Name: Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE
Uploaded: 2023-11-10T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids at JoVE.com

I campioni sono stati preparati e sottoposti a imaging presso la CryoEM Facility di MIT.nano su microscopi acquisiti grazie alla Arnold and Mabel Beckman Foundation. I dispositivi di imaging dell'angolo di contatto sono stati stampati presso il Metropolis Maker Space del MIT. Ringraziamo i laboratori di Nieng Yan e Yimo Han e il personale del MIT.nano per il loro supporto durante l'adozione di questo metodo. In particolare, estendiamo i nostri ringraziamenti alle dottoresse Guanhui Gao e Sarah Sterling per le loro approfondite discussioni e feedback. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH R01-GM144542, 5T32-GM007287 e NSF-CAREER grant 2046778. La ricerca nel laboratorio di Davis è sostenuta dalla Alfred P. Sloan Foundation, dal James H. Ferry Fund, dalla MIT J-Clinic e dalla Whitehead Family.

1. Preparazione del grafene CVD
<ol><li>Preparare la soluzione di incisione al grafene come descritto di seguito.<ol><li>Sciogliere 4,6 g di persolfato di ammonio (APS) in 20 mL di acqua di grado molecolare in un becher da 50 mL per una soluzione 1 M e coprire con un foglio di alluminio. Lasciare che l'APS si dissolva completamente mentre si procede al passaggio 1.2.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare una sezione di grafene CVD per il rivestimento in metacrilato di metile (MMA). Taglia con cura una sezion...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

<ol>
	<li>Chua, E. Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cheaper:+Recent+advances+in+cryo-electron+microscopy.">cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).</li><li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles.">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> Elife. 2, 00461 (2013).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Campbell, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+cryo-microscopy.">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li><li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leginon:+New+features+and+applications.">Leginon: New features and applications.</a> Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).</li><li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cryoSPARC:+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination.">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li><li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp.">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li><li>Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cisTEM,+user-friendly+software+for+single-particle+image+processing.">cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing.</a> Elife. 7, 35383 (2018).</li><li>Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+single+particle+refinement+in+EMAN2.1.">High resolution single particle refinement in EMAN2.1.</a> Methods. 100, 25-34 (2016).</li><li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+cryo-EM-How+did+it+get+here+and+where+will+it+go.">Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go.</a> Science. 361 (6405), 876-880 (2018).</li><li>Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+structural+ensembles+from+single+particle+cryo-EM+data+using+cryoDRGN.">Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN.</a> Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).</li><li>Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoDRGN:+reconstruction+of+heterogeneous+cryo-EM+structures+using+neural+networks.">CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks.</a> Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).</li><li>Chen, M., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+learning-based+mixed-dimensional+Gaussian+mixture+model+for+characterizing+variability+in+cryo-EM.">Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM.</a> Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).</li><li>Punjani, A., Fleet, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+variability+analysis:+Resolving+continuous+flexibility+and+discrete+heterogeneity+from+single+particle+cryo-EM.">3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM.</a> J Struct Biol. 213 (2), 107702 (2021).</li><li>Dashti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieving+functional+pathways+of+biomolecules+from+single-particle+snapshots.">Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots.</a> Nat Commun. 11 (1), 4734 (2020).</li><li>Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KsgA+facilitates+ribosomal+small+subunit+maturation+by+proofreading+a+key+structural+lesion.">KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion.</a> Nat Struct Mol Biol. , (2023).</li><li>Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+aqueous+suspensions.">Frozen aqueous suspensions.</a> Ultramicroscopy. 10 (1-2), 55-61 (1982).</li><li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM--the+first+thirty+years.">Cryo-EM--the first thirty years.</a> J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).</li><li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+that+influence+the+formation+and+stability+of+thin,+cryo-EM+specimens.">Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens.</a> Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).</li><li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins,+interfaces,+and+cryo-Em+grids.">Proteins, interfaces, and cryo-Em grids.</a> Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).</li><li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it.">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> Elife. 8, 42747 (2019).</li><li>Tan, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addressing+preferred+specimen+orientation+in+single-particle+cryo-EM+through+tilting.">Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting.</a> Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).</li><li>Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eliminating+effects+of+particle+adsorption+to+the+air/water+interface+in+single-particle+cryo-electron+microscopy:+Bacterial+RNA+polymerase+and+CHAPSO.">Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO.</a> J Struct Biol X. 1, 100005 (2019).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM.">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).</li><li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation.">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 560-571 (2018).</li><li>Neselu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+effects+of+ice+thickness+on+resolution+in+single+particle+cryo-EM.">Measuring the effects of ice thickness on resolution in single particle cryo-EM.</a> J Struct Biol X. 7, 100085 (2023).</li><li>Pantelic, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphene:+Substrate+preparation+and+introduction.">Graphene: Substrate preparation and introduction.</a> J Struct Biol. 174 (1), 234-238 (2011).</li><li>Geim, A. K., Novoselov, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+of+graphene.">The rise of graphene.</a> Nat Mater. 6 (3), 183-191 (2007).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+monolayer+graphene+grids+for+near-atomic+resolution+cryoelectron+microscopy.">High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (2), 1009-1014 (2020).</li><li>Fujita, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epoxidized+graphene+grid+for+highly+efficient+high-resolution+cryoEM+structural+analysis.">Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis.</a> Sci Rep. 13 (1), 2279 (2023).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalized+graphene+grids+with+various+charges+for+single-particle+cryo-EM.">Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM.</a> Nat Commun. 13 (1), 6718 (2022).</li><li>Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy.">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li><li>Liu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+functionalized+monolayer+graphene+for+high-resolution+cryo-electron+microscopy.">Bioactive functionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electron microscopy.</a> J Am Chem Soc. 141 (9), 4016-4025 (2019).</li><li>Benjamin, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+capture+of+histidine-tagged+proteins+from+cell+lysates+using+TEM+grids+modified+with+NTA-graphene+oxide.">Selective capture of histidine-tagged proteins from cell lysates using TEM grids modified with NTA-graphene oxide.</a> Sci Rep. 6, 32500 (2016).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+and+robust+covalently+linked+graphene+oxide+affinity+grids+for+high-resolution+cryo-EM.">General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24269-24273 (2020).</li><li>Koh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+Collection+of+High-Resolution+cryo-EM+Datasets+Using+200+KV+Transmission+Electron+Microscope.">Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope.</a> J Vis Exp. (181), (2022).</li><li>Schweizer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+cleaning+of+graphene+using+in+situ+electron+microscopy.">Mechanical cleaning of graphene using in situ electron microscopy.</a> Nat Commun. 11 (1), 1743 (2020).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+airborne+contaminants+on+the+wettability+of+supported+graphene+and+graphite.">Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite.</a> Nat Mater. 12 (10), 925-931 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structures+reveal+coordinated+domain+motions+that+govern+DNA+cleavage+by+Cas9.">Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9.</a> Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 679-685 (2019).</li><li>Croll, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISOLDE:+a+physically+realistic+environment+for+model+building+into+low-resolution+electron-density+maps.">ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps.</a> Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 519-530 (2018).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Prydatko, A. V., Belyaeva, L. A., Jiang, L., Lima, L. M. C., Schneider, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+angle+measurement+of+free-standing+square-millimeter+single-layer+graphene.">Contact angle measurement of free-standing square-millimeter single-layer graphene.</a> Nat Commun. 9 (1), 4185 (2018).</li></ol>

La preparazione dei campioni CryoEM comporta una serie di sfide tecniche, con la maggior parte dei flussi di lavoro che richiedono ai ricercatori di manipolare manualmente le griglie fragili con estrema cura per evitare di danneggiarle. Inoltre, l'idoneità di qualsiasi campione alla vetrificazione è imprevedibile; Le particelle spesso interagiscono con l'interfaccia aria-acqua o con la lamina di supporto solida che si sovrappone alle griglie, il che può portare le particelle ad adottare gli orientamenti preferiti o a ...

La microscopia elettronica criogenica a singola particella (cryoEM) si è evoluta in un metodo ampiamente utilizzato per la visualizzazione di macromolecole biologiche1. Alimentata dai progressi nel rilevamento diretto degli elettroni 2,3,4, nell'acquisizione dati5 e negli algoritmi di elaborazione delle immagini 6,7,8,9,10, la crioEM è ora in grado di produrre strutture 3D a risoluzione quasi atomica di un numero in rapida crescita di macromolecole11. Inoltre, sfruttando la natura a singola molecola dell'approccio, gli utenti possono determinare strutture multiple da un singolo campione 12,13,14,15, evidenziando la promessa di utilizzare i dati generati per comprendere insiemi strutturali eterogenei 16,17. Nonostante questi progressi, persistono colli di bottiglia nella preparazione della griglia dei campioni criogenici.

Per la caratterizzazione strutturale mediante crioEM, i campioni biologici devono essere ben dispersi in soluzione acquosa e quindi devono essere congelati attraverso un processo chiamato vetrificazione18,19. L'obiettivo è quello di catturare le particelle in uno strato uniformemente sottile di ghiaccio vetrificato sospeso attraverso fori regolarmente distanziati che sono tipicamente tagliati in uno strato di carbonio amorfo. Questa lamina di carbonio amorfo modellata è supportata da una griglia TEM che porta una maglia di barre di supporto in rame o oro. Nei flussi di lavoro standard, le griglie vengono rese idrofile utilizzando un trattamento al plasma a scarica luminosa prima dell'applicazione del campione. Il liquido in eccesso viene tamponato con carta da filtro, consentendo alla soluzione proteica di formare un sottile film liquido attraverso i fori che può essere prontamente vetrificato durante il surgelaggio. Le sfide più comuni includono la localizzazione delle particelle all'interfaccia aria-acqua (AWI) e la successiva denaturazione20,21,22 o l'adozione di orientamenti preferenziali 23,24,25, l'aderenza delle particelle alla lamina di carbonio piuttosto che migrare nei fori e il raggruppamento e l'aggregazione delle particelle all'interno dei fori 26. Lo spessore non uniforme del ghiaccio è un'altra preoccupazione; Il ghiaccio spesso può provocare livelli più elevati di rumore di fondo nelle micrografie a causa dell'aumento della dispersione di elettroni, mentre il ghiaccio estremamente sottile può escludere particelle più grandi27.
Per affrontare queste sfide, è stata utilizzata una varietà di sottili film di supporto per rivestire le superfici della griglia, consentendo alle particelle di riposare su questi supporti e, idealmente, evitare interazioni con l'interfaccia aria-acqua. I supporti in grafene si sono dimostrati molto promettenti, in parte grazie alla loro elevata resistenza meccanica unita alla loro minima sezione trasversale di scattering, che riduce il segnale di fondo aggiunto dallo strato di supporto28. Oltre al suo contributo minimo al rumore di fondo, il grafene presenta anche una notevole conduttività elettrica e termica29. È stato dimostrato che le griglie rivestite di grafene e ossido di grafene producono una maggiore densità di particelle, una distribuzione più uniforme delle particelle30 e una localizzazione ridotta all'AWI22. Inoltre, il grafene fornisce una superficie di supporto che può essere ulteriormente modificata per: 1) regolare le proprietà fisico-chimiche della superficie della griglia attraverso la funzionalizzazione 31,32,33; o 2) agenti leganti di coppia che facilitano la purificazione di affinità delle proteine di interesse 34,35,36.
In questo articolo, abbiamo modificato una procedura esistente per il rivestimento delle griglie cryoEM con un singolo strato uniforme di grafene30. Le modifiche mirano a ridurre al minimo la gestione della rete in tutto il protocollo, con l'obiettivo di aumentare la resa e la riproducibilità. Inoltre, discutiamo il nostro approccio per valutare l'efficacia di vari trattamenti UV/ozono nel rendere idrofile le griglie prima dell'immersione. Questa fase della preparazione dei campioni crioEM utilizzando griglie rivestite di grafene è fondamentale e abbiamo trovato utile il nostro metodo semplice per quantificare l'idrofilia relativa delle griglie risultanti. Utilizzando questo protocollo, dimostriamo l'utilità dell'impiego di griglie rivestite di grafene per la determinazione della struttura generando una ricostruzione 3D ad alta risoluzione di S. pyogenes Cas9 cataliticamente inattivo in complesso con RNA guida e DNA bersaglio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>250 mL beaker (3x)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-555-25B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL beaker (2x)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1000-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A949-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15-078-292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>(I17874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 50 mm x 24 mm</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>PCS-1.5-5024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CVD graphene</td>
			<td>Graphene Supermarket</td>
			<td>CVD-Cu-2x2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>easiGlow discharger</td>
			<td>Ted-Pella</td>
			<td>91000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>1.11727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-tip tweezers&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-239-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cutter</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>21UE26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri plate and cover&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75845-544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass serological pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-34D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grid Storage Case</td>
			<td>EMS</td>
			<td>71146-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-770-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab scissors&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-806-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-Methacrylate EL-6&#160;</td>
			<td>Kayaku</td>
			<td>MMA M310006 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-000-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative action tweezers (2x)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-242-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20 pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200 pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17008652&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>30389291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil grids with holey carbon&#160;</td>
			<td>EMS</td>
			<td>Q2100CR1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater&#160;</td>
			<td>SetCas</td>
			<td>KW-4A</td>
			<td>with chuck SCA-19-23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straightedge</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>H-6560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer&#160;</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>3LRD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Ozone cleaner&#160;</td>
			<td>BioForce</td>
			<td>SKU: PC440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1159X11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28297-216</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of monolayer graphene to cryo-electron microscopy grids for high-resolution structure determination

Nella microscopia elettronica criogenica (cryoEM), le macromolecole purificate vengono applicate a una griglia contenente una lamina di carbonio bucata; Le molecole vengono quindi tamponate per rimuovere il liquido in eccesso e congelate rapidamente in uno strato di ghiaccio vetroso spesso circa 20-100 nm, sospeso su fori di lamina larghi circa 1 μm. Il campione risultante viene ripreso utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione criogenica e, dopo l'elaborazione dell'immagine utilizzando un software adatto, è possibile determinare strutture a risoluzione quasi atomica. Nonostante l'adozione diffusa di cryoEM, la preparazione dei campioni rimane un grave collo di bottiglia nei flussi di lavoro di cryoEM, con gli utenti che spesso incontrano sfide legate ai campioni che si comportano male nel ghiaccio vitreo sospeso. Recentemente, sono stati sviluppati metodi per modificare le griglie crioEM con un singolo strato continuo di grafene, che funge da superficie di supporto che spesso aumenta la densità delle particelle nell'area ripresa e può ridurre le interazioni tra le particelle e l'interfaccia aria-acqua. Qui, forniamo protocolli dettagliati per l'applicazione del grafene alle griglie crioEM e per valutare rapidamente l'idrofilia relativa delle griglie risultanti. Inoltre, descriviamo un metodo basato su EM per confermare la presenza di grafene visualizzando il suo caratteristico modello di diffrazione. Infine, dimostriamo l'utilità di questi supporti di grafene ricostruendo rapidamente una mappa di densità con risoluzione di 2,7 Å di un complesso Cas9 utilizzando un campione puro a una concentrazione relativamente bassa.

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

La fabbricazione di successo di griglie crioEM rivestite di grafene utilizzando l'apparecchiatura (Figura 1) e il protocollo (Figura 2) qui delineati si tradurrà in un monostrato di grafene che copre i fori della lamina che può essere confermato dal suo caratteristico modello di diffrazione. Per promuovere l'adsorbimento delle proteine sulla superficie del grafene, il trattamento UV/ozono può essere utilizzato per rendere la superficie idrofila installando gr...

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Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

L'applicazione di strati di supporto alle griglie di microscopia elettronica criogenica (cryoEM) può aumentare la densità delle particelle, limitare le interazioni con l'interfaccia aria-acqua, ridurre il movimento indotto dal fascio e migliorare la distribuzione degli orientamenti delle particelle. Questo documento descrive un solido protocollo per il rivestimento delle griglie crioEM con un monostrato di grafene per una migliore preparazione del campione criogenico.

Applicazione del grafene monostrato alle griglie di microscopia crioelettronica per la determinazione della struttura ad alta risoluzione

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Una sfida comune nella preparazione dei campioni di microscopia crioelettronica è la localizzazione delle particelle all'interfaccia aria-acqua, che fa sì che le particelle adottino orientamenti e denaturano preferenziali. Invece, è meglio che le particelle poggino sulla superficie della griglia, che il film sottile supporta, come il grafene promuove. Un'altra sfida è la necessità di concentrazioni di campioni relativamente elevate, che potrebbero essere affrontate anche dal grafene.Le griglie rivestite in grafene offrono numerosi vantaggi per la determinazione della struttura crioEM, ma sono state storicamente difficili da fabbricare internamente in modo riproducibile, oltre a costi proibitivi per l'acquisto commerciale. Questo protocollo consente la deposizione robusta di grafene monostrato, abbassando così la barriera per gli utenti che impiegano queste griglie nella loro ricerca. Il grafene è unico per le sue proprietà materiali.Si tratta di un monostrato di carbonio e quindi presenta un rumore di fondo minimo. Altri supporti della griglia cryoEM, come un sottile strato di fiocchi di carbonio amorfo o ossido di grafene, non possono essere applicati come un singolo monostrato e contribuiscono a un maggiore segnale di fondo. Ora che abbiamo stabilito un protocollo robusto per l'applicazione del grafene alle griglie crioEM, vorremmo perseguire la funzionalizzazione di griglie rivestite di grafene con maniglie di affinità per la cattura on-grid direttamente dai lisati cellulari.Ciò potrebbe alleviare un altro collo di bottiglia nella preparazione dei campioni crioEM.