Trastuzumab resistance by additively enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity.</a> MAbs. 8 (7), 1361-1370 (2016).</li><li>Ehlers, F. a. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADCC-inducing+antibody+Trastuzumab+and+selection+of+KIR-HLA+ligand+mismatched+donors+enhance+the+NK+cell+anti-breast+cancer+response.">ADCC-inducing antibody Trastuzumab and selection of KIR-HLA ligand mismatched donors enhance the NK cell anti-breast cancer response.</a> Cancers (Basel). 13 (13), 3232 (2021).</li><li>Gangadhara, S., Smith, C., Barrett-Lee, P., Hiscox, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3d+culture+of+Her2++breast+cancer+cells+promotes+AKT+to+MAPK+switching+and+a+loss+of+therapeutic+response.">3d culture of Her2+ breast cancer cells promotes AKT to MAPK switching and a loss of therapeutic response.</a> BMC Cancer. 16, 345 (2016).</li><li>Balalaeva, I. V., Sokolova, E. A., Puzhikhina, A. D., Brilkina, A. A., Deyev, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroids+of+Her2-positive+breast+adenocarcinoma+for+studying+anticancer+immunotoxins+in+vitro.">Spheroids of Her2-positive breast adenocarcinoma for studying anticancer immunotoxins in vitro.</a> Acta Naturae. 9 (1), 38-43 (2017).</li><li>Selis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pegylated+Trastuzumab+fragments+acquire+an+increased+in+vivo+stability+but+show+a+largely+reduced+affinity+for+the+target+antigen.">Pegylated Trastuzumab fragments acquire an increased in vivo stability but show a largely reduced affinity for the target antigen.</a> Int J Mol Sci. 17 (4), 491 (2016).</li><li>Johnston, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening+application+for+cell-type+specific+behaviour+in+heterogeneous+primary+breast+epithelial+subpopulations.">High content screening application for cell-type specific behaviour in heterogeneous primary breast epithelial subpopulations.</a> Breast Cancer Res. 18 (1), 18 (2016).</li><li>Kandaswamy, C., Silva, L. M., Alexandre, L. A., Santos, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+analysis+of+breast+cancer+using+single-cell+deep+transfer+learning.">High-content analysis of breast cancer using single-cell deep transfer learning.</a> J Biomol Screen. 21 (3), 252-259 (2016).</li><li>Esquer, H., Zhou, Q., Abraham, A. D., Labarbera, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+high-content-screening+applications+of+clonogenicity+in+cancer.">Advanced high-content-screening applications of clonogenicity in cancer.</a> SLAS Discov. 25 (7), 734-743 (2020).</li><li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+Her2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab.">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced Her2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li></ol>

Apesar das melhorias significativas no tratamento da CB nas últimas décadas, os pacientes ainda desenvolvem regularmente resistência aos medicamentos ou experimentam efeitos colaterais negativos24. A alta morbidade e mortalidade ligadas à CB exigem uma investigação contínua sobre os mecanismos moleculares subjacentes, assim como plataformas robustas de triagem para identificar novas moléculas acionáveis para o desenvolvimento terapêutico25. Essas estratégias requ...

Os esferoides tumorais multicelulares (STCM) são modelos tridimensionais (3D) amplamente utilizados que se formam devido à tendência das células aderentes em se agregarem e representam uma importante ferramenta para obter informações mecanicistas sobre a biologia das células cancerosas. Eles podem ser gerados a partir de uma ampla gama de tipos celulares por inúmeras técnicas, tais como culturas 3D baseadas em líquido e andaimes1. Sua principal vantagem sobre os modelos 2D monocamada é que eles recapitulam as principais características dos tumores in vivo , ou seja, a organização estrutural e a hipóxia, mimetizando o comportamento biológico das células tumorais, especialmente os mecanismos que levam ao escape terapêutico e à resistência adrogas2. Assim, uma vez que os TCM podem melhorar a previsibilidade da toxicidade e sensibilidade a drogas, eles são amplamente utilizados para estudar cânceres em 3D e poderiam melhorar o desenvolvimento de drogas eficazes para diferentes tipos decâncer3.
Para estudar qualquer doença, há uma necessidade crítica de modelos relevantes e convenientes. A criação de modelos para estudos de imunologia do câncer é um desafio porque o sistema imunológico consiste em vários tipos celulares. Cada tipo de célula tem vários subtipos e um amplo espectro de estados de ativação. Esses diferentes tipos de células imunes interagem com células cancerosas e outros componentes tumorais, influenciando o resultado da doença. Os métodos de cultura de células in vitro 2D falham em recapitular essas interações celulares complexas, pois não têm traduzibilidade e são incapazes de prever a ação de um fármaco no nível do sistema (por exemplo, em tecidos)4,5. Além disso, os modelos de camundongos também têm limitações severas devido às diferenças fundamentais entre os sistemas imunológico humano e murino. Sistemas de cultura 3D podem, portanto, preencher as lacunas atuais nos modelos disponíveis, fornecendo um método alternativo e melhorando nossa compreensão da imunologia do câncer6. Especificamente, modelos esferoides podem ser usados para testar imunoterapias, principalmente para avaliar a eficiência da triagem de drogas e anticorpos terapêuticos para aumentar a infiltração de células imunes e efeitos antitumorais contra os alvos esferoides7. Além disso, o potencial dos TCMS compostos por células em diferentes estados metabólicos e proliferativos para estudar as interações entre células do estroma (por exemplo, linfócitos, macrófagos, fibroblastos) e células cancerosas e para o desenvolvimento de novas estratégias anticâncer tem sido amplamentedemonstrado8. Assim, há uma necessidade vital de corroborar plataformas preditivas e precisas para impulsionar o processo de teste de drogas, levando em consideração a fisiopatologia do microambiente tumoral.
O câncer de mama (CB) é o câncer mais frequente diagnosticado em mulheres no mundo. A classificação clínica dessa doença heterogênea baseia-se na presença de receptores transmembrana, por exemplo, receptores de estrogênio (RE) e progesterona (RP) (coletivamente chamados de receptores hormonais, HR), juntamente com a superexpressão ou amplificação da proteína/oncogene receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2). Com base na expressão imunoistoquímica desses receptores, quatro subtipos são comumente reconhecidos: luminal A (HR+/HER2-), luminal B (HR+/HER2+), HER2-positivo (HR-/HER2+) e triplo-negativo câncer de mama (HR-/HER2-). O grupo HER2+ constitui 10-15% dos casos de CB e é caracterizado por alta expressão de HER2 com ausência de RE e RP, tendo pior prognóstico em relação aos tumores luminais e necessitando de drogas específicas direcionadas contraa proteína HER2/neu9.
O desenvolvimento de CB é um processo de várias etapas, sendo o diagnóstico precoce essencial para o sucesso do tratamento da doença10. No entanto, apesar das opções personalizadas de tratamento do BC recentemente surgidas (por exemplo, terapias endócrinas e de anticorpos anti-HER2), o CB continua a desafiar os oncologistas. Assim como a cirurgia, a quimioterapia e a radioterapia, essas terapias personalizadas também podem ter efeitos adversos graves e os pacientes podem desenvolver resistência a esses agentes, tornando-se um desafio a longo prazo determinar a melhor estratégia11,12. Assim, uma melhor compreensão da interação entre o tumor e seu microambiente é essencial e espera-se que forneça novas direções para o desenvolvimento de novos tratamentos que levem em conta as especificidades dos diferentes subtipos de CB13. Uma nova onda de imunoterapias, tais como conjugados de drogas de anticorpos, terapias adotivas de células T, vacinas e novos anticorpos monoclonais direcionados a HER2 (mAbs) estão sendo estudados em uma ampla população de pacientes com tumores que expressam HER214.
O trastuzumabe, por exemplo, representa uma modalidade de tratamento eficiente para HER2+ CB. Como parte de seu modo de ação, o trastuzumabe medeia atividades dependentes do receptor gama cristalizável de fragmentos (FcγR). Os FcγRs distinguem-se pela sua afinidade pelo fragmento Fc e pela resposta imune que iniciam. A ativação do FcγRIIIa (CD16A) em células natural killer (NK) é crucial para mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), enquanto o desencadeamento de FcγRIIa (CD32A) e FcγRIIIa em macrófagos induz fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP)15. Estudos em modelos animais mostraram que camundongos sem receptores FcγRI (CD64) e FcγRIII (CD16) foram incapazes de iniciar respostas imunes protetoras contra antígenos tumor-específicos, revelando que o ADCC é provavelmente um importante mecanismo de ação para o mAb Trastuzumabe16.
Uma vez que as células NK recorrem ao Abs ligado às células tumorais para a morte de células cancerosas pelo ADCC, a expressão dos receptores Fc é crítica para um tratamento eficaz com Trastuzumabe17 (Figura 1). Além disso, sua ação é eficientemente balanceada por uma estimulação de receptores ativadores e inibitórios, por exemplo, receptores Killer-cell immunoglobulin-like (KIR)18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65922/65922fig01.jpg"> Gráfico 1. Mecanismo do ADCC no contexto de uma resposta antitumoral. O receptor Fcγ de uma célula natural killer (NK) reconhece a região Fc de um anticorpo, que anteriormente se ligou a um antígeno de superfície em uma célula cancerosa. Essa sinapse imunológica leva à degranulação da célula NK, que libera mediadores citotóxicos como granzimas e perforina. Essas moléculas contribuem para a formação de poros na membrana celular e ativam vias apoptóticas causando morte celular programada da célula-alvo (imagem criada com Biorender.com). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65922/65922fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O desenvolvimento de imunoterapia para HER2+ BC representa um campo em evolução. Neste caso, deve-se considerar interações entre vários componentes do sistema imunológico. Além disso, publicações anteriores testaram extensivamente terapias combinadas envolvendo todos os tipos de terapias tradicionais, imunes ou celulares para identificar combinações sinérgicas19.
Vários modelos 3D de HER2+ BC já foram usados para a descoberta de drogas. Por exemplo, Balalaeva e col. utilizaram esferoides SKBR-3 superexpressando HER2 para avaliar a citotoxicidade da imunotoxina direcionada para HER2 4D5scFv-PE4020. Em outro estudo, um sistema de cultura HER2+ BC baseado em Matrigel 3D foi estabelecido para medir o crescimento celular em resposta ao trastuzumabe e agentes endócrinos21. Esses estudos destacam a importância de modelos esferoides tumorais de células cancerosas HER2 superexpressarem uma estratégia eficaz para melhorar clinicamente as respostasterapêuticas22.
Nosso grupo identificou previamente o Sunitinibe, um inibidor multidirecionado da tirosina quinase, como um inibidor do ADCC dependente de trastuzumabe em células JIMT-1 HER2+ BC em um ensaio de cultura 2D. O estudo revelou que o Sunitinib induz autofagia e prejudica a função de morte das células NK, diminuindo a expressão de HER2 e aumentando a fixação superficial das células JIMT-17.
Aqui estabelecemos um novo modelo 3D esferoide de ADCC (células cancerosas NK.92.CD16+Trastuzumab+JIMT-1-EGFP) para ser usado para aplicações de triagem de alto rendimento e, a fim de validar os achados acima mencionados, Sunitinib foi usado como um composto modelo. Primeiro, geramos EGFP expressando células JIMT-117 e crescemos esferoides a partir dessas células. O ADCC foi induzido por células NK juntamente com trastuzumabe, e os esferoides foram mantidos em cultura na presença ou ausência de compostos teste por 24 h (Figura 2). A quantificação do ADCC baseia-se na detecção de morte de células cancerosas apoptóticas (coloração da Anexina V) usando um sistema de Análise de Alto Conteúdo.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65922/65922fig02.jpg"> Gráfico 2. ADCC em um sistema de co-cultura esferoide 3D. Nossas configurações experimentais são baseadas em um sistema esferoide 3D que pode modelar com mais precisão o microambiente in vivo em comparação com modelos 2D. As células de câncer de mama JIMT-1 EGFP foram semeadas em um fundo repelente de células côncavas para formar um aglomerado celular de forma redonda, chamado esferoide. O ADCC foi então iniciado com a adição do NK92. células natural killer CD16 (relação E:T = 20:1) e um anticorpo monoclonal anti-HER2, o trastuzumabe. O modelo experimental mostrou-se eficiente e facilmente aplicável para a identificação de compostos modificadores do ADCC (imagem criada com Biorender.com). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65922/65922fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Demonstramos que a aquisição de dados dessa maneira pode ser feita em tempo real e é estatisticamente robusta para o uso em rastreamento de alto conteúdo na descoberta de medicamentos contra o câncer. É importante ressaltar que este modelo permite uma validação estendida de um conjunto maior de compostos, e pode ser aplicado a vários ensaios de interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well glass bottom Cell Carrier Ultra microplates</td>
			<td>PerkinElmer, Waltham, MA, USA</td>
			<td>LLC 6055302</td>
			<td>for spheroids measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92096</td>
			<td>for cell seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8042</td>
			<td>in NK medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>for spheroids seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-Alexa Fluo 647 conjugate</td>
			<td>Invitrogen-ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A23204</td>
			<td>for apoptosis measurement with HCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16.176 V.NK-92 cells</td>
			<td>Dr. Kerry S. Campbell (the Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA on behalf of Brink Biologics, Inc. San Diego, CA)</td>
			<td>ATCC CRL-2407</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Blue</td>
			<td>Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)</td>
			<td>C2110</td>
			<td>for staining of NK cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td>in JIMT1-EGFP medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>for coating HCS plate before transfering the spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1090/500</td>
			<td>JIMT-1-EGFP and NK medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35,050&#8211;061</td>
			<td>in NK medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0.1</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>for statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony software</td>
			<td>PerkinElmer, Waltham, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>for HCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>Proleukin, Novartis Hung&#225;ria Kft., Budapest, Hungary</td>
			<td>PHC0026</td>
			<td>in NK medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (Humulin R)</td>
			<td>Eli Lilly</td>
			<td>HI0219</td>
			<td>JIMT-1-EGFP medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JIMT-1 breast cancer cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11,140&#8211;050</td>
			<td>in NK medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-115E</td>
			<td>in NK medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix High-Content Analysis equipment</td>
			<td>PerkinElmer, Waltham, MA, USA</td>
			<td>HH14001000</td>
			<td>for HCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Posphate buffered saline)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-517Q</td>
			<td>for washing the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>LM-A4118</td>
			<td>JIMT-1-EGFP and NK medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFP</td>
			<td>Invitrogen, (Prof. J&#243;zsef T<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65922/65922eq01v2.jpg" style="margin: auto;" />zs&#233;r, University of Debrecen)</td>
			<td></td>
			<td>for JIMT-1-EGFP cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic-F127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td>for coating HCS plate before transfering the spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunitinib malate</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>PZ0012</td>
			<td>for treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab Ab (humanized anti-HER2 monoclonal antibody)</td>
			<td>Herzuma&#174;, EGIS Pharmaceuticals, Budapest, Hungary</td>
			<td>NDC-63459-303-43</td>
			<td>for treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab-F(ab&#39;)2</td>
			<td>Gift from Prof. Gy&#246;rgy Vereb and &#193;rp&#225;d Sz&#246;<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65922/65922eq01v2.jpg" style="margin: auto;" />r&#160;</td>
			<td>Department of Biophysics and Cell Biology, University of Debrecen</td>
			<td>for treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4% solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 1X in PBS</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>LM-T1706</td>
			<td>for cells detachment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying antibody-dependent cellular cytotoxicity in a tumor spheroid model: application for drug discovery

A imunoterapia baseada em anticorpos monoclonais direcionada a antígenos tumorais é agora um pilar do tratamento do câncer. Um dos mecanismos clinicamente relevantes de ação dos anticorpos é a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), em que o anticorpo se liga às células cancerosas e engaja o componente celular do sistema imunológico, por exemplo, células natural killer (NK), para matar as células tumorais. A eficácia dessas terapias poderia ser melhorada pela identificação de compostos adjuvantes que aumentam a sensibilidade das células cancerosas ou a potência das células imunes. Além disso, interações medicamentosas não descobertas em pacientes com câncer comedicados para condições prévias ou sintomas associados ao câncer podem determinar o sucesso da terapia com anticorpos; portanto, tais interações medicamentosas indesejadas precisam ser eliminadas. Com esses objetivos em mente, criamos um modelo de ADCC para câncer e descrevemos aqui um protocolo simples para encontrar drogas moduladoras do ADCC. Uma vez que modelos 3D, como esferoides de células cancerosas, são superiores a culturas 2D na previsão de respostas in vivo de tumores a terapias anticâncer, co-culturas esferoides de células de câncer de mama HER2+ JIMT-1 que expressam EGFP e NK92. Linhagens celulares CD16 foram montadas e induzidas com trastuzumabe, um anticorpo monoclonal clinicamente aprovado contra o câncer de mama HER2-positivo. Esferoides JIMT-1 foram deixados formar em placas de 96 poços repelentes de células com fundo U. No dia 3, células NK e trastuzumabe foram adicionados. Os esferoides foram então corados com Annexin V-Alexa 647 para medir a morte celular apoptótica, que foi quantificada na zona periférica dos esferoides com um microscópio automatizado. A aplicabilidade de nosso ensaio para identificar moléculas moduladoras do ADCC é demonstrada mostrando que o Sunitinibe, um inibidor da tirosina quinase do receptor aprovado pelo FDA contra câncer metastático, abole quase completamente o ADCC. A geração dos esferoides e os pipelines de aquisição e análise de imagens são compatíveis com a triagem de alto rendimento para compostos moduladores de ADCC em esferoides de células cancerosas.

EGFP expressando células JIMT-1 foram geradas, e esferoides foram cultivados a partir dessas células. O sunitinibe foi usado como um composto de teste, pois foi demonstrado anteriormente que afeta o curso do ADCC17. Os esferoides foram deixados aglomerar por 72 h. No dia 3, 10 μg/mL de trastuzumabe (ou equimolar 6,6 μg/mL TR-F(ab')219) e células NK (20:1) foram adicionados aos esferoides na presença ou ausência de 20 μM de Sunitinib (1 h pré-tratamento),...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in a Tumor Spheroid Model: Application for Drug Discovery at JoVE.com

Quantifying Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in a Tumor Spheroid Model: Application for Drug Discovery

Aqui, apresentamos um método para identificar compostos que modulam o mecanismo ADCC, um importante mecanismo de morte de células cancerígenas de anticorpos antitumorais. O efeito citotóxico das células NK é medido em esferoides de células de câncer de mama na presença de trastuzumabe. A análise de imagens identifica células assassinas e alvo vivas e mortas em esferoides.

Quantificação da Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos em Modelo Esferoide Tumoral: Aplicação para Descoberta de Fármacos

Monoclonal antibody-based immunotherapy targeting tumor antigens is now a mainstay of cancer treatment. One of the clinically relevant mechanisms of ...

Uma das terapias-alvo mais eficazes contra o câncer é baseada em anticorpos como o anticorpo anti-HER2 trastuzumabe. A ação anticancerígena do trastuzumabe envolve citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos, ADCC, por células natural killer ou NK. A compreensão dos mecanismos que regulam a sensibilidade das células cancerosas à terapia com anticorpos anti-receptor do fator de crescimento, com especial atenção ao ADCC, pode ser crucial para o desenvolvimento de novas modalidades de tratamento mais eficientes.Modelos 3D, como esferoides de células cancerosas, mostraram-se superiores na previsão de respostas imunes de tumores a várias terapias anticâncer. Portanto, montamos um modelo esferoide ADCC usando a linhagem celular natural killer NK92, células de carcinoma de mama JIMT-1 que expressam GFP e trastuzumabe. Configuramos o sistema de ensaio ADCC induzindo as células anti-HER2-positivas do carcinoma de mama JIMT-1 a formar agrupamentos tridimensionais chamados esferoides.A linhagem celular JIMT-1 utilizada nos experimentos expressa de forma estável a proteína verde fluorescente. Iniciamos o experimento preparando a placa de 96 poços para a formação de esferoides. Para criar um fundo em forma de U e repelente de células, cubra a placa de 96 poços com uma solução de agarose a 0,5% em PBS.Incubar a placa à temperatura ambiente durante aproximadamente 30 a 45 minutos. Enquanto isso, tripsinização e contagem de células JIMT-1 para semeadura celular. Lave as células com dois mililitros de PBS estéril.Adicionar dois mililitros de tripsina-EDTA ao balão e voltar a colocá-lo numa incubadora de CO2 durante 10 minutos. Após a incubação, toque no balão para verificar se as células JIMT-1 se destacaram. Pare a digestão com dois mililitros de meio JIMT-1 e colete a suspensão celular em um tubo de 50 mililitros.Conte as células com Azul de Tripano numa câmara de Burker e ajuste o número de células para 20.000 células por ml. Seme as células na placa de 96 poços pipetando a suspensão de células de 100 microlitros em cada poço para a formação de esferoides. Deixe as células se amontoarem durante o tempo de incubação de três dias a 37 graus em uma incubadora de CO2.Verifique o tamanho e a forma dos esferoides regularmente com um microscópio invertido. No terceiro dia após a indução dos esferoides, revestir a placa de triagem de alto conteúdo de 96 poços com uma solução de Pluronic F-127 em DMSO. O revestimento é crucial para evitar a fixação de esferoides JIMT-1 EGFP à superfície de vidro ou à placa.Após um período de incubação de 45 minutos à temperatura ambiente, aspirar a solução de revestimento e lavar os poços duas vezes com meio DMEM F12 sem soro. Transfira os esferoides para a placa de peneiramento de alto conteúdo de 96 poços em triplicatas usando uma pipeta de um mililitro. Adicione sunitinibe aos poços na concentração de 40 micromolares em 10 microlitros por poço e pipete o meio JIMT-1 fresco para os poços de controle, a fim de aumentar o volume.Incubar a placa por uma hora em uma incubadora de CO2 a 37 graus. Enquanto a incubação dos esferoides pré-tratados estiver em andamento, colete as células NK92 do frasco em um tubo de 15 mililitros. Conte as células com Azul de Tripano em uma câmara de Burker e ajuste o número de células para atingir uma relação efetor-alvo de 20 para 1.Manchar as células NK com uma solução de 10 micromolares de CellTracker Blue e colocá-las em uma incubadora de CO2 por uma hora a 37 graus. Para lavar o excesso do corante, centrifugar as células NK duas vezes a 150 RCF por três minutos à temperatura ambiente. Em seguida, ressuspenda as células em mídia JIMT-1 fresca.Adicione as células NK coradas aos esferoides JIMT-1 EGFP alvo pipetando 55 microlitros por poço juntamente com o anticorpo anti-HER2 trastuzumabe. Diluir o trastuzumab em meio JIMT-1 para atingir uma concentração de 10 microgramas por ml. Adicione os 110 microlitros de meio JIMT-1 fresco aos poços de controle e incube a placa por 24 horas em uma incubadora de CO2 a 37 graus.Como resultado, o volume total de tratamento adicionado para o ADCC é de 110 microlitros, e a concentração final de sunitinibe é de 20 micromoles por litro. Para detectar e medir a morte celular apoptótica após os tratamentos, corar os esferoides com um conjugado Annexin V Alexa Fluor 647 por uma hora em meio JIMT-1. Após o término das etapas experimentais, transferir a placa para o dispositivo de análise de alto conteúdo.A placa é fotografada 24 horas após a adição dos fatores NK às células-alvo. Para geração de imagens, estamos usando o analisador de alto conteúdo e um software de análise de imagem. Selecione o tipo de microplaca na lista de placas usando a opção Tipo de placa.Use uma placa de triagem de alto conteúdo de 96 poços. Selecione dois picos de foco automático como os ensaios realizados em placas com objetiva de 10x com abertura numérica de 0,3, usando as opções de foco automático e objetivo, respectivamente. Escolha o modo Confocal com a opção OptiMode e aplique Binning 2 ao uso da opção Binning.Para esferoides de imagem, selecione os canais apropriados usando a opção Seleção de canal. Para detectar as células JIMT-1 transfundidas por EGFP, escolha EGFP com tempo de integração de 200 milissegundos, potência de laser de 50%, altura da pilha de dois micrômetros, excitação de 488 nanômetros e comprimentos de onda de emissão de 500 e 550 nanômetros. E para detectar células apoptóticas, use Alexa 647 com tempo de integração de 100 milissegundos, potência de laser de 50%, altura de pilha de 10 micrômetros, excitação de 640 nanômetros, comprimentos de onda de emissão de 650 e 760 nanômetros.Para visualizar as células NK dentro dos esferoides, escolha o seguinte canal, DAPI com tempo de integração de 100 milissegundos, potência de laser de 50%, altura da pilha de dois micrômetros, excitação de 405 nanômetros e comprimento de onda de emissão de 435 e 418 nanômetros. Na opção Seleção de layout, selecione pilhas Z, pois as células nos esferoides tendem a estar em diferentes planos focais do microscópio. 10 planos com distância de 10 micrômetros são suficientes para cobrir toda a região esferoide.Defina os valores do primeiro plano e do último plano em 0 micrômetro e 90 micrômetros, respectivamente. Antes de iniciar a medição, imagens de amostra podem ser tiradas com a função Snapshot para verificar as configurações corretas. Defina o número de poços e campos para geração de imagens usando a opção Layout definido.Identifique os esferoides pela fluorescência EGFP ou células JIMT-1 usando a opção Região de textura fina e filtre-os por tamanho. Remova objetos de borda usando o módulo Selecionar População. Uma vez que as células positivas para anexina aparecem nos esferoides periféricos, meça a intensidade da anexina no anel apoptótico.No módulo Selecionar Região, defina a borda externa como menos 90. Valores expressos de intensidade de anexina como intensidade média. Como indicado pela coloração de Anexina V, a adição de células NK e trastuzumabe às células JIMT-1 causou morte celular nos esferoides tumorais.Células apoptóticas positivas para anexina emergiram na zona periférica dos esferoides. Na ausência de trastuzumabe, entretanto, as células NK não desencadearam apoptose de células tumorais. Para distinguir entre os efeitos diretos ou mediados pelo ADCC do trastuzumabe, o trastuzumabe-Fab2 sem capacidade de ligação à região FC foi usado neste estudo como controle negativo.Como o trastuzumabe-Fab2 foi ineficaz nesse modelo, é provável que a morte celular tumoral seja mediada pelo ADCC. Além disso, o pré-tratamento com sunitinibe reduziu a coloração de Anexina V nos esferoides, confirmando a resistência ao ADCC induzida pelo sunitinibe e revelando a prevenção de morte celular apoptótica em esferoides JIMT-1 co-incubados com células NK e trastuzumabe. Esses dados confirmaram o efeito citoprotetor do sunitinibe no modelo ADCC e requerem cautela quanto às potenciais combinações de imunoterapias baseadas em ADCC e sunitinibe.Em resumo, nosso ensaio HCS pode ser adequado para a identificação de compostos que aumentam o ADCC.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Pesquisa do câncer

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Geração de esferoides Tumor tridimensional de alta produtividade para triagem de drogas

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Um modelo de pele Melanoma de Organotypic 3D esferoide

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Um direcionamento-GPC3 anticorpo Bispecific, GPC3-S-Fab, com potente citotoxicidade

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Modelo de pulmão acelular e celular para estudar o Tumor metástase

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Um ensaio de matança Spheroid por pilhas de T do carro

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Geração de tumores pancreáticos ortotópicos e caracterização ex vivo da citotoxicidade de células T infiltrada tumoral

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Um novo modelo esferoide de tumor 3D modulado por fibrosa estromal para estudar a interação tumoral-stroma e a descoberta de drogas

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Triagem de drogas de xenoenxertos tumorais derivados do paciente primário em zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Um modelo esferóide 3D para glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...