Name: Understanding Dynamic Cellular Behaviors in Adult Mouse Dental Tissue Renewal and Repairment (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-10-27T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Understanding Dynamic Cellular Behaviors in Adult Mouse Dental Tissue Renewal and Repairment at JoVE.com

We erkennen het UCLA Advanced Light Microscopy/Spectroscopy Laboratory en Leica Microsystems Center of Excellence bij het California NanoSystems Institute (RRID: SCR_022789) voor het leveren van twee-fotonmicroscopie. AS werd ondersteund door ISF 604-21 van de Israel Science Foundation. JH werd ondersteund door R03DE030205 en R01DE030471 van de NIH/NIDCR. AS en JH werden ook ondersteund door subsidie 2021007 van de United States-Israel Binational Science Foundation (BSF).

Alle muizen werden gehouden in pathogeenvrije dierfaciliteiten aan de Universiteit van Californië Los Angeles (UCLA) of de Hebreeuwse Universiteit van Jeruzalem (HUJI). Alle experimenten met muizen werden uitgevoerd volgens voorschriften en protocollen die zijn goedgekeurd door de respectieve Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) of (MD-23-17184-3; HUJI). Een algemene workflow van de experimentele stappen is weergegeven in figuur 2A. Zie de Materia...

Live Tracking of Dental Cells via Two-Photon Microscopy

Beeldvorming van levend weefsel is een belangrijke techniek die ons in staat stelt de dynamische processen en gedragingen van cellen te bestuderen wanneer ze in hun niche-omgeving worden gehouden41. Idealiter wordt live beeldvorming in vivo uitgevoerd met een hoge spatiotemporele resolutie. In vivo beeldvorming voor zoogdierorganen kan echter een uitdaging zijn vanwege de ontoegankelijkheid van weefsel, optische ondoorzichtigheid en de moeilijkheid om het dier of het orgaan gedur...

In de afgelopen twee decennia is de snijtand van muizen naar voren gekomen als een platform van onschatbare waarde voor het onderzoeken van de principes van volwassen stamcelregulatie en tandregeneratie 1,2. De muizensnijtand groeit continu en vernieuwt zichzelf gedurende het hele leven van het dier. Het doet dit door zowel epitheliale als mesenchymale stamcellen in stand te houden, die zichzelf kunnen vernieuwen en differentiëren in verschillende celtypen van de tand 1,2. Terwijl tandepitheliale stamcellen aanleiding geven tot ameloblasten, die de glazuurmatrix afscheiden, geven tandheelkundige mesenchymale stamcellen aanleiding tot odontoblasten, cementoblasten en fibroblasten, die respectievelijk dentine, cement en parodontaal ligament vormen 3,4,5,6. Deze constante toevoer van nieuwe cellen handhaaft de weefselhomeostase en maakt de vervanging mogelijk van oude cellen die verloren zijn gegaan als gevolg van kauwslijtage of verwondingen 7,8. Het ophelderen van de cellulaire en moleculaire mechanismen die het onderhoud en de differentiatie van tandheelkundige stamcellen reguleren, staat daarom centraal in het begrijpen van tandheelkundige regeneratie, een gebied van groeiende belangstelling.
Anatomisch gezien is een groot deel van de snijtand van de volwassen muis ingekapseld in het kaakbot. Terwijl de incisale rand van de tand zichtbaar is, past het apicale uiteinde van de snijtand in een kom en is het stevig bevestigd aan het omringende bot via parodontale ligamenten en bindweefsel (Figuur 1A,B). Het apicale uiteinde van de snijtand is ook het groeigebied van de tand en onderhoudt tandstam- en voorlopercellen in zowel de epitheellaag als de mesenchymale pulpa 9,10,11,12,13. In het bijzonder worden tandepitheelstamcellen gehandhaafd aan het bolvormige uiteinde van het epitheel, bekend als de apicale knop, ook wel de labiale cervicale lus genoemd (Figuur 1C). Net als bij het darmepitheel en de epidermis, wordt de epitheelvernieuwing in de snijtand voornamelijk ondersteund door actief cyclende stamcellen en hun zeer proliferatieve intermediaire afstammelingen, transit-amplificerende cellen 14,15,16,17 genaamd, die zich beide in het binnenste deel van de cervicale lus bevinden. Of het snijtandepitheel tijdens de regeneratie slapende stamcellen bevat en gebruikt, moet echter nog worden bepaald. Daarentegen zijn zowel actieve als slapende dentale mesenchymale stamcellen geïdentificeerd in de apicale pulpa, en de slapende stamcellen functioneren als een reservepopulatie die wordt geactiveerd tijdens het herstel van letsel13,18.
Veel van de ontdekkingen over de biologie van de vernieuwing en regeneratie van de snijtanden van muizen zijn het resultaat van histologisch onderzoek, waarbij monsters op verschillende tijdstippen worden verkregen, gefixeerd, verwerkt en vervolgens in microndunne plakjes langs een bepaald vlak worden verdeeld. Door gedetailleerde analyse van histologische secties van verschillende muismodellen die het traceren van afstammingslijnen of genetische verstoringen mogelijk maken, hebben wetenschappers de cellijnen van verschillende voorloperpopulaties geïdentificeerd, evenals de genetische en signaalroutes die de homeostase van de snijtanden en het herstel van verwondingen regelen 19,20,21 . De statische tweedimensionale (2D) beelden van niet-vitale cellen in secties kunnen echter niet het volledige spectrum van cellulair gedrag en ruimtelijke organisaties in levend weefsel vastleggen, zoals veranderingen in celvorm, bewegingen en cellulaire kinetiek. Het detecteren en meten van deze snelle cellulaire veranderingen, die optreden op een tijdschaal die onoplosbaar is door weefselsectie, vereist een andere strategie. Bovendien is het verkrijgen van dergelijke informatie ook van cruciaal belang om te begrijpen hoe tandcellen met elkaar omgaan, reageren op verschillende signaalstimuli en zichzelf organiseren om weefselstructuren en -functies te behouden.
De komst van vierdimensionale (4D) diepe weefselbeeldvorming met behulp van twee-fotonmicroscopie22, een technologie die drie ruimtelijke dimensies integreert met temporele resolutie, overwint de inherente beperkingen van histologische analyse door spatiotemporeel onderzoek van gekweekte weefselexplantaten, organoïden of zelfs weefsels in situ mogelijk te maken 23,24,25,26 . 4D live beeldvorming van het zich ontwikkelende tandepitheel heeft bijvoorbeeld de spatiotemporele patronen van celdelingen en migraties onthuld die weefselgroei, signaalcentrumvorming en tandepitheliale morfogenese coördineren 27,28,29,30,31,32. In de snijtand van volwassen muizen is onlangs 4D-beeldvorming aangepast om cellulair gedrag te bestuderen tijdens herstel van tandepitheelletsel. Live beeldvorming onthulde dat stratum intermedium cellen in de suprabasale laag direct kunnen worden omgezet in ameloblasten in de basale laag om het beschadigde epitheel te regenereren, waardoor het traditionele paradigma van herstel van epitheelletsel wordt uitgedaagd15.
Hier beschrijven we de dissectie, kweek en beeldvorming van de snijtand van volwassen muizen, met de nadruk op epitheelcellen in de labiale cervicale lus (Figuur 1). Deze techniek behoudt de vitaliteit van de tandcellen gedurende meer dan 12 uur en maakt het mogelijk om fluorescerend gelabelde cellen live te volgen met een resolutie van één cel. Deze benadering maakt het mogelijk om celbeweging en -migratie te onderzoeken, evenals dynamische veranderingen in celvorm en delingsoriëntatie onder normale kweekomstandigheden, of in reacties op genetische, fysische en chemische verstoringen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 well, flat bottom tissue culture plate</td>
			<td>Olympus plastics</td>
			<td>25-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x HC IRAPO motCORR water dipping objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11507704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid (Vitamin C)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>352685000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose bioxtra&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delta T system&#160;</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td>0420-4</td>
			<td>Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope- LEICA S9E</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LED300 SLI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11039047</td>
			<td>Basal media without phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather surgical blade (#15)</td>
			<td>Feather</td>
			<td>72044-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-melting agarose</td>
			<td>NuSieve</td>
			<td>50080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-essential amino acids (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Gen Clone</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>90 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>AS3061SC</td>
			<td>Processed for live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade #9</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>37133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>serrated forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11000-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spring scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using ex vivo live imaging to investigate cell divisions and movements during mouse dental renewal

De continu groeiende muizensnijtand is in opkomst als een zeer handelbaar modelsysteem om de regulatie van volwassen epitheliale en mesenchymale stamcellen en tandregeneratie te onderzoeken. Deze voorloperpopulaties delen, verplaatsen en differentiëren actief om de weefselhomeostase te handhaven en verloren cellen op een responsieve manier te regenereren. Traditionele analyses met behulp van vaste weefselsecties konden de dynamische processen van cellulaire bewegingen en interacties echter niet vastleggen, waardoor ons vermogen om hun regulatie te bestuderen werd beperkt. Dit artikel beschrijft een protocol voor het onderhouden van hele muizensnijtanden in een explantatiekweeksysteem en live-track tandepitheelcellen met behulp van multifoton timelapse-microscopie. Deze techniek is een aanvulling op onze bestaande gereedschapskist voor tandheelkundig onderzoek en stelt onderzoekers in staat om spatiotemporele informatie te verkrijgen over celgedrag en organisaties in een levend weefsel. We verwachten dat deze methodologie onderzoekers zal helpen bij het verder onderzoeken van mechanismen die de dynamische cellulaire processen beheersen die plaatsvinden tijdens zowel tandheelkundige vernieuwing als regeneratie.

Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal

Het apicale gebied van de snijtand van de volwassen muis is ingekapseld in de onderkaak (figuur 1) en is daarom niet direct toegankelijk voor het visualiseren en live volgen van de voorlopercellen die zich in het groeigebied bevinden. Daarom hebben we een methode ontwikkeld om de hele snijtand uit het kaakbot te halen en te bewaren in een explantatiekweeksysteem voor timelapse-microscopie met twee fotonen (Figuur 2). Hier beschrijven we representatieve resultate...

Watch this Scientific Journal Video about Understanding Dynamic Cellular Behaviors in Adult Mouse Dental Tissue Renewal and Repairment at JoVE.com

Understanding Dynamic Cellular Behaviors in Adult Mouse Dental Tissue Renewal and Repairment (Video) | JoVE

Ex vivo live beeldvorming is een krachtige techniek voor het bestuderen van de dynamische processen van cellulaire bewegingen en interacties in levende weefsels. Hier presenteren we een protocol dat twee-fotonmicroscopie implementeert om tandepitheelcellen live te volgen in gekweekte snijtanden van hele volwassen muizen.

Ex vivo live beeldvorming gebruiken om celdelingen en bewegingen tijdens tandvernieuwing bij muizen te onderzoeken

The continuously growing mouse incisor is emerging as a highly tractable model system to investigate the regulation of adult epithelial and mesenchymal ...

Om de juiste cellulaire organisatie te behouden tijdens orgaanvernieuwing, beweegt weefsel dat de cellen nadert en deelt het specifieke oriëntaties en patronen. Het is daarom belangrijk om de regels en voorschriften van deze dynamische cellulaire gebeurtenissen te begrijpen. De muizensnijtand is een opkomend model voor onderzoek naar volwassen stamcellen en er zijn veel genetische hulpmiddelen beschikbaar in het systeem om genfuncties te bestuderen en cellen te labelen voor het traceren van afstamming.De meeste onderzoeken tot nu toe maken gebruik van gebitsmonsters voor volwassenen die zijn verzameld en de specifieke tijdstippen hebben vastgelegd, en dit verhindert ons om het gedrag van levenscellen te onderzoeken. In dit protocol beschrijven we een methode om de levensstijl van de snijtand van volwassen muizen te volgen, en deze techniek zal toekomstige studies mogelijk maken die tot doel hebben te begrijpen hoe dynamisch celgedrag bijdraagt aan de vernieuwing en het herstel van tandweefsels.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Isolation of Mouse Mandibular Incisors and Associated Periodontal Tissues to Expose the Incisor Epithelial Cervical Loop

Dissection and Isolation of Mouse Mandibular Incisors and Associated Periodontal Tissues to Expose the Incisor Epithelial Cervical Loop (Video) | JoVE 