Name: Autor im Rampenlicht: Entwicklung eines einzigartigen modularen mikrophysiologischen Systems zur Nachahmung von menschlichem Barrieregewebe
Uploaded: 2024-02-16T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Developing a Unique Modular Microphysiological System to Mimic Human Barrier Tissue at JoVE.com

Diese Forschung wurde teilweise vom National Institute of Health unter den Fördernummern R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 und NSF-Zuschuss CBET 2150798 finanziert. Die Autoren danken dem RIT Machine Shop für die Herstellung von Aluminiumformen. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder.

Dieses Design kann in verschiedenen Modi verwendet werden, basierend auf experimentellen Anforderungen und den Vorlieben des Endbenutzers. Konsultieren Sie vor jedem Experiment das in Abbildung 2 dargestellte Entscheidungsflussdiagramm, um die erforderlichen Schritte und Module für das Protokoll zu bestimmen. Wenn der Benutzer beispielsweise beabsichtigt, das Open-Well-Format während eines Experiments beizubehalten, um es direkt mit dem Transwell-System zu vergleichen, ist die Strukturieru...

Eine rekonfigurierbare Barrieregewebeplattform mit Open-Well- und Mikrofluidik-Modi

<ol>
	<li>Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+the+Endothelial+Barrier:+Identifying+and+Reconciling+Controversies.">Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies.</a> Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).</li><li>Vera, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+tissue+barrier+models+on+hydrogel+microfluidic+platforms.">Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 13 (12), 13920-13933 (2021).</li><li>Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+blood-brain+barrier+model+provides+in+vivo-like+barrier+properties+for+drug+permeability+screening.">Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (1), 184-194 (2017).</li><li>Sakolish, C. M., Esch, M. B., Hickman, J. J., Shuler, M. L., Mahler, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+barrier+tissues+in+vitro:+methods,+achievements,+and+challenges.">Modeling barrier tissues in vitro: methods, achievements, and challenges.</a> eBioMedicine. 5, 30-39 (2016).</li><li>Kaisar, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+experimental+models+of+the+blood-brain+barrier+for+CNS+drug+discovery.">New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).</li><li>Tan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+microfluidic+microphysiological+system+(PREDICT-96)+to+recapitulate+hepatocyte+function+in+dynamic,+re-circulating+flow+conditions.">A high-throughput microfluidic microphysiological system (PREDICT-96) to recapitulate hepatocyte function in dynamic, re-circulating flow conditions.</a> Lab on a Chip. 19 (9), 1556-1566 (2019).</li><li>Ayuso, J. M., Virumbrales-Mu&#241;oz, M., Lang, J. M., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+microfluidic+systems+in+precision+medicine.">A role for microfluidic systems in precision medicine.</a> Nature Communications. 13 (1), 3086 (2022).</li><li>Katt, M. E., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+building+in+physiological+complexity.">In vitro models of the blood-brain barrier: building in physiological complexity.</a> Current Opinion in Chemical Engineering. 30, 42-52 (2020).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organs-on-chips+for+disease+modelling,+drug+development+and+personalized+medicine.">Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine.</a> Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).</li><li>Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+reframing+biological+enquiry.">Microfluidics: reframing biological enquiry.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (9), 554-567 (2015).</li><li>Williams, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost,+rapidly+integrated+debubbler+(rid)+module+for+microfluidic+cell+culture+applications.">A low-cost, rapidly integrated debubbler (rid) module for microfluidic cell culture applications.</a> Micromachines. 10 (6), 360 (2019).</li><li>Ahmed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+fiber+anisotropy+within+natural+collagen+hydrogels.">Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), C1112-C1124 (2021).</li><li>Ahmed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineered+3D+collagen+gels+with+independently+tunable+fiber+anisotropy+and+directionality.">Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality.</a> Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).</li><li>&#321;ach, A., Wnuk, A., W&#243;jtowicz, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+to+study+the+functions+of+the+blood-brain+barrier.">Experimental models to study the functions of the blood-brain barrier.</a> Bioengineering. 10 (5), 519 (2023).</li><li>McCloskey, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Modular+&#181;SiM:+A+mass+produced,+rapidly+assembled,+and+reconfigurable+platform+for+the+study+of+barrier+tissue+models+in+vitro.">The Modular &#181;SiM: A mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (18), 2200804 (2022).</li><li>Mansouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modular+&#181;sim+reconfigured:+integration+of+microfluidic+capabilities+to+study+in+vitro+barrier+tissue+models+under+flow.">The modular &#181;sim reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (21), 2200802 (2022).</li><li>Hudecz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+a+human+blood-brain+barrier+co-culture+using+an+ultrathin+silicon+nitride+membrane-based+microfluidic+device.">Modelling a human blood-brain barrier co-culture using an ultrathin silicon nitride membrane-based microfluidic device.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (6), 5624 (2023).</li><li>Joshi, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineering+3D+Collagen+Matrices+with+Tumor-Mimetic+Gradients+in+Fiber+Alignment.">Microengineering 3D Collagen Matrices with Tumor-Mimetic Gradients in Fiber Alignment.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Hsu, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miniaturized+3D+printed+pressure+regulator+(&#181;PR)+for+microfluidic+cell+culture+applications.">A miniaturized 3D printed pressure regulator (&#181;PR) for microfluidic cell culture applications.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10769 (2022).</li><li>Rogers, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+microfluidic+bilayer+co-culture+platform+to+study+endothelial-pericyte+interactions.">A high-throughput microfluidic bilayer co-culture platform to study endothelial-pericyte interactions.</a> Scientific reports. 11 (1), 12225 (2021).</li><li>Wettschureck, N., Strilic, B., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passing+the+vascular+barrier:+endothelial+signaling+processes+controlling+extravasation.">Passing the vascular barrier: endothelial signaling processes controlling extravasation.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1467-1525 (2019).</li><li>Wang, Y. I., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UniChip+enables+long-term+recirculating+unidirectional+perfusion+with+gravity-driven+flow+for+microphysiological+systems.">UniChip enables long-term recirculating unidirectional perfusion with gravity-driven flow for microphysiological systems.</a> Lab on a Chip. 18 (17), 2563-2574 (2018).</li><li>Nayak, L., Lin, Z., Jain, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Go+with+the+flow&amp;#34;:+how+Kr&#252;ppel-like+factor+2+regulates+the+vasoprotective+effects+of+shear+stress.">34;Go with the flow&amp;#34;: how Kr&#252;ppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 15 (5), 1449-1461 (2011).</li><li>Satoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pneumatic+pressure-driven+multi-throughput+microfluidic+circulation+culture+system.">A pneumatic pressure-driven multi-throughput microfluidic circulation culture system.</a> Lab on a chip. 16 (12), 2339-2348 (2016).</li><li>Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reversibly+sealed,+easy+access,+modular+(seam)+microfluidic+architecture+to+establish+in+vitro+tissue+interfaces.">A Reversibly sealed, easy access, modular (seam) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces.</a> PLOS ONE. 11 (5), e0156341 (2016).</li><li>Ahmed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+extensional+flows+promote+long-range+fiber+alignment+in+3D+collagen+hydrogels.">Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels.</a> Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).</li><li>Hasan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+fabrication+of+flexible+nanotextured+PDMS+as+a+substrate+for+selective+cell+capture.">One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture.</a> Biomedical Physics &amp; Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).</li><li>Ahmed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineering+3D+collagen+hydrogels+with+long-range+fiber+alignment.">Microengineering 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment.</a> Journal of Visualized Experiments. 187, e64457 (2022).</li></ol>

Ziel dieses Protokolls ist es, eine praktische Methode zu entwickeln, um Durchflussfähigkeiten in eine Open-Well-Plattform mit einer ultradünnen Nanomembran zu integrieren. Bei diesem Design wird ein magnetischer Verriegelungsansatz verwendet, der es ermöglicht, während der Experimente zwischen Open-Well- und Fluidic-Modus zu wechseln und die Vorteile beider Ansätze zu kombinieren. Im Gegensatz zu herkömmlichen dauerhaft verklebten Plattformen ermöglicht die magnetische Verriegelung die Demontage der Plattform an ...

Gefäßbarrieren dienen als kritische Schnittstelle, die das Blutkompartiment vom umgebenden Gewebe trennt. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Erhaltung der Homöostase, indem sie Immunzellen anziehen, die molekulare Permeabilität kontrollieren und das Eindringen von Krankheitserregern in das Gewebe verhindern 1,2. In-vitro-Kulturmodelle wurden entwickelt, um die In-vivo-Mikroumgebung nachzuahmen und systematische Untersuchungen der Faktoren und Bedingungen zu ermöglichen, die die Barriereeigenschaften sowohl im gesunden als auch im kranken Zustand beeinflussen 3,4.
Der am weitesten verbreitete Ansatz für solche Kulturmodelle ist die Transwell-ähnliche "Open-Well"-Konfiguration5, bei der eine poröse, spurgeätzte Kulturmembran mediengefüllte Kompartimente trennt (Abbildung 1A). In diesem Format können Zellen auf beiden Seiten der Membran ausgesät werden, und es wurde eine breite Palette von experimentellen Protokollen entwickelt. Diese Systeme sind jedoch nur begrenzt in ihrer Fähigkeit, die Flüssigkeitsströme bereitzustellen, die für die Unterstützung der Barrierereifung und die Nachahmung der Immunzellzirkulation in vivo unerlässlich sind 5,6. Folglich können sie nicht für Studien verwendet werden, die dynamische Strömungen erfordern, die Arzneimitteldosen, mechanische Stimulation oder flüssigkeitsinduzierte Scherspannungen einführen 6,7,8.
Um die Einschränkungen von Open-Well-Systemen zu überwinden, wurden mikrofluidische Plattformen entwickelt, die poröse Kulturmembranen mit individuell adressierbaren fluidischen Kanälen kombinieren9. Diese Plattformen bieten eine präzise Kontrolle über das Routing von Flüssigkeiten, die Perfusion und das Einbringen chemischer Verbindungen, eine kontrollierte Scherstimulation und dynamische Zelladditionsfunktionen 7,10,11,12,13. Trotz der fortschrittlichen Fähigkeiten, die mikrofluidische Plattformen bieten, haben sie aufgrund komplexer mikrofluidischer Protokolle und ihrer Inkompatibilität mit etablierten experimentellen Arbeitsabläufen keine weit verbreitete Akzeptanz in biowissenschaftlichen Laborsgefunden 4,10,14.
Um die Lücke zwischen diesen Technologien zu schließen, stellen wir ein Protokoll vor, das ein magnetisch rekonfigurierbares, modulbasiertes System verwendet. Dieses System kann je nach den spezifischen Anforderungen des Experiments einfach zwischen Open-Well- und Mikrofluidik-Modus umgeschaltet werden. Die Plattform verfügt über ein Open-Well-Gerät, bekannt als m-μSiM (modulares mikrophysiologisches System, das durch eine Siliziummembran ermöglicht wird), mit einer 100 nm dicken Kulturmembran (Nanomembran). Diese Nanomembran besitzt eine hohe Porosität (15 %) und glasartige Transparenz, wie in Abbildung 1B dargestellt. Es trennt physikalisch das obere Kompartiment von einem unteren Kanal und ermöglicht so den molekularen Transport über physiologische Längenskalen15. Im Gegensatz zu herkömmlichen spurgeätzten Membranen, die bekannte Herausforderungen bei der Bildgebung lebender Zellen mit Hellfeld-Bildgebung haben, ermöglichen die günstigen optischen und physikalischen Eigenschaften der Nanomembran eine klare Visualisierung von Zellen auf beiden Seiten der Membranoberfläche 15,16,17.
Das vorliegende Protokoll skizziert die Herstellung von spezialisierten Seeding- und Flow-Modulen und erklärt die magnetische Rekonfiguration der Plattform. Es zeigt, wie die Plattform eingesetzt werden kann, um Endothelbarrieren sowohl unter statischen als auch unter dynamischen Bedingungen zu etablieren. Diese Demonstration zeigt, dass sich Endothelzellen entlang der Flussrichtung ausrichten, wobei die scherempfindlichen Genziele unter Scherstimulation hochreguliert werden.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 x 0.86 Micro Flow tubes</td>
			<td>Langer Instruments</td>
			<td>WX10-14 &#38; DG Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS 7.4 pH</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG20-1.5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG21-1.0HPX-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)</td>
			<td>DigiKey</td>
			<td>3M9726-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)</td>
			<td>DigiKey</td>
			<td>3M9720-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488 conjugated phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A12379&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems&#160;TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ64100-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K171</td>
			<td>12&#34; x 12&#34; x 1/16&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8589K31</td>
			<td>12&#34; x 12&#34; x 3/32&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K191</td>
			<td>12&#34; x 12&#34; x 7.64&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Fibronectin, Human, 1 mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47743-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixture A1&#38;A2</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixture B1&#38;B2</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4374966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C0035C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)</td>
			<td>K&#38;J Magnetics</td>
			<td>D31</td>
			<td>3/16&#34; dia.&#160;x 1/16&#34; thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>aa47392-9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Langer Instruments</td>
			<td>BQ50-1J-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 developer solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9901158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF syringe filters</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2542913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University wafer,USA</td>
			<td>1196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0702369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Pierce 20x PBS Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100500-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI-reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrathin Nanoporous Membrane Chip</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NPSN100-1L</td>
			<td>The design is&#160; compatible with all of SiMPore membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uSiM component 1</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uSiM component 2</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transforming static barrier tissue models into dynamic microphysiological systems

Mikrophysiologische Systeme sind miniaturisierte Zellkulturplattformen, die verwendet werden, um die Struktur und Funktion menschlicher Gewebe in einer Laborumgebung nachzuahmen. Diese Plattformen haben jedoch keine breite Akzeptanz in biowissenschaftlichen Labors gefunden, wo membranbasierte Ansätze mit offenen Bohrlöchern als Goldstandard für die Nachahmung von Gewebebarrieren dienen, obwohl sie keine Flüssigkeitsflussfähigkeiten haben. Dieses Problem kann in erster Linie auf die Inkompatibilität bestehender mikrophysiologischer Systeme mit Standardprotokollen und -werkzeugen zurückgeführt werden, die für Open-Well-Systeme entwickelt wurden.
Hier stellen wir ein Protokoll zur Erstellung einer rekonfigurierbaren membranbasierten Plattform mit einer Open-Well-Struktur, Durchflussverbesserungsfähigkeit und Kompatibilität mit herkömmlichen Protokollen vor. Dieses System verwendet einen magnetischen Montageansatz, der ein reversibles Umschalten zwischen Open-Well- und Mikrofluidik-Modus ermöglicht. Mit diesem Ansatz haben Benutzer die Flexibilität, ein Experiment im Open-Well-Format mit Standardprotokollen zu beginnen und bei Bedarf Durchflussfunktionen hinzuzufügen oder zu entfernen. Um die praktische Anwendung dieses Systems und seine Kompatibilität mit Standardtechniken zu demonstrieren, wurde eine Endothelzell-Monoschicht in einem Open-Well-Format etabliert. Das System wurde neu konfiguriert, um einen Flüssigkeitsfluss einzuführen, und dann auf das Open-Well-Format umgestellt, um Immunfärbung und RNA-Extraktion durchzuführen. Aufgrund seiner Kompatibilität mit herkömmlichen Open-Well-Protokollen und der Fähigkeit zur Flussverbesserung wird erwartet, dass dieses rekonfigurierbare Design sowohl von technischen als auch von biowissenschaftlichen Labors übernommen wird.

Vascular barriers serve as a critical interface that separates the blood compartment from the surrounding tissue. They play a critical role in preserving homeostasis by attracting immune cells, controlling molecular permeability, and shielding against the intrusion of pathogens into the tissue1,2. In vitro culture models have been developed to mimic the in vivo microenvironment, enabling systematic investigations into the factors and conditions that impact barrier properties in both healthy and diseased states3,4.
The most widely used approach for such culture models is the Transwell-like &#34;open-well&#34; configuration5, where a porous, track-etched culture membrane separates media-filled compartments (Figure 1A). In this format, cells can be seeded on either side of the membrane, and a wide range of experimental protocols has been developed. However, these systems are limited in their ability to provide the fluid flows essential for supporting barrier maturation and mimicking immune cell circulation seen in vivo5,6. Consequently, they cannot be used for studies requiring dynamic flows that introduce drug doses, mechanical stimulation, or fluid-induced shear stresses6,7,8.
To overcome the limitations of open-well systems, microfluidic platforms that combine porous culture membranes with individually addressable fluidic channels have been developed9. These platforms offer precise control over fluid routing, perfusion, and the introduction of chemical compounds, controlled shear stimulation, and dynamic cell addition capabilities7,10,11,12,13. Despite the advanced capabilities provided by microfluidic platforms, they have not seen widespread adoption in bioscience laboratories due to complex microfluidic protocols and their incompatibility with established experimental workflows4,10,14.
To bridge the gap between these technologies, we present a protocol that employs a magnetically reconfigurable, module-based system. This system can be easily switched between open-well and microfluidic modes based on the specific needs of the experiment. The platform features an open-well device, known as m-&#181;SiM (modular microphysiological system enabled by a silicon membrane), with a 100 nm thick culture membrane (nanomembrane). This nanomembrane possesses high porosity (15%) and glass-like transparency, as illustrated in Figure 1B. It physically separates the top compartment from a bottom channel, allowing for molecular transport across physiological length scales15. Unlike conventional track-etched membranes, which have known challenges in imaging live cells with bright-field imaging, the nanomembrane&#39;s favorable optical and physical properties enable clear visualization of cells on either side of the membrane surface15,16,17.
The present protocol outlines the fabrication of specialized seeding and flow modules and explains the magnetic reconfiguration of the platform. It demonstrates how the platform can be employed to establish endothelial barriers under both static and dynamic conditions. This demonstration reveals that endothelial cells align along the flow direction, with an upregulation of shear-sensitive gene targets under shear stimulation.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung eines einzigartigen modularen mikrophysiologischen Systems zur Nachahmung von menschlichem Barrieregewebe

Umwandlung von statischen Barrieregewebemodellen in dynamische mikrophysiologische Systeme

We're developing modular microphysiological systems that mimic human barrier tissues. Our system is unique because it can be reconfigured from a static open well culture to a flow-enhanced system. This flexibility allows the platform to be used in both bioscience and engineering-focused laboratories.We present a protocol for creating a reconfigurable open well platform with flow-enhanced culture and lifestyle imaging. It is compatible with conventional bioscience protocols. Our reconfigurable design allows users to switch between the open well and microfluidic modes during an experiment, and allows the user to conduct each step using a format they are comfortable with.

Das Open-Well-Core-Modul wird zunächst in einem bestimmten Hohlraum positioniert, der durch ein niedrigeres Gehäuse und ein Deckglas entsteht, wie in Abbildung 6A dargestellt. Anschließend wird das Durchflussmodul, das einen Mikrokanal und Zugangsöffnungen umfasst, in die Vertiefung des Kernmoduls eingesetzt. Das Strömungsmodul ist aufgrund der magnetischen Anziehungskraft zwischen Magneten, die in das untere und obere Gehäuse eingebettet sind, wie in Abbildung 6B<...

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Dieses Protokoll beschreibt eine rekonfigurierbare membranbasierte Zellkulturplattform, die das Open-Well-Format mit Flüssigkeitsflussfunktionen integriert. Diese Plattform ist mit Standardprotokollen kompatibel und ermöglicht reversible Übergänge zwischen Open-Well- und mikrofluidischen Kulturmodi, um den Anforderungen von Ingenieur- und Biowissenschaftslabors gerecht zu werden.

Microphysiological systems are miniaturized cell culture platforms used to mimic the structure and function of human tissues in a laboratory setting. ...

Wir entwickeln modulare mikrophysiologische Systeme, die menschliches Barrieregewebe nachahmen. Unser System ist einzigartig, weil es von einer statischen Open-Well-Kultur zu einem flussverstärkten System umkonfiguriert werden kann. Diese Flexibilität ermöglicht den Einsatz der Plattform sowohl in biowissenschaftlichen als auch in ingenieurwissenschaftlichen Labors.Wir stellen ein Protokoll zur Erstellung einer rekonfigurierbaren Open-Well-Plattform mit flussverstärkter Kultur und Lifestyle-Bildgebung vor. Es ist mit herkömmlichen biowissenschaftlichen Protokollen kompatibel. Unser rekonfigurierbares Design ermöglicht es dem Benutzer, während eines Experiments zwischen dem Open-Well- und dem Mikrofluidik-Modus zu wechseln, und ermöglicht es dem Benutzer, jeden Schritt in einem Format durchzuführen, mit dem er vertraut ist.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Transforming Static Barrier Tissue Models into Dynamic Microphysiological Systems

Microphysiological systems are miniaturized cell culture platforms used to mimic the structure and function of human tissues in a laboratory setting. However, these platforms have not gained widespread adoption in bioscience laboratories where open-well, membrane-based approaches serve as the gold standard for mimicking tissue barriers, despite lacking fluid flow capabilities. This issue can be primarily attributed to the incompatibility of existing microphysiological systems with standard protocols and tools developed for open-well systems.
Here, we present a protocol for creating a reconfigurable membrane-based platform with an open-well structure, flow enhancement capability, and compatibility with conventional protocols. This system utilizes a magnetic assembly approach that enables reversible switching between open-well and microfluidic modes. With this approach, users have the flexibility to begin an experiment in the open-well format using standard protocols and add or remove flow capabilities as needed. To demonstrate the practical usage of this system and its compatibility with standard techniques, an endothelial cell monolayer was established in an open-well format. The system was reconfigured to introduce fluid flow and then switched to the open-well format to conduct immunostaining and RNA extraction. Due to its compatibility with conventional open-well protocols and flow enhancement capability, this reconfigurable design is expected to be adopted by both engineering and bioscience laboratories.

This protocol describes a reconfigurable membrane-based cell culture platform that integrates the open-well format with fluid flow capabilities. This platform is compatible with standard protocols and allows for reversible transitions between open-well and microfluidic culture modes, accommodating the needs of both engineering and bioscience laboratories.