Name: quantifying antibody-dependent cellular cytotoxicity in a tumor spheroid model: application for drug discovery
Uploaded: 2024-04-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in a Tumor Spheroid Model: Application for Drug Discovery at JoVE.com

LV получил финансирование по грантам Национального управления исследований, разработок и инноваций GINOP-2.3.2-15-2016-00010 TUMORDNS», GINOP-2.3.2-15-2016-00048-STAYALIVE, OTKA K132193 и K147482. Этот проект получил финансирование от Венгерской исследовательской сети HUN-REN. Клетки CD16.176V.NK-92 были получены у д-ра Керри С. Кэмпбелла (Fox Chase Center, Филадельфия, Пенсильвания, по заказу компании Brink Biologics, lnc. Сан-Диего, Калифорния), защищены патентами по всему миру и были лицензированы Nantkwest, lnc. (www.nantkwest.com). Авторы выражают благодарность Дьёрдю Веребу (György Vereb) и Арпаду Шёору (Árpád Szöőr) за помощь в использовании клеточной линии NK-92 и TR-F(ab')2, а также за технические консультации.

1. Создание модели сфероида JIMT-1-усиленного флуоресцентного белка (EGFP)
<ol><li>Чтобы сформировать U-образное дно, отталкивающее клетки, покройте 96-луночную пластину 0,5% раствором агарозы-PBS (30 мкл/лунка). Инкубируйте планшет при комнатной температуре примерно 30-45 мин.</li>
	<li>Промыть кл...

<ol>
	<li>Jubelin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+culture+models+in+oncology+research.">Three-dimensional in vitro culture models in oncology research.</a> Cell Biosci. 12 (1), 155 (2022).</li><li>Mittler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+monitoring+of+drug+effects+in+a+3D+spheroid+model.">High-content monitoring of drug effects in a 3D spheroid model.</a> Front Oncol. 7, 293 (2017).</li><li>Badr-Eldin, S. M., Aldawsari, H. M., Kotta, S., Deb, P. K., Venugopala, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+cell+culture+models+for+efficient+drug+discovery:+Progress+so+far+and+future+prospects.">Three-dimensional in vitro cell culture models for efficient drug discovery: Progress so far and future prospects.</a> Pharmaceuticals (Basel). 15 (8), 926 (2022).</li><li>Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Could+3D+models+of+cancer+enhance+drug+screening.">Could 3D models of cancer enhance drug screening.</a> Biomaterials. 232, 119744 (2020).</li><li>Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+spheroids+as+in+vitro+preclinical+models+for+cancer+research.">Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research.</a> Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).</li><li>Fitzgerald, A. A., Li, E., Weiner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+culture+systems+for+exploring+cancer+immunology.">3D culture systems for exploring cancer immunology.</a> Cancers (Basel). 13 (1), 56 (2020).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening:+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci Rep. 6, 19103 (2016).</li><li>Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+models+and+their+use+for+the+testing+of+immunotherapies.">3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies.</a> Front Immunol. 11, 603640 (2020).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+on+immunotherapy+for+breast+cancer:+Tumor+microenvironment,+nanotechnology+and+more.">Recent progress on immunotherapy for breast cancer: Tumor microenvironment, nanotechnology and more.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 680315 (2021).</li><li>Lo Nigro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NK-mediated+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+in+solid+tumors:+Biological+evidence+and+clinical+perspectives.">NK-mediated antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in solid tumors: Biological evidence and clinical perspectives.</a> Ann Transl Med. 7 (5), 105 (2019).</li><li>Sun, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+and+preventions+of+breast+cancer.">Risk factors and preventions of breast cancer.</a> Int J Biol Sci. 13 (11), 1387-1397 (2017).</li><li>Liu, P. H., Wei, J. C., Wang, Y. H., Yeh, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+breast+cancer+incidence+predisposing+risk+factors+identification+using+nationwide+big+data:+A+matched+nested+case-control+study+in+taiwan.">Female breast cancer incidence predisposing risk factors identification using nationwide big data: A matched nested case-control study in taiwan.</a> BMC Cancer. 22 (1), 849 (2022).</li><li>Burguin, A., Diorio, C., Durocher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+treatments:+Updates+and+new+challenges.">Breast cancer treatments: Updates and new challenges.</a> J Pers Med. 11 (8), 808 (2021).</li><li>Costa, R. L. B., Czerniecki, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+development+of+immunotherapies+for+HER2(+)+breast+cancer:+A+review+of+HER2-directed+monoclonal+antibodies+and+beyond.">Clinical development of immunotherapies for HER2(+) breast cancer: A review of HER2-directed monoclonal antibodies and beyond.</a> NPJ Breast Cancer. 6, 10 (2020).</li><li>Musolino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+fcgamma+receptors+in+HER2-targeted+breast+cancer+therapy.">Role of fcgamma receptors in HER2-targeted breast cancer therapy.</a> J Immunother Cancer. 10 (1), e003171 (2022).</li><li>Petricevic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trastuzumab+mediates+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity+and+phagocytosis+to+the+same+extent+in+both+adjuvant+and+metastatic+HER2/NEU+breast+cancer+patients.">Trastuzumab mediates antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity and phagocytosis to the same extent in both adjuvant and metastatic HER2/NEU breast cancer patients.</a> J Transl Med. 11, 307 (2013).</li><li>Guti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multitargeted+receptor+tyrosine+kinase+inhibitor+sunitinib+induces+resistance+of+HER2+positive+breast+cancer+cells+to+Trastuzumab-mediated+ADCC.">The multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor sunitinib induces resistance of HER2 positive breast cancer cells to Trastuzumab-mediated ADCC.</a> Cancer Immunol Immunother. 71 (9), 2151-2168 (2022).</li><li>Barok, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trastuzumab+decreases+the+number+of+circulating+and+disseminated+tumor+cells+despite+Trastuzumab+resistance+of+the+primary+tumor.">Trastuzumab decreases the number of circulating and disseminated tumor cells despite Trastuzumab resistance of the primary tumor.</a> Cancer Lett. 260 (1-2), 198-208 (2008).</li><li>Toth, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combination+of+Trastuzumab+and+Pertuzumab+administered+at+approved+doses+may+delay+development+of+Trastuzumab+resistance+by+additively+enhancing+antibody-dependent+cell-mediated+cytotoxicity.">The combination of Trastuzumab and Pertuzumab administered at approved doses may delay development of Trastuzumab resistance by additively enhancing antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity.</a> MAbs. 8 (7), 1361-1370 (2016).</li><li>Ehlers, F. a. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADCC-inducing+antibody+Trastuzumab+and+selection+of+KIR-HLA+ligand+mismatched+donors+enhance+the+NK+cell+anti-breast+cancer+response.">ADCC-inducing antibody Trastuzumab and selection of KIR-HLA ligand mismatched donors enhance the NK cell anti-breast cancer response.</a> Cancers (Basel). 13 (13), 3232 (2021).</li><li>Gangadhara, S., Smith, C., Barrett-Lee, P., Hiscox, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3d+culture+of+Her2++breast+cancer+cells+promotes+AKT+to+MAPK+switching+and+a+loss+of+therapeutic+response.">3d culture of Her2+ breast cancer cells promotes AKT to MAPK switching and a loss of therapeutic response.</a> BMC Cancer. 16, 345 (2016).</li><li>Balalaeva, I. V., Sokolova, E. A., Puzhikhina, A. D., Brilkina, A. A., Deyev, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroids+of+Her2-positive+breast+adenocarcinoma+for+studying+anticancer+immunotoxins+in+vitro.">Spheroids of Her2-positive breast adenocarcinoma for studying anticancer immunotoxins in vitro.</a> Acta Naturae. 9 (1), 38-43 (2017).</li><li>Selis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pegylated+Trastuzumab+fragments+acquire+an+increased+in+vivo+stability+but+show+a+largely+reduced+affinity+for+the+target+antigen.">Pegylated Trastuzumab fragments acquire an increased in vivo stability but show a largely reduced affinity for the target antigen.</a> Int J Mol Sci. 17 (4), 491 (2016).</li><li>Johnston, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening+application+for+cell-type+specific+behaviour+in+heterogeneous+primary+breast+epithelial+subpopulations.">High content screening application for cell-type specific behaviour in heterogeneous primary breast epithelial subpopulations.</a> Breast Cancer Res. 18 (1), 18 (2016).</li><li>Kandaswamy, C., Silva, L. M., Alexandre, L. A., Santos, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+analysis+of+breast+cancer+using+single-cell+deep+transfer+learning.">High-content analysis of breast cancer using single-cell deep transfer learning.</a> J Biomol Screen. 21 (3), 252-259 (2016).</li><li>Esquer, H., Zhou, Q., Abraham, A. D., Labarbera, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+high-content-screening+applications+of+clonogenicity+in+cancer.">Advanced high-content-screening applications of clonogenicity in cancer.</a> SLAS Discov. 25 (7), 734-743 (2020).</li><li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+Her2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab.">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced Her2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li></ol>

Несмотря на значительные улучшения в лечении РМЖ за последние несколько десятилетий, у пациентов по-прежнему регулярно развивается лекарственная устойчивость или возникают негативныепобочные эффекты. Высокая заболеваемость и смертность, связанные с РМЖ, требуют продол?...

Многоклеточные опухолевые сфероиды (MCTS) представляют собой широко используемые трехмерные (3D) модели, которые формируются из-за тенденции адгезивных клеток к агрегации и представляют собой важный инструмент для получения механистического понимания биологии раковых клеток. Они могут быть получены из широкого спектра типов клеток с помощью многочисленных методов, таких как 3D-культуры на основе жидкости и каркаса1. Их основное преимущество перед монослойными 2D-моделями заключается в том, что они повторяют основные особенности опухолей in vivo, а именно структурную организацию и гипоксию, имитируя биологическое поведение опухолевых клеток, особенно механизмы, приводящие к терапевтическому бегствуи лекарственной устойчивости. Таким образом, поскольку MCTS могут улучшить предсказуемость токсичности и чувствительности к лекарственным препаратам, они широко используются для изучения рака в 3D и могут способствовать разработке эффективных лекарств для различныхтипов рака.
Для изучения любого заболевания существует острая потребность в актуальных и удобных моделях. Создание моделей для иммунологических исследований рака является сложной задачей, поскольку иммунная система состоит из нескольких типов клеток. Каждый тип клеток имеет несколько подтипов и широкий спектр состояний активации. Эти различные типы иммунных клеток взаимодействуют с раковыми клетками и другими опухолевыми компонентами, в конечном итоге влияя на исход заболевания. Двухмерные методы культивирования клеток in vitro не позволяют повторить эти сложные клеточные взаимодействия, поскольку им не хватает транслятивности, и они не могут предсказать действие лекарственного препарата на системном уровне (например, в тканях)4,5. Более того, мышиные модели также имеют серьезные ограничения из-за фундаментальных различий между иммунной системой человека и мыши. Таким образом, системы 3D-культивирования могут заполнить существующие пробелы в имеющихся моделях, предоставляя альтернативный метод и улучшая наше понимание иммунологии рака. В частности, сфероидные модели могут быть использованы для тестирования иммунотерапии, главным образом для оценки эффективности скрининга лекарственных средств и терапевтических антител для усиления инфильтрации иммунных клеток и противоопухолевых эффектов в отношении сфероидных мишеней7. Кроме того, потенциал MCTS, состоящего из клеток, находящихся в различных метаболических и пролиферативных состояниях, для изучения взаимодействий между клетками стромы (например, лимфоцитами, макрофагами, фибробластами) и раковыми клетками, а также для разработки новых противоопухолевых стратегий8. Следовательно, существует насущная необходимость в подтверждении прогностических и точных платформ для ускорения процесса тестирования лекарственных средств с учетом патофизиологии микроокружения опухоли.
Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее частым онкологическим заболеванием, диагностируемым у женщин во всем мире. Клиническая классификация этого гетерогенного заболевания основана на наличии трансмембранных рецепторов, например, рецепторов эстрогена (ER) и прогестерона (PR) (в совокупности называемых рецепторами гормонов, HR), а также на гиперэкспрессии или амплификации белка/онкогена рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER2). На основании иммуногистохимической экспрессии этих рецепторов обычно выделяют четыре подтипа: люминальный А (HR+/HER2-), люминальный B (HR+/HER2+), HER2-положительный (HR-/HER2+) и трижды негативный рак молочной железы (HR-/HER2-). Группа HER2+ составляет 10-15% случаев РМЖ и характеризуется высокой экспрессией HER2 при отсутствии ЭР и ПР, имеет худший прогноз по сравнению с люминальными опухолями и требует специфических препаратов, направленных против белка HER2/neu9.
Развитие РМЖ является многоступенчатым процессом, и ранняя диагностика имеет важное значение для успешного лечения заболевания10. Однако, несмотря на недавно появившиеся персонализированные варианты лечения РМЖ (например, эндокринная терапия и терапия антителами к HER2), РМЖ продолжает бросать вызов онкологам. Так же, как хирургия, химиотерапия и лучевая терапия, эти персонализированные методы лечения также могут иметь серьезные побочные эффекты, и у пациентов может развиться резистентность к этим препаратам, что делает определение наилучшейстратегии в долгосрочной перспективе сложной задачей. Следовательно, улучшение понимания взаимодействия между опухолью и ее микроокружением имеет важное значение и, как ожидается, обеспечит новые направления для разработки новых методов лечения, учитывающих специфику различных подтипов РМЖ13. Новая волна иммунотерапии, такая как конъюгаты антител, адоптивная Т-клеточная терапия, вакцины и новые моноклональные антитела (мАТ), направленные на HER2, изучается в широкой популяции пациентов с опухолями, экспрессирующими HER214.
Трастузумаб, например, представляет собой эффективный метод лечения HER2+ РМЖ. В рамках механизма действия трастузумаб опосредует фрагментарную кристаллизующийся гамма-рецептор (FcγR)-зависимую активность. FcγR отличаются своим сродством к Fc-фрагменту и иммунным ответом, который они инициируют. Активация FcγRIIIa (CD16A) на естественных клетках-киллерах (NK) имеет решающее значение для опосредования антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), в то время как активация FcγRIIa (CD32A) и FcγRIIIa на макрофагах индуцирует антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP)15. Исследования на животных моделях показали, что мыши, у которых отсутствовали рецепторы FcγRI (CD64) и FcγRIII (CD16), не могли инициировать защитный иммунный ответ против опухолеспецифических антигенов, что показало, что ADCC, вероятно, является основным механизмом действия mAb трастузумаба16.
Поскольку NK-клетки прибегают к связанным с опухолевыми клетками Abs для уничтожения раковых клеток с помощью ADCC, экспрессия Fc-рецепторов имеет решающее значение для эффективного лечения трастузумабом17 (рис. 1). Кроме того, их действие эффективно уравновешивается стимуляцией активирующих и тормозящих рецепторов, например, иммуноглобулиноподобных рецепторов клеток-киллеров (KIR)18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65922/65922fig01.jpg"> Рисунок 1. Механизм ADCC в контексте противоопухолевого ответа. Рецептор Fcγ естественной клетки-киллера (NK) распознает Fc-участок антитела, который ранее связывался с поверхностным антигеном на раковой клетке. Этот иммунологический синапс приводит к дегрануляции NK-клетки, которая высвобождает цитотоксические медиаторы, такие как гранзимы и перфорин. Эти молекулы способствуют образованию пор в клеточной мембране и активируют апоптотические пути, вызывая запрограммированную гибель клетки-мишени (изображение, созданное с помощью Biorender.com). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65922/65922fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Разработка иммунотерапии HER2+ BC представляет собой развивающуюся область. При этом следует учитывать взаимодействия между различными компонентами иммунной системы. Кроме того, в предыдущих публикациях проводилось всестороннее тестирование комбинированной терапии, включающей все виды традиционной, иммунной или клеточной терапии, для выявления синергетических комбинаций19.
Несколько 3D-моделей HER2+ BC ранее использовались для разработки новых лекарственных препаратов. Например, Балалаева и др. использовали сфероиды SKBR-3, гиперэкспрессирующие HER2, для оценки цитотоксичности HER2-таргетного иммунотоксина 4D5scFv-PE4020. В другом исследовании была создана 3D-система культивирования HER2+ BC на основе Matrigel для измерения роста клеток в ответ на трастузумаб и эндокринные агенты21. Эти исследования подчеркивают важность опухолевой сфероидной модели гиперэкспрессии раковых клеток HER2 в представлении эффективной стратегии клинического улучшения терапевтических ответов22.
Наша группа ранее идентифицировала сунитиниб, многоцелевой ингибитор тирозинкиназы, в качестве ингибитора трастузумаб-зависимого ADCC в клетках JIMT-1 HER2+ BC в 2D-культуральном анализе. Исследование показало, что сунитиниб индуцирует аутофагию и нарушает функцию уничтожения NK-клеток, подавляя экспрессию HER2 и усиливая поверхностное прикрепление клеток JIMT-117.
Здесь мы создали новую 3D-модель сфероида ADCC (раковые клетки NK.92.CD16+Трастузумаб+JIMT-1-EGFP), которая будет использоваться для высокопроизводительного скрининга, а для подтверждения вышеупомянутых результатов в качестве модельного соединения был использован сунитиниб. Во-первых, мы сгенерировали EGFP, экспрессирующий клетки JIMT-117 , и вырастили сфероиды из этих клеток. ADCC индуцировали NK-клетками вместе с трастузумабом, а сфероиды хранили в культуре в присутствии или отсутствии исследуемых соединений в течение 24 ч (рис. 2). Количественная оценка ADCC основана на выявлении апоптотической гибели раковых клеток (окрашивание Annexin V) с помощью системы High-Content Analysis.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65922/65922fig02.jpg"> Рисунок 2. ADCC в системе кокультивирования 3D сфероидов. Наши экспериментальные установки основаны на 3D-сфероидной системе, которая может более точно моделировать микроокружение in vivo по сравнению с 2D-моделями. Клетки рака молочной железы JIMT-1 EGFP были высеяны на вогнутое клеточное репеллентное дно, чтобы сформировать клеточный кластер круглой формы, называемый сфероидом. Затем был инициирован ADCC путем добавления NK92. CD16 естественные клетки-киллеры (соотношение E:T = 20:1) и моноклональное антитело против HER2, трастузумаб. Экспериментальная модель оказалась эффективной и легко применимой для идентификации ADCC-модифицирующих испытуемых соединений (изображение, полученное с помощью Biorender.com). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65922/65922fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Мы продемонстрировали, что получение данных таким образом может быть выполнено в режиме реального времени и является статистически надежным для использования в скрининге с высоким содержанием при разработке лекарств от рака. Важно отметить, что эта модель позволяет проводить расширенную валидацию большего набора соединений и может быть применена к нескольким анализам, представляющим интерес.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well glass bottom Cell Carrier Ultra microplates</td>
			<td>PerkinElmer, Waltham, MA, USA</td>
			<td>LLC 6055302</td>
			<td>for spheroids measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92096</td>
			<td>for cell seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8042</td>
			<td>in NK medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td>for spheroids seeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-Alexa Fluo 647 conjugate</td>
			<td>Invitrogen-ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A23204</td>
			<td>for apoptosis measurement with HCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16.176 V.NK-92 cells</td>
			<td>Dr. Kerry S. Campbell (the Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA on behalf of Brink Biologics, Inc. San Diego, CA)</td>
			<td>ATCC CRL-2407</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Blue</td>
			<td>Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)</td>
			<td>C2110</td>
			<td>for staining of NK cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8437</td>
			<td>in JIMT1-EGFP medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>for coating HCS plate before transfering the spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>FB-1090/500</td>
			<td>JIMT-1-EGFP and NK medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35,050&#8211;061</td>
			<td>in NK medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 8.0.1</td>
			<td>GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>for statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony software</td>
			<td>PerkinElmer, Waltham, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td>for HCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>Proleukin, Novartis Hung&#225;ria Kft., Budapest, Hungary</td>
			<td>PHC0026</td>
			<td>in NK medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (Humulin R)</td>
			<td>Eli Lilly</td>
			<td>HI0219</td>
			<td>JIMT-1-EGFP medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JIMT-1 breast cancer cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11,140&#8211;050</td>
			<td>in NK medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-115E</td>
			<td>in NK medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix High-Content Analysis equipment</td>
			<td>PerkinElmer, Waltham, MA, USA</td>
			<td>HH14001000</td>
			<td>for HCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Posphate buffered saline)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-517Q</td>
			<td>for washing the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>LM-A4118</td>
			<td>JIMT-1-EGFP and NK medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFP</td>
			<td>Invitrogen, (Prof. J&#243;zsef T<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65922/65922eq01v2.jpg" style="margin: auto;" />zs&#233;r, University of Debrecen)</td>
			<td></td>
			<td>for JIMT-1-EGFP cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic-F127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443</td>
			<td>for coating HCS plate before transfering the spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunitinib malate</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>PZ0012</td>
			<td>for treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab Ab (humanized anti-HER2 monoclonal antibody)</td>
			<td>Herzuma&#174;, EGIS Pharmaceuticals, Budapest, Hungary</td>
			<td>NDC-63459-303-43</td>
			<td>for treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab-F(ab&#39;)2</td>
			<td>Gift from Prof. Gy&#246;rgy Vereb and &#193;rp&#225;d Sz&#246;<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65922/65922eq01v2.jpg" style="margin: auto;" />r&#160;</td>
			<td>Department of Biophysics and Cell Biology, University of Debrecen</td>
			<td>for treatments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4% solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>for cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 1X in PBS</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>LM-T1706</td>
			<td>for cells detachment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying antibody-dependent cellular cytotoxicity in a tumor spheroid model: application for drug discovery

Иммунотерапия на основе моноклональных антител, нацеленная на опухолевые антигены, в настоящее время является основой лечения рака. Одним из клинически значимых механизмов действия антител является антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC), при которой антитело связывается с раковыми клетками и вовлекает клеточный компонент иммунной системы, например, естественные клетки-киллеры (NK), для уничтожения опухолевых клеток. Эффективность этих методов лечения может быть повышена путем выявления адъювантных соединений, которые повышают чувствительность раковых клеток или эффективность иммунных клеток. Кроме того, необнаруженные лекарственные взаимодействия у онкологических больных, получающих сопутствующие препараты в связи с предыдущими заболеваниями или симптомами, связанными с раком, могут определять успех терапии антителами; Поэтому такие нежелательные лекарственные взаимодействия необходимо устранить. С этими целями мы создали модель ADCC рака и описали здесь простой протокол для поиска ADCC-модулирующих препаратов. Поскольку 3D-модели, такие как сфероиды раковых клеток, превосходят 2D-культуры в прогнозировании in vivo ответов опухолей на противоопухолевую терапию, сфероидные кокультуры EGFP-экспрессирующих HER2+ JIMT-1 клеток рака молочной железы и NK92. Клеточные линии CD16 были созданы и индуцированы трастузумабом, моноклональным антителом, клинически одобренным против HER2-положительного рака молочной железы. Сфероидам JIMT-1 было позволено формироваться в клеточных репеллентных 96-луночных планшетах с U-образным дном. На 3-е сутки добавляли NK-клетки и трастузумаб. Затем сфероиды окрашивали аннексином V-Alexa 647 для измерения апоптотической гибели клеток, которую количественно определяли в периферической зоне сфероидов с помощью автоматизированного микроскопа. Применимость нашего анализа для идентификации ADCC-модулирующих молекул демонстрируется на примере того, что сунитиниб, рецепторный ингибитор тирозинкиназы, одобренный FDA против метастатического рака, почти полностью отменяет ADCC. Генерация сфероидов, а также конвейеры получения и анализа изображений совместимы с высокопроизводительным скринингом ADCC-модулирующих соединений в сфероидах раковых клеток.

Были получены EGFP, экспрессирующие клетки JIMT-1, и из этих клеток были выращены сфероиды. В качестве тестового соединения использовали сунитиниб, так как ранее было показано, что он влияет на течение ADCC17. Сфероидам было позволено слипаться в течение 72 ч. На 3-е сутки к сфероидам ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in a Tumor Spheroid Model: Application for Drug Discovery at JoVE.com

Quantifying Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in a Tumor Spheroid Model: Application for Drug Discovery

В этой статье мы представляем метод идентификации соединений, которые модулируют механизм ADCC, важный механизм уничтожения раковых клеток противоопухолевыми антителами. Цитотоксический эффект NK-клеток измеряется в сфероидах клеток рака молочной железы в присутствии трастузумаба. Анализ изображений позволяет идентифицировать живые и мертвые клетки-убийцы и клетки-мишени в сфероидах.

Количественная оценка антителозависимой клеточной цитотоксичности в модели сфероида опухоли: заявка на разработку лекарственного препарата

Monoclonal antibody-based immunotherapy targeting tumor antigens is now a mainstay of cancer treatment. One of the clinically relevant mechanisms of ...

Одна из самых эффективных таргетных терапий рака основана на антителах, таких как антитела к HER2 трастузумаб. Противораковое действие трастузумаба включает антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность, ADCC, естественными киллерами или NK-клетками. Понимание механизмов, регулирующих чувствительность раковых клеток к терапии антителами к рецепторам фактора роста, с особым вниманием к ADCC, может иметь решающее значение для разработки новых, более эффективных методов лечения.3D-модели, такие как сфероиды раковых клеток, доказали свое превосходство в прогнозировании иммунного ответа опухолей на различные противораковые препараты. Поэтому мы создали модель сфероида ADCC, используя линию естественных клеток-киллеров NK92, GFP-экспрессирующие клетки карциномы молочной железы JIMT-1 и трастузумаб. Мы настроили систему анализа ADCC, индуцируя анти-HER2-положительные клетки карциномы молочной железы JIMT-1 для формирования трехмерных кластеров, называемых сфероидами.Клеточная линия JIMT-1, используемая в экспериментах, стабильно экспрессирует зеленый флуоресцентный белок. Начинаем эксперимент с подготовки 96-луночной пластины к формированию сфероидов. Для создания U-образного и клеточно-отталкивающего дна 96-луночную пластину покрыть раствором 0,5%-ной агарозы в ПБС.Инкубируйте планшет при комнатной температуре примерно от 30 до 45 минут. Тем временем трипсинизацию и подсчитывают клетки JIMT-1 для клеточного посева. Промойте клетки двумя миллилитрами стерильного ПБС.Добавьте в колбу два миллилитра трипсина-ЭДТА и поместите колбу обратно в CO2-инкубатор на 10 минут. После инкубации постучите по колбе, чтобы проверить, отделились ли клетки JIMT-1. Остановите сбраживание двумя миллилитрами среды JIMT-1 и соберите клеточную суспензию в 50-миллилитровую пробирку.Подсчитайте количество клеток с трипановым синим в камере Беркера и отрегулируйте количество клеток до 20 000 клеток на мл. Засейте клетки в 96-луночную пластину, пипетируя 100 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку для образования сфероидов. Дайте клеткам слипаться в течение трех дней инкубации при температуре 37 градусов в CO2-инкубаторе.Регулярно проверяйте размер и форму сфероидов с помощью инвертированного микроскопа. На третий день после индукции сфероидов покройте 96-луночный скрининговый планшет с высоким содержанием раствором Pluronic F-127 в ДМСО. Покрытие имеет решающее значение для предотвращения прилипания сфероидов JIMT-1 EGFP к поверхности стекла или пластине.После инкубационного периода продолжительностью 45 минут при комнатной температуре отсасывайте раствор покрытия и дважды промойте лунки безсывороточным материалом DMEM F12. Перенесите сфероиды на 96-луночный скрининговый планшет с высоким содержанием в трех экземплярах с помощью пипетки объемом один миллилитр. Добавляют сунитиниб в лунки с концентрацией 40 микромоляров в 10 микролитров на лунку, а пипетку свежей среды ДЖИМТ-1 в контрольные лунки для увеличения объема.Инкубируйте планшет в течение одного часа в СО2-инкубаторе при температуре 37 градусов. Пока идет инкубация предварительно обработанных сфероидов, соберите клетки NK92 из колбы в 15-миллилитровую пробирку. Подсчитайте количество клеток с трипановым синим в камере Беркера и отрегулируйте количество клеток так, чтобы достичь соотношения эффектора к мишени 20 к 1.Окрасьте NK-клетки 10-микромолярным раствором CellTracker Blue и поместите их в CO2-инкубатор на один час при температуре 37 градусов. Чтобы смыть излишки красителя, центрифугируют NK-клетки дважды при 150 RCF в течение трех минут при комнатной температуре. Затем повторно суспендируйте ячейки в свежей среде JIMT-1.Добавьте окрашенные NK-клетки к целевым сфероидам JIMT-1 EGFP путем пипетирования 55 микролитров на лунку вместе с трастузумабом на антитела к HER2. Разбавляют трастузумаб в среде JIMT-1 до концентрации 10 мкг на мл. Добавьте 110 микролитров свежей среды JIMT-1 в контрольные лунки и инкубируйте планшет в течение 24 часов в CO2-инкубаторе при температуре 37 градусов.В результате общий объем обработки, добавленной для ADCC, составляет 110 микролитров, а конечная концентрация сунитиниба составляет 20 микромолей на литр. Чтобы обнаружить и измерить апоптотическую гибель клеток после лечения, окрасьте сфероиды конъюгатом Annexin V Alexa Fluor 647 в течение одного часа в среде JIMT-1. После завершения экспериментальных этапов перенесите планшет на анализирующее устройство с высоким содержанием вещества.Планшет визуализируют через 24 часа после добавления NK-факторов к клеткам-мишеням. Для визуализации мы используем анализатор высокого содержания и программное обеспечение для анализа изображений. Выберите тип микропластины из списка пластин с помощью параметра Тип пластины.Используйте 96-луночную просеивающую пластину с высоким содержанием. Выберите два пиковых автофокуса в качестве анализов, выполняемых на планшетах с 10-кратным объективом с числовой апертурой 0,3, используя параметры автофокусировки и объектива соответственно. Выберите конфокальный режим с параметром OptiMode и примените Биннинг 2 к параметру Биннинг.Для получения изображений сфероидов выберите соответствующие каналы с помощью параметра «Выбор канала». Для обнаружения клеток JIMT-1, перелитых с помощью EGFP, выберите EGFP со временем интегрирования 200 миллисекунд, мощностью лазера 50%, высотой стека два микрометра, возбуждением 488 нанометров и длиной волны излучения 500, 550 нанометров. А для обнаружения апоптотических клеток используйте Alexa 647 со временем интегрирования 100 миллисекунд, мощностью лазера 50%, высотой стека 10 микрометров, возбуждением 640 нм, длиной волны излучения 650, 760 нанометров.Чтобы визуализировать NK-ячейки внутри сфероидов, выберите следующий канал: DAPI со временем интегрирования 100 миллисекунд, мощностью лазера 50%, высотой стека два микрометра, возбуждением 405 нанометров и длиной волны излучения 435, 418 нанометров. В опции Layout Selection выберите стеки Z, так как ячейки в сфероидах имеют тенденцию находиться в разных фокальных плоскостях микроскопа. 10 плоскостей с расстоянием 10 микрометров достаточно, чтобы покрыть всю область сфероида.Установите значения первой и последней плоскостей на 0 мкм и 90 мкм соответственно. Перед началом измерения с помощью функции «Моментальный снимок» можно сделать снимки образцов, чтобы проверить правильность настроек. Задайте количество лунок и полей для визуализации с помощью параметра Defined Layout.Идентификация сфероидов по флуоресценции EGFP или клеткам JIMT-1 с помощью опции Fine Texture Region и фильтрация по размеру. Удалите объекты границ с помощью модуля «Выбор популяции». Поскольку аннексин-положительные клетки появляются на периферических сфероидах, измерьте интенсивность аннексина в апоптотическом кольце.В модуле «Выбор региона» задайте для параметра «Внешняя граница» значение минус 90. Выразите значения интенсивности Annexin как среднюю интенсивность. Как показало окрашивание аннексином V, добавление NK-клеток и трастузумаба к клеткам JIMT-1 вызывало гибель клеток в опухолевых сфероидах.Аннексин-позитивные апоптотические клетки появились в периферической зоне сфероидов. Однако в отсутствие трастузумаба NK-клетки не запускали апоптоз опухолевых клеток. Для дифференциации между прямыми или ADCC-опосредованными эффектами трастузумаба в качестве отрицательного контроля использовали трастузумаб-Fab2, не обладающий способностью связывать ФК-регионы.Поскольку трастузумаб-Fab2 был неэффективен в этой модели, гибель опухолевых клеток, вероятно, опосредована через ADCC. Кроме того, предварительная обработка сунитинибом снижала окрашивание аннексина V в сфероидах, подтверждая индуцированную сунитинибом резистентность ADCC и выявляя предотвращение апоптотической гибели клеток в сфероидах JIMT-1, инкубированных совместно с NK-клетками и трастузумабом. Эти данные подтвердили цитопротекторный эффект сунитиниба в модели ADCC и призывают к осторожности в отношении потенциальных комбинаций иммунотерапии на основе ADCC и сунитиниба.Таким образом, наш анализ HCS может быть подходящим для идентификации соединений, повышающих ADCC.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Имаджинальное Disc Опухоль Модель: Визуализация и Количественная экспрессии генов и опухолевой инвазии с использованием генетических Мозаики

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Поколение высокопроизводительных трехмерных опухоли сфероидов для скрининга наркотиков

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Модель 3D Organotypic меланомы кожи сфероида

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

GPC3-ориентация Bispecific антител, GPC3-S-Fab, с мощным цитотоксичности

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

Бесклеточной и клеточных легких модель для изучения метастазов опухоли

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Убийство Assay сфероида клетками T автомобилей

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Поколение ортотопических опухолей поджелудочной железы и Ex vivo Характеристика опухоли-проникновения T клеточной цитотоксичности

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Роман Стромальный Фибробласт-Модулированные 3D опухолевой сфероидной модели для изучения опухоли-Строма Взаимодействия и наркотиков Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Скрининг наркотиков первичного пациента, полученных опухоли Xenografts в зебрафиш

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

3D сфероидная модель для глиобластомы

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...