Name: लेखक स्पॉटलाइट: सेल बैरियर अखंडता का आकलन करने के लिए टीईईआर डिटेक्शन के अनुप्रयोग
Uploaded: 2023-09-29T13:40:00
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हम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82274207 और 82104533), निंग्ज़िया के प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2023BEG02012), और चेंगदू विश्वविद्यालय टीसीएम (XKTD2022013) के ज़िंगलिन स्कॉलर रिसर्च प्रमोशन प्रोजेक्ट से वित्तीय सहायता की सराहना करते हैं।

नोट: माउस मस्तिष्क व्युत्पन्न Endothelial कोशिकाओं.3 (bEnd.3) विशिष्ट मध्यम परिस्थितियों में BBB के इन विट्रो मॉडल में एक सरल निर्माण करने के लिए एक 24 अच्छी तरह से थाली के कक्षों में inoculated थे. सामान्य कोशिकाओं और हाइ?...

सेल बाधा अखंडता का आकलन करने के लिए Transendothelial प्रतिरोध माप

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सबसे विकसित शारीरिक अंगों में से एक, मस्तिष्क जटिल शारीरिक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला को नियंत्रित करता है, जिसमें स्मृति, अनुभूति, श्रवण, गंध और आंदोलन27 शामिल हैं। मस्तिष्क एक ही समय ?...

बीबीबी रक्त परिसंचरण और तंत्रिका ऊतक के बीच एक अद्वितीय जैविक इंटरफ़ेस है, जो संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं, पेरिसाइट्स, एस्ट्रोसाइट्स, न्यूरॉन्स और अन्यसेलुलर संरचनाओं से बना है। रक्त और मस्तिष्क के बीच आयनों, रसायनों और कोशिकाओं के प्रवाह को इस बाधा द्वारा सख्ती से नियंत्रित किया जाता है। यह होमियोस्टेसिस विषाक्त पदार्थों और रोगजनकों के खिलाफ तंत्रिका ऊतकों की रक्षा करता है जबकि मस्तिष्क की नसों के उचित संचालन को भी सक्षम करता है 2,3. बीबीबी की अखंडता को बनाए रखने से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को प्रभावित करने वाले विकारों के विकास और प्रगति को प्रभावी ढंग से रोका जा सकता है, जैसे कि न्यूरोनल डिसफंक्शन, एडिमा और न्यूरोइन्फ्लेमेशन4. हालांकि, बीबीबी के अद्वितीय शारीरिक गुण 98% से अधिक छोटे अणु दवाओं और 100% मैक्रोमोलेक्यूलर फार्मास्यूटिकल्स को केंद्रीय तंत्रिका तंत्रमें प्रवेश करने से रोकते हैं। इसलिए, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए दवाओं के विकास के दौरान बीबीबी के माध्यम से दवाओं के प्रवेश में वृद्धि चिकित्सीय प्रभावकारिता 6,7 को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. भले ही सब्सट्रेट की कंप्यूटर सिमुलेशन स्क्रीनिंग ने बीबीबी को पार करने वाले दवा उम्मीदवारों की संभावना को काफी बढ़ा दिया है, वैज्ञानिक अनुसंधान8 की जरूरतों को पूरा करने के लिए इन विट्रो / इन विवो बीबीबी मॉडल में विश्वसनीय और सस्ती अभी भी आवश्यक हैं।
उच्च-थ्रूपुट ड्रग स्क्रीनिंग के लिए एक त्वरित और सस्ती तकनीक इन विट्रो मॉडल9 है। बीबीबी फ़ंक्शन पर दवाओं के प्रभाव की मूलभूत प्रक्रियाओं और बीमारी के विकास और प्रगति में उनके हिस्से पर प्रकाश डालने के लिए, इन विट्रो बीबीबी मॉडल में सरलीकृत की एक श्रृंखला बनाई गई है। वर्तमान में, इन विट्रो बीबीबी मॉडल में आम मोनोलेयर, सह-संस्कृति, गतिशील, और माइक्रोफ्लुइडिक मॉडल10,11,12 हैं, जो संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं और एस्ट्रोसाइट्स, पेरिसाइट्स या माइक्रोग्लिया13,14द्वारा निर्मित हैं। हालांकि 3 डी सेल संस्कृतियों बीबीबी15 की शारीरिक संरचना के अनुरूप हैं, बीबीबी के लिए दवा स्क्रीनिंग के साधन के रूप में उनका आवेदन अभी भी उनके जटिल डिजाइन और सबपर प्रजनन क्षमता से विवश है। इसके विपरीत, मोनोलेयर इन विट्रो मॉडल बीबीबी पर शोध करने के लिए सबसे अधिक बार उपयोग किया जाता है और विशेष कोशिकाओं में झिल्ली ट्रांसपोर्टरों और तंग जंक्शन प्रोटीन की अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए लागू होता है।
ट्रांसमेम्ब्रेन विद्युत प्रतिरोध (टीईईआर) माप प्रतिरोध में कोशिकाओं की परत का मूल्यांकन और निगरानी करने और सेल अखंडता और बाधा की पारगम्यता का मूल्यांकन करने की एक तकनीक है। मोनोलेयर के दोनों ओर विकास माध्यम या बफर समाधान में एक साथ दो इलेक्ट्रोड डालने से, सेल की कॉम्पैक्ट परत16,17 के माध्यम से प्रत्यावर्ती वर्तमान या विद्युत प्रतिबाधा को मापना संभव है। यह निर्धारित करने के लिए कि इन विट्रो बीबीबी मॉडल ठीक से बनाया गया है या नहीं, टीईईआर का माप आमतौर पर सोने के मानक18 के रूप में नियोजित किया जाएगा। दूसरी ओर, बीबीबी पारगम्यता पर दवा कार्रवाई की प्रवृत्ति सही दवा की भागीदारी19 के बाद सेल परत के विद्युत प्रतिरोध में परिवर्तन को मापने के द्वारा भविष्यवाणी की जा सकती है. उदाहरण के लिए, फेंग एट अल ने पाया कि कैटलपोल (रहमानिया का प्राथमिक सक्रिय मोनोमर) बीबीबी में तंग जंक्शन प्रोटीन के लिपोपॉलेसेकेराइड-प्रेरित डाउन-विनियमन को प्रभावी ढंग से उलट सकता है और माउस मस्तिष्क एंडोथेलियल सेल परत20 के टीईईआर मूल्य को बढ़ा सकता है।
न्यूरोइन्फ्लेमेटरी प्रतिक्रिया आमतौर पर बीबीबी होमियोस्टेसिस असंतुलन21 का मुख्य कारण है। न्यूरोइन्फ्लेमेटरी चोट को प्रेरित करने के लिए हाइपोक्सिक उपचार रक्त-मस्तिष्क बाधा को नष्ट करने का मुख्य तरीका है, जिसमें मुख्य रूप से भौतिक तरीकों और रासायनिक अभिकर्मक विधियों शामिल हैं। पूर्व मुख्य रूप से हाइपोक्सिक स्थितियों22 अनुकरण करने के लिए सेल विकास पर्यावरण में ऑक्सीजन सामग्री को बदलने के लिए एक तीन-गैस इनक्यूबेटर का उपयोग करता है, जबकि उत्तरार्द्ध कृत्रिम रूप से सेल संस्कृति माध्यम23 के लिए CoCl2 जैसे डीऑक्सी अभिकर्मकों को पेश करके प्राप्त किया जाता है। कोशिकाओं को एक ऑक्सीजन रहित स्थिति में रहना होगा यदि Fe2+ को हेम में Co2+ के लिए प्रतिस्थापित किया जाता है। यदि उत्प्रेरक समूह में Fe2+ को Co2+ के लिए प्रतिस्थापित किया जाता है, तो प्रोलाइन हाइड्रॉक्सिलेज़ और एस्पार्टेट हाइड्रॉक्सिलस गतिविधि बाधित हो जाएगी, जिसके परिणामस्वरूप हाइपोक्सिया-इंड्यूसिबल फैक्टर-1α (HIF-1α)24का संचय होगा। लगातार हाइपोक्सिया के तहत, साइटोप्लाज्म में HIF-1α का डीफॉस्फोराइलेशन कोशिका मृत्यु को ट्रिगर करता है और संवहनी एंडोथेलियल विकास कारक को सक्रिय करता है, जो अंततः संवहनी पारगम्यता को बढ़ाता है। पिछले अध्ययनों25,26 में, यह अच्छी तरह से प्रदर्शित किया गया है कि हाइपोक्सिया बीबीबी की पारगम्यता बढ़ाने के लिए एंडोथेलियल तंग जंक्शन प्रोटीन की अभिव्यक्ति को काफी कम कर सकता है। इस अध्ययन में, 24-अच्छी प्लेटों में वरीयता प्राप्त bEnd.3 कोशिकाओं के समय-प्रतिरोध वक्र को एक सीधा BBB मॉडल बनाने के लिए मापा गया था। इस मॉडल का उपयोग करते हुए, हमने सेल मॉडल का निर्माण करने के लिए CoCl2 हस्तक्षेप के बाद सेल TEER में परिवर्तनों की विशेषता बताई जिसका उपयोग BBB सुरक्षा के लिए दवाओं को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well transwell plate</td>
			<td>Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 &#181;m)</td>
			<td>10522023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 % ethanol</td>
			<td>ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd</td>
			<td>2023052901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd</td>
			<td>220412-078-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bEnd.3 cells</td>
			<td>Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>CL0049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting kit-8 (CCK-8)</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>BG0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (100mm)</td>
			<td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td>
			<td>1192022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobalt Chloride (CoCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>15862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>PYG0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified eagle medium (1x)</td>
			<td>Gibco ThermoFisher Scientific</td>
			<td>8121587</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2166090RP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>9.0.0(121)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (Contains collagen IV)</td>
			<td>MedChemexpress</td>
			<td>HY-K6002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax iD5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro 8 software</td>
			<td>OriginLab Corporation</td>
			<td>v8.0724(B724)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td>
			<td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>17C18B16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS, 1x)</td>
			<td>Gibco ThermoFisher Scientific</td>
			<td>8120485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd</td>
			<td>2022091501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmembrane resistance meter</td>
			<td>World Precision Instruments LLC</td>
			<td>VOM3 (verison 1.6)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25% (1x)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>J210045</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

barrier functional integrity recording on bend.3 vascular endothelial cells via transendothelial electrical resistance detection

रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) एक गतिशील शारीरिक संरचना है जो माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं, एस्ट्रोसाइट्स और पेरिसाइट्स से बना है। मस्तिष्क में हानिकारक पदार्थों के प्रतिबंधित पारगमन, पोषक तत्वों के अवशोषण और मेटाबोलाइट निकासी के बीच बातचीत का समन्वय करके, बीबीबी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र होमियोस्टेसिस के संरक्षण में आवश्यक है। बीबीबी के इन विट्रो मॉडल में बिल्डिंग न्यूरोलॉजिकल विकारों के पैथोफिज़ियोलॉजी की खोज और औषधीय उपचार बनाने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है। यह अध्ययन 24-वेल प्लेट के ऊपरी कक्ष में bEnd.3 कोशिकाओं को बोकर इन विट्रो मोनोलेयर BBB सेल मॉडल बनाने की प्रक्रिया का वर्णन करता है। सेल बाधा समारोह की अखंडता का आकलन करने के लिए, पारंपरिक उपकला सेल वाल्टमीटर का उपयोग वास्तविक समय में सामान्य कोशिकाओं और सीओसीएल2-प्रेरित हाइपोक्सिक कोशिकाओं के ट्रांसमेम्ब्रेन विद्युत प्रतिरोध को रिकॉर्ड करने के लिए किया गया था। हम आशा करते हैं कि उपरोक्त प्रयोग केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोगों के विकारों के इलाज के लिए बीबीबी और दवाओं के इन विट्रो मॉडल के निर्माण के लिए प्रभावी विचार प्रदान करेंगे।

BBB is a unique biological interface between blood circulation and nerve tissue, which is composed of vascular endothelial cells, pericytes, astrocytes, neurons, and other cellular structures1. The flow of ions, chemicals, and cells between the blood and the brain is strictly regulated by this barrier. This homeostasis safeguards the nervous tissues against toxins and pathogens while also enabling the appropriate operation of the brain&#39;s nerves2,3. Maintaining the integrity of the BBB can effectively prevent the development and progression of disorders affecting the central nervous system, such as neuronal dysfunction, edema, and neuroinflammation4. However, the unique physiological properties of the BBB prevent more than 98% of small molecule medications and 100% of macromolecular pharmaceuticals from entering the central nervous system5. Therefore, increasing the penetration of medications through the BBB during the development of drugs for the central nervous system is essential for achieving therapeutic efficacy6,7. Even though computer simulation screening of substrates has significantly raised the probability of drug candidates crossing the BBB, reliable and affordable in vitro/in vivo BBB models are still needed to meet the needs of scientific research8.
A quick and affordable technique for high-throughput drug screening is the in vitro model9. To shed light on the fundamental processes of medicines&#39; effects on BBB function and their part in the development and progression of disease, a series of simplified in vitro BBB models has been created. At present, the common in vitro BBB models are the monolayer, co-culture, dynamic, and microfluidic models10,11,12, constructed by vascular endothelial cells and astrocytes, pericytes, or microglia13,14. Although 3D cell cultures are morein line with the physiological structure of BBB15, their application as a means of drug screening for BBB is still constrained by their intricate design and subpar reproducibility. In contrast, the monolayer in vitro model is the one most frequently used to research the BBB and is applicable for determining the expression of membrane transporters and tight junction proteins in particular cells.
Transmembrane electrical resistance (TEER) measurement is a technique to evaluate and monitor the layer of cells across the resistance and evaluate the cell integrity and permeability of the barrier. By simultaneously inserting two electrodes into the growth medium or buffer solution on either side of the monolayer, it is possible to measure the alternating current or electrical impedance through the cell&#39;s compact layer16,17. In order to determine whether the in vitro BBB model has been properly created, the measurement of TEER will usually be employed as the gold standard18. On the other hand, the trend of medication action on BBB permeability can be accurately predicted by measuring the change in electrical resistance of the cell layer after drug involvement19. For example, Feng et al. discovered that catalpol (the primary active monomer of rehmanniae) could effectively reverse the lipopolysaccharide-induced down-regulation of tight junction proteins in the BBB and raise the TEER value of the mouse brain endothelial cell layer20.
The neuroinflammatory response is usually the main cause of BBB homeostasis imbalance21. Hypoxic treatment to induce neuroinflammatory injury is the main method to destroy the blood-brain barrier, mainly including physical methods and chemical reagent methods. The former primarily utilizes a three-gas incubator to vary the oxygen content in the cell growth environment to simulate hypoxic conditions22,while the latter is achieved by artificially introducing deoxy reagents such as CoCl2 to the cell culture medium23. The cells will remain in a deoxygenated condition if Fe2+ is substituted for Co2+ in the heme. If Fe2+ is substituted for Co2+ in the catalytic group, proline hydroxylase and aspartate hydroxylase activity will be inhibited, resulting in an accumulation of hypoxia-inducible factor-1&#945; (HIF-1&#945;)24. Under persistent hypoxia, the dephosphorylation of HIF-1&#945; in the cytoplasm triggers cell death and activates vascular endothelial growth factor, which ultimately raises vascular permeability. In previous studies25,26, it has been well demonstrated that hypoxia can significantly reduce the expression of endothelial tight junction proteins to increase the permeability of BBB. In this study, the time-resistance curve of bEnd.3 cells seeded in 24-well plates were measured in order to create a straightforward BBB model. Using this model, we characterized the changes in cell TEER after CoCl2 intervention in order to construct a cell model that can be used to screen drugs for BBB protection.

लेखक स्पॉटलाइट: सेल बैरियर अखंडता का आकलन करने के लिए टीईईआर डिटेक्शन के अनुप्रयोग 

बैरियर फंक्शनल इंटीग्रिटी रिकॉर्डिंग bEnd.3 पर ट्रांसेंडोथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस डिटेक्शन के माध्यम से वैस्कुलर एंडोथेलियल सेल

Current studies typically use permeability tests and associated protein expression to verify the accuracy of TEER detection. The BBB model of monolayer cells in virtue is less effective for drug screening, and the use of more cells makes it more difficult to construct the model. The protocol of this study is relatively simple, as the non-invasive procedure allows the cell samples to be used in other experiments after TEER detection.The detection of TEER to assess the permeability of cell models can accelerate the screening of drugs for treatment and prevention of the central nervous system to increase the success rate of new drug development. In the future, we will detect the expression of tight junction protein in upper compartment cells of chest wall to verify that TEER test results can effectively represent the integrity of BBB barrier function.

इस प्रोटोकॉल ने ट्रांसेंडोथेलियल रोकनेवाला मीटर में निर्धारित मापदंडों के अनुसार कोशिकाओं के प्रतिरोध मूल्यों में परिवर्तन की रिकॉर्डिंग की अनुमति दी। CoCl2 की विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किए गए...

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यह प्रोटोकॉल मस्तिष्क रक्त बाधा के इन विट्रो मॉडल में एक भरोसेमंद और कुशल का वर्णन करता है। विधि माउस सेरेब्रल संवहनी endothelial कोशिकाओं bEnd.3 का उपयोग करता है और transmembrane विद्युत प्रतिरोध उपायों.

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

वर्तमान अध्ययन आमतौर पर टीईईआर का पता लगाने की सटीकता को सत्यापित करने के लिए पारगम्यता परीक्षण और संबंधित प्रोटीन अभिव्यक्ति का उपयोग करते हैं। पुण्य में मोनोलेयर कोशिकाओं का बीबीबी मॉडल दवा स्क्रीनिंग के लिए कम प्रभावी है, और अधिक कोशिकाओं के उपयोग से मॉडल का निर्माण करना अधिक कठिन हो जाता है। इस अध्ययन का प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सरल है, क्योंकि गैर-इनवेसिव प्रक्रिया सेल नमूनों को टीईईआर का पता लगाने के बाद अन्य प्रयोगों में उपयोग करने की अनुमति देती है।सेल मॉडल की पारगम्यता का आकलन करने के लिए टीईईआर का पता लगाने से नई दवा के विकास की सफलता दर बढ़ाने के लिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के उपचार और रोकथाम के लिए दवाओं की स्क्रीनिंग में तेजी आ सकती है। भविष्य में, हम छाती की दीवार के ऊपरी डिब्बे कोशिकाओं में तंग जंक्शन प्रोटीन की अभिव्यक्ति का पता लगाएंगे ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि टीईईआर परीक्षण के परिणाम प्रभावी रूप से बीबीबी बाधा समारोह की अखंडता का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं।

barrier-functional-integrity-recording-on-bend3-vascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating the interaction between restricted transit of harmful substances, nutrient absorption, and metabolite clearance in the brain, the BBB is essential in preserving central nervous system homeostasis. Building in vitro models of the BBB is a valuable tool for exploring the pathophysiology of neurological disorders and creating pharmacological treatments. This study describes a procedure for creating an in vitro monolayer BBB cell model by seeding bEnd.3 cells into the upper chamber of a 24-well plate. To assess the integrity of cell barrier function, the conventional epithelial cell voltmeter was used to record the transmembrane electrical resistance of normal cells and CoCl2-induced hypoxic cells in real-time. We anticipate that the above experiments will provide effective ideas for the creation of in vitro models of BBB and drugs to treat disorders of central nervous system diseases.

This protocol describes a dependable and efficient in vitro model of the brain blood barrier. The method uses mouse cerebral vascular endothelial cells bEnd.3 and measures transmembrane electrical resistance.

Culture of bEnd.3 Cells and Cell Viability After CoCl2 Treatment

Culture of bEnd.3 Cells and Cell Viability After CoCl2 Treatment  

To begin, prepare DMEM cell culture medium containing FBS, penicillin, and streptomycin. Also, prepare a 100 millimolar cobalt chloride stock solution by adding 1.30 milligrams of cobalt chloride to 100 microliters of DMSO. Next, seed one milliliter of BEND3 cells in a 100-milliliter culture dish containing DMEM medium and culture at 37 degrees Celsius in a humidified atmosphere of 5%carbon dioxide.Change the medium every two to three days and subculture the cells two times a week. After BEND3 cells grow to 80%confluence, digest the cells with 0.25%trypsin for 30 seconds. Count the cells using a cell counter and make a suspension of density seven times 10 to the fourth cells per milliliter.Then, seed 100 microliters of this cell suspension in a 96-well plate for cell adhesion. Then wash the cells with PBS and add 100 microliters of culture medium containing cobalt chloride. Culture the cells for 24 hours.After incubation, remove the medium and wash with PBS. Next, add 100 microliters of CCK-8 solution. Incubate the plates at 37 degrees Celsius for one hour, then measure the absorbance at 450 nanometers using a microplate reader.Calculate the cell viability induced by cobalt chloride according to this formula. Select the concentration with a significant difference in cell viability reduction compared with the control group. The viability of BEND3 cells treated with different concentrations of cobalt chloride was analyzed by CoCl2.The results indicated that 300 micromolar of cobalt chloride showed significant in vitro cytotoxicity.

CoCl2 उपचार के बाद bEnd.3 कोशिकाओं और सेल व्यवहार्यता की संस्कृति

In Vitro Blood-Brain Barrier Model Assembly for Measurement of TEER

To begin, rinse the upper chamber of 24 well plates with PBS. Mix the BEND3 cells with DMEM medium using a vortex mixer to make a suspension. Then, seed 200 microliters of BEND3 cell suspension on the PET membrane in the upper chamber of a 24 well plate.Add 1, 200 microliters of complete medium to the lower chamber of the plate to stabilize the osmotic pressure of the upper and lower chambers. Change the medium by slowly removing the old medium from one side with a negative-pressure pipette and adding a new medium along the wall during fluid exchange. Before measuring TEER, place the resistor, 5%sodium hypochlorite solution, 75%ethanol, and double distilled water on an ultra clean table.Turn on the UV irradiation for 30 minutes to eliminate residual bacteria and pathogens. Place the electrodes in 5%sodium hypochlorite solution with slow shaking for three to five seconds. Then immerse in 75%ethanol for 15 minutes.Finally, transfer to PBS or double distilled water until use. Next, turn on the switch at the back of the cell resistor meter. Click Select Plate and Select 24 well plate.According to the operation, select the appropriate detection sequence. Insert a kilo ohm resistor into the right plug to calibrate the instrument. If the calibration result is 1000 plus minus 5 ohms, consider the instrument accurate.If not, click on Mode Units on the main interface to select Ohms and then click Calibrate. Then, remove the kilo ohm resistor and replace it with the measuring electrode using a connecting wire. Place the electrode vertically into the 24 well plate containing only medium and click Blank Handling on the instrument.The background value of the plate resistance without seated cells should be about 134.4 ohm. Next, insert the two electrodes into the upper and lower chambers of the seated plate, such that the cell layer is between them. Record the resistance value by gently stepping on the pedal.Make sure that the electrode does not touch the cells in the upper chamber and the bottom of the lower chamber. Obtain TEER values by multiplying electrical resistance values with the bottom area of the upper chamber, as shown in the equation. Draw a line plot of TEER versus time in days.When the resistance value does not increase with time, the cells have formed a barrier. The resistance values plotted versus time for BEND3 cells showed that the cell TEER values began to stabilize on the fifth day.

TEER के मापन के लिए इन विट्रो ब्लड-ब्रेन बैरियर मॉडल असेंबली में

Barrier Destruction and Statistical Analysis After TEER Measurement in an In Vitro Blood-Brain Barrier Model

Begin by culturing the BEND3 cells, then divide the wells into the control group and cobalt chloride group. Add 200 microliters of culture medium into the upper chamber of the control group and culture medium containing 300 micromolar cobalt chloride into the cobalt chloride group. Incubate the plates at 37 degrees Celsius and detect the resistance values at 12 and 24 hours of incubation using TEER method.Use commercial software to map the trend of TEER values of the cell barrier. Use statistical analysis software to analyze the difference in resistance values between cobalt chloride treated cells and control cells. Addition of 300 micromolar cobalt chloride resulted in a significant decrease in TEER values compared to the control at both the 12-hour and 24-hour time points.After 24 hours, the TEER value of 300 micromolar cobalt chloride group reduced compared to the control group, indicating breakdown of the cell barrier that was induced by hypoxic conditions due to cobalt chloride.