Name: Microglia Research on Spinal Cord Heterogeneity and Purification (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-09-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microglia Research on Spinal Cord Heterogeneity and Purification at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами стипендии, предоставленной Национальным советом по науке и технологиям (CONACYT) (702361). Авторы отмечают докторантуру по биологическим химическим наукам Национальной школы биологических наук Национального политехнического института.

Исследование проводилось в соответствии с официальным мексиканским стандартом NOM-062-ZOO-1999 и руководством по уходу и использованию лабораторных животных. Одобрение на проведение исследования было получено от комитетов по исследованиям, этике и биобезопасности Детской больницы Мексики...

Extraction and Enzymatic Purification of Microglia from the Mouse Spinal Cord

<ol>
	<li>Schr&#246;der, H., Schr&#246;der, , Moser, , Huggenberger, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroanatomy of the Mouse. , 59-78 (2020).</li><li>Sengul, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoarchitecture+of+the+spinal+cord+of+the+postnatal+(P4)+mouse.">Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse.</a> Anat Rec. 295, 837-845 (2012).</li><li>Bab, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, 205 (2007).</li><li>Nayak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+development+and+function.">Microglia development and function.</a> Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).</li><li>Martinez, F. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, 453-461 (2008).</li><li>Masuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era.">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li><li>Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+biology:+one+century+of+evolving+concepts.">Microglia biology: one century of evolving concepts.</a> Cell. 179 (2), 292-311 (2019).</li><li>de Haas, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+expression+of+immunoregulatory+proteins+on+microglia+in+the+healthy+CNS.">Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS.</a> Glia. 56 (8), 888-894 (2008).</li><li>Xuan, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+of+microglia+in+the+brain+and+the+spinal+cord.">Differences of microglia in the brain and the spinal cord.</a> Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).</li><li>Paolicelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+states+and+nomenclature:+A+field+at+its+crossroads.">Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+IL-36&#947;/IL-36R+participates+in+the+maintenance+of+chronic+inflammatory+pain+through+astroglial+JNK+pathway.">Spinal IL-36&#947;/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway.</a> Glia. 67 (3), 438-451 (2019).</li><li>Prinz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+central+nervous+system-associated+macrophages-from+origin+to+disease+modulation.">Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation.</a> Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).</li><li>Yip, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+and+culture+of+primary+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord.">Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).</li><li>Akhmetzyanova, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity-+and+time-dependent+activation+of+microglia+in+spinal+cord+injury.">Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury.</a> Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).</li><li>Mahadevan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+vertebral+column.">Anatomy of the vertebral column.</a> Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).</li><li>Krukowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+microglia-depletion+after+cosmic+radiation+modifies+phagocytic+activity+and+prevents+cognitive+deficits.">Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits.</a> Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry.">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li><li>Schmidt, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+enzymatic+efficiency+of+Liberase+TM+and+tumor+dissociation+enzyme:+effect+on+the+viability+of+cells+digested+from+fresh+and+cryopreserved+human+ovarian+cortex.">Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex.</a> Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).</li><li>Kusminski, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoNEET-parkin+effects+in+pancreatic+&#945;-+and+&#946;-cells,+cellular+survival,+and+intrainsular+cross+talk.">MitoNEET-parkin effects in pancreatic &#945;- and &#946;-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk.</a> Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).</li></ol>

Было разработано множество протоколов для изучения микроглии из-за ее значимости в гомеостазе мозга. В этих методах микроглия обычно поступает из полушарий головного мозга эмбриональных или неонатальных крыс и мышей17. Ограниченное число исследований было посвящено очис?...

Определяющей характеристикой позвоночных является позвоночный столб или позвоночник, в котором хорда заменена последовательностью сегментированных костей, называемых позвонками, разделенных межпозвоночными дисками. Эта последовательность костного материала формирует спинномозговой канал, полость, которая окружает и защищает спинной мозг1. У рода Rodentia позвоночник обычно образован семью шейными позвонками, тринадцатью грудными позвонками, шестью поясничными позвонками и переменным числом хвостовых позвонков 2,3. Длина спинного мозга аналогична длине позвоночника, а концевая нить является ненервной структурой, которая прикрепляет спинной мозг к крестцу. Кроме того, нервные волокна выходят через межпозвонковое отверстие1.
Развитие и правильное функционирование центральной нервной системы у млекопитающих в решающей степени зависит от активности резидентных макрофагов нервной системы, называемых микроглией4. Хотя микроглия первоначально описывалась как резидентные фагоциты мозга, недавние исследования приписывают этим клеткам множество динамических функций 5,6. Размер микроглии колеблется от 7 до 10 мкм в гомеостазе; Они считаются одними из самых универсальных клеток в организме и могут морфологически и функционально адаптироваться к постоянно меняющейся окружающей среде7. Эти клетки демонстрируют высокую гетерогенность как на эмбриональной, так и на взрослой стадиях8,9, в то время как на взрослой стадии они также демонстрируют сложную функциональную гетерогенность, основанную на их пространственно-временном контексте10. Гетерогенность и множественность функций микроглии обеспечивают дифференцированную экспрессию и поведение генов в спинном и головном мозге. Показано, что экспрессия CD11b, CD45, CD86 и CCR9 выше в спинном мозгепо сравнению с головным мозгом 8,9.
Существует несколько протоколов для выделения церебральной микроглии11,12; Однако для микроглии спинного мозга13,14 существует лишь несколько. Оптимизация метода очистки микроглии от спинного мозга способствует развитию многочисленных исследований, направленных на изучение физиологии микроглии. Этот протокол направлен на описание простого и высоковоспроизводимого извлечения спинного мозга мыши и очистки микроглии (рис. 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL collection tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microtubes</td>
			<td>Axygen, USA</td>
			<td>MCT-200-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4G2 anti-FcR</td>
			<td>BioLegend, USA</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL collection tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse</td>
			<td>eBioscience, USA</td>
			<td>48-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45 PerCP anti-mouse&#160;&#160;</td>
			<td>BioLegend, USA</td>
			<td>103130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Cell Strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear Not Treated&#160;</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>CLS3736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Heating Shaking Drybath&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps for microsurgery</td>
			<td>FT by DUMONT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>4536282001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Modified Eagle&#180;s Medium-high glucose (DMEM)&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>Thermo, USA</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAN Biotech, Alemania</td>
			<td>P30-3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer Cytoflex&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>H2387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning, USA&#160;</td>
			<td>15393631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM&#160;</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>5401119001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber Counting Chambers</td>
			<td>China</td>
			<td>1103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>17089101</td>
			<td>density gradient centrifugation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel No. 25&#160;</td>
			<td>HERGOM, Mexico</td>
			<td>H23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL</td>
			<td>Axygen, USA</td>
			<td>10011-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Velab, Mexico</td>
			<td>HG927831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight surgical scissors (10 cm)</td>
			<td>HERGOM, Mexico</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Vannas scissors</td>
			<td>HERGOM, Mexico</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue Stain 0.4%&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>DLAB, China</td>
			<td>8031102000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend, USA</td>
			<td>423102</td>
			<td>amine-reactive fluorescent dye staining&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and efficient enrichment of mouse spinal cord microglia

Позвоночный столб определяет позвоночное животное и формирует спинномозговой канал, полость, которая окружает и защищает спинной мозг. Правильное развитие и функционирование центральной нервной системы млекопитающих в значительной степени зависят от активности резидентных макрофагов, известных как микроглия. Микроглия проявляет гетерогенность и многофункциональность, обеспечивая различную экспрессию и поведение генов в спинном и головном мозге. В многочисленных исследованиях изучалась функция церебральной микроглии, подробно описывались методы очистки. Однако очищение микроглии от спинного мозга у мышей не имеет исчерпывающего описания. В отличие от этого, использование высокоочищенной коллагеназы, в отличие от нерафинированного экстракта, не находит отклика в тканях центральной нервной системы. В этом исследовании позвоночный столб и спинной мозг были вырезаны у 8-10-недельных мышей C57BL/6. В последующем расщеплении использовалась высокоочищенная коллагеназа, а в очистке микроглии использовался градиент плотности. Клетки подвергались окрашиванию для проточной цитометрии, оценивая жизнеспособность и чистоту с помощью окрашивания CD11b и CD45. Результаты показали среднюю жизнеспособность 80% и среднюю чистоту 95%. В заключение, манипуляции с микроглией мыши включали в себя пищеварение высокоочищенной коллагеназой с последующим градиентом плотности. Этот подход эффективно привел к созданию значительных популяций микроглии спинного мозга.

Rapid and Efficient Enrichment of Mouse Spinal Cord Microglia

С использованием тканей спинного мозга мышей ферментативное пищеварение проводили с использованием смеси, сильно обогащенной коллагеназой и термолизином. Полученная переваренная ткань проходила через фильтр 40 мкм для удаления непереваренного материала. Собранные клетки обогащали ?...

Watch this Scientific Journal Video about Microglia Research on Spinal Cord Heterogeneity and Purification at JoVE.com

Microglia Research on Spinal Cord Heterogeneity and Purification (Video) | JoVE

Микроглия считается одной из самых универсальных клеток в организме, способных к морфологической и функциональной адаптации. Их гетерогенность и многофункциональность позволяют поддерживать гомеостаз мозга, а также связаны с различными неврологическими патологиями. Здесь описана методика очищения микроглии спинного мозга.

Быстрое и эффективное обогащение микроглии спинного мозга мышей

The vertebral column defines a vertebrate and shapes the spinal canal, a cavity that encloses and safeguards the spinal cord. Proper development and ...

Наше исследование сосредоточено на гетерогенности микроглии, которая может проявлять как провоспалительное, так и противовоспалительное поведение при различных патологиях и областях, таких как головной и спинной мозг. Мы стремимся обеспечить более глубокое понимание поведения микроглии спинного мозга в различных сценариях. Гетерогенность микроглии затрудняет их классификацию.В этом году была предложена новая и широкая классификация, которая выходит за рамки только провоспалительного или противовоспалительного статуса. В настоящее время достижение высокой чистоты и геля при выделении микроглии спинного мозга из животных моделей неврологических патологий является важным экспериментом и задачей. Мы идентифицировали новый цитокиновый сигнальный путь в микроглии спинного мозга во время хронической боли.Наш протокол обеспечивает более контролируемое и соматическое пищеварение с последующим градиентом плотности. Оба метода приводят к меньшему загрязнению астроцитами по сравнению с используемыми в настоящее время методами очистки микроглии из спинного мозга, головного мозга или эмбрионов.