Name: מחבר זרקור: פיתוח מערכת מיקרופיזיולוגית מודולרית ייחודית לחיקוי רקמת מחסום אנושית
Uploaded: 2024-02-16T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Developing a Unique Modular Microphysiological System to Mimic Human Barrier Tissue at JoVE.com

מחקר זה מומן בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות תחת מספרי פרסים R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 ומענק NSF CBET 2150798. המחברים מודים ל-RIT Machine Shop על ייצור עובש אלומיניום. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

ניתן להשתמש בעיצוב זה במצבים שונים בהתבסס על דרישות ניסיוניות והעדפות משתמש הקצה. לפני כל ניסוי, עיין בתרשים זרימת ההחלטות המוצג באיור 2 כדי לקבוע את השלבים והמודולים הדרושים עבור הפרוטוקול. לדוגמה, אם המשתמש מתכוון לשמור על תבנית הבאר הפתוחה במהלך ניסוי כדי להשוות אותה יש...

פלטפורמת רקמת מחסום הניתנת להגדרה מחדש עם מצבי באר פתוחה ומיקרופלואידית

<ol>
	<li>Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+the+Endothelial+Barrier:+Identifying+and+Reconciling+Controversies.">Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies.</a> Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).</li><li>Vera, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+tissue+barrier+models+on+hydrogel+microfluidic+platforms.">Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 13 (12), 13920-13933 (2021).</li><li>Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+blood-brain+barrier+model+provides+in+vivo-like+barrier+properties+for+drug+permeability+screening.">Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114 (1), 184-194 (2017).</li><li>Sakolish, C. M., Esch, M. B., Hickman, J. J., Shuler, M. L., Mahler, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+barrier+tissues+in+vitro:+methods,+achievements,+and+challenges.">Modeling barrier tissues in vitro: methods, achievements, and challenges.</a> eBioMedicine. 5, 30-39 (2016).</li><li>Kaisar, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+experimental+models+of+the+blood-brain+barrier+for+CNS+drug+discovery.">New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).</li><li>Tan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+microfluidic+microphysiological+system+(PREDICT-96)+to+recapitulate+hepatocyte+function+in+dynamic,+re-circulating+flow+conditions.">A high-throughput microfluidic microphysiological system (PREDICT-96) to recapitulate hepatocyte function in dynamic, re-circulating flow conditions.</a> Lab on a Chip. 19 (9), 1556-1566 (2019).</li><li>Ayuso, J. M., Virumbrales-Mu&#241;oz, M., Lang, J. M., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+microfluidic+systems+in+precision+medicine.">A role for microfluidic systems in precision medicine.</a> Nature Communications. 13 (1), 3086 (2022).</li><li>Katt, M. E., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier:+building+in+physiological+complexity.">In vitro models of the blood-brain barrier: building in physiological complexity.</a> Current Opinion in Chemical Engineering. 30, 42-52 (2020).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organs-on-chips+for+disease+modelling,+drug+development+and+personalized+medicine.">Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine.</a> Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).</li><li>Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+reframing+biological+enquiry.">Microfluidics: reframing biological enquiry.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (9), 554-567 (2015).</li><li>Williams, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost,+rapidly+integrated+debubbler+(rid)+module+for+microfluidic+cell+culture+applications.">A low-cost, rapidly integrated debubbler (rid) module for microfluidic cell culture applications.</a> Micromachines. 10 (6), 360 (2019).</li><li>Ahmed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+fiber+anisotropy+within+natural+collagen+hydrogels.">Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), C1112-C1124 (2021).</li><li>Ahmed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineered+3D+collagen+gels+with+independently+tunable+fiber+anisotropy+and+directionality.">Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality.</a> Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).</li><li>&#321;ach, A., Wnuk, A., W&#243;jtowicz, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+to+study+the+functions+of+the+blood-brain+barrier.">Experimental models to study the functions of the blood-brain barrier.</a> Bioengineering. 10 (5), 519 (2023).</li><li>McCloskey, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Modular+&#181;SiM:+A+mass+produced,+rapidly+assembled,+and+reconfigurable+platform+for+the+study+of+barrier+tissue+models+in+vitro.">The Modular &#181;SiM: A mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (18), 2200804 (2022).</li><li>Mansouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modular+&#181;sim+reconfigured:+integration+of+microfluidic+capabilities+to+study+in+vitro+barrier+tissue+models+under+flow.">The modular &#181;sim reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (21), 2200802 (2022).</li><li>Hudecz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+a+human+blood-brain+barrier+co-culture+using+an+ultrathin+silicon+nitride+membrane-based+microfluidic+device.">Modelling a human blood-brain barrier co-culture using an ultrathin silicon nitride membrane-based microfluidic device.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (6), 5624 (2023).</li><li>Joshi, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineering+3D+Collagen+Matrices+with+Tumor-Mimetic+Gradients+in+Fiber+Alignment.">Microengineering 3D Collagen Matrices with Tumor-Mimetic Gradients in Fiber Alignment.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Hsu, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miniaturized+3D+printed+pressure+regulator+(&#181;PR)+for+microfluidic+cell+culture+applications.">A miniaturized 3D printed pressure regulator (&#181;PR) for microfluidic cell culture applications.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10769 (2022).</li><li>Rogers, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+microfluidic+bilayer+co-culture+platform+to+study+endothelial-pericyte+interactions.">A high-throughput microfluidic bilayer co-culture platform to study endothelial-pericyte interactions.</a> Scientific reports. 11 (1), 12225 (2021).</li><li>Wettschureck, N., Strilic, B., Offermanns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passing+the+vascular+barrier:+endothelial+signaling+processes+controlling+extravasation.">Passing the vascular barrier: endothelial signaling processes controlling extravasation.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1467-1525 (2019).</li><li>Wang, Y. I., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UniChip+enables+long-term+recirculating+unidirectional+perfusion+with+gravity-driven+flow+for+microphysiological+systems.">UniChip enables long-term recirculating unidirectional perfusion with gravity-driven flow for microphysiological systems.</a> Lab on a Chip. 18 (17), 2563-2574 (2018).</li><li>Nayak, L., Lin, Z., Jain, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Go+with+the+flow&amp;#34;:+how+Kr&#252;ppel-like+factor+2+regulates+the+vasoprotective+effects+of+shear+stress.">34;Go with the flow&amp;#34;: how Kr&#252;ppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 15 (5), 1449-1461 (2011).</li><li>Satoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pneumatic+pressure-driven+multi-throughput+microfluidic+circulation+culture+system.">A pneumatic pressure-driven multi-throughput microfluidic circulation culture system.</a> Lab on a chip. 16 (12), 2339-2348 (2016).</li><li>Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reversibly+sealed,+easy+access,+modular+(seam)+microfluidic+architecture+to+establish+in+vitro+tissue+interfaces.">A Reversibly sealed, easy access, modular (seam) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces.</a> PLOS ONE. 11 (5), e0156341 (2016).</li><li>Ahmed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+extensional+flows+promote+long-range+fiber+alignment+in+3D+collagen+hydrogels.">Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels.</a> Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).</li><li>Hasan, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+fabrication+of+flexible+nanotextured+PDMS+as+a+substrate+for+selective+cell+capture.">One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture.</a> Biomedical Physics &amp; Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).</li><li>Ahmed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microengineering+3D+collagen+hydrogels+with+long-range+fiber+alignment.">Microengineering 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment.</a> Journal of Visualized Experiments. 187, e64457 (2022).</li></ol>

מטרת פרוטוקול זה היא לפתח שיטה מעשית לשילוב יכולות זרימה בפלטפורמת באר פתוחה הכוללת ננו-ממברנה דקה במיוחד. בתכנון זה נעשה שימוש בגישת הצמדה מגנטית, המאפשרת מעבר בין מצב באר פתוחה למצב זורם במהלך ניסויים ושילוב היתרונות של שתי הגישות. שלא כמו פלטפורמות קונבנציונליות מלוכדות לצמיתות, הצמדה...

מחסומי כלי הדם משמשים כממשק קריטי המפריד בין תא הדם לרקמה הסובבת אותו. הם ממלאים תפקיד קריטי בשימור הומאוסטזיס על ידי משיכת תאים חיסוניים, שליטה בחדירות מולקולרית והגנה מפני חדירת פתוגנים לרקמה 1,2. מודלים של תרביות חוץ גופיות פותחו כדי לחקות את המיקרו-סביבה in vivo, ומאפשרים חקירות שיטתיות של הגורמים והתנאים המשפיעים על תכונות המחסום במצבים בריאים וחוליםכאחד 3,4.
הגישה הנפוצה ביותר עבור מודלים כאלה של תרביות היא תצורת "באר פתוחה"5 דמוית Transwell, שבה קרום תרבית נקבובי חרוט מסילה מפריד בין תאים מלאים במדיה (איור 1A). בפורמט זה ניתן לזרוע תאים משני צדי הממברנה, ופותח מגוון רחב של פרוטוקולים ניסיוניים. עם זאת, מערכות אלה מוגבלות ביכולתן לספק את זרמי הנוזלים החיוניים לתמיכה בהבשלת מחסום ולחיקוי זרימת תאי מערכת החיסון הנראית in vivo 5,6. כתוצאה מכך, לא ניתן להשתמש בהם למחקרים הדורשים זרימות דינמיות המציגות מינוני תרופות, גירוי מכני או לחצים גזירים הנגרמים על ידי נוזל 6,7,8.
כדי להתגבר על המגבלות של מערכות באר פתוחה, פותחו פלטפורמות מיקרופלואידיות המשלבות קרומי תרבית נקבוביות עם תעלות פלואידיות הניתנות להתייחסות בנפרד9. פלטפורמות אלה מציעות שליטה מדויקת על ניתוב נוזלים, זילוח והכנסת תרכובות כימיות, גירוי גזירה מבוקר ויכולות חיבור תאים דינמיות 7,10,11,12,13. למרות היכולות המתקדמות שמספקות פלטפורמות מיקרופלואידיות, הן לא ראו אימוץ נרחב במעבדות ביו-מדעיות בשל פרוטוקולים מיקרופלואידים מורכבים וחוסר התאמתם לתהליכי עבודה ניסיוניים מבוססים 4,10,14.
כדי לגשר על הפער בין טכנולוגיות אלה, אנו מציגים פרוטוקול המשתמש במערכת מגנטית הניתנת להגדרה מחדש, מבוססת מודולים. מערכת זו ניתנת להחלפה בקלות בין מצב באר פתוחה למצב מיקרופלואיד בהתבסס על הצרכים הספציפיים של הניסוי. הפלטפורמה כוללת התקן באר פתוחה, המכונה m-μSiM (מערכת מיקרופיזיולוגית מודולרית המופעלת על ידי קרום סיליקון), עם קרום תרבית בעובי 100 ננומטר (ננו-ממברנה). לנומברנה זו נקבוביות גבוהה (15%) ושקיפות דמוית זכוכית, כפי שמודגם באיור 1B. הוא מפריד פיזית את התא העליון מהתעלה התחתונה, ומאפשר הובלה מולקולרית על פני סקאלות אורך פיזיולוגיות15. שלא כמו ממברנות קונבנציונליות חרוטות מסלול, שיש להן אתגרים ידועים בדימות תאים חיים עם דימות שדה בהיר, התכונות האופטיות והפיזיקליות החיוביות של הננו-ממברנה מאפשרות הדמיה ברורה של תאים משני צדי משטח הממברנה 15,16,17.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הייצור של מודולי זריעה וזרימה מיוחדים ומסביר את התצורה המגנטית מחדש של הפלטפורמה. הוא מדגים כיצד ניתן להשתמש בפלטפורמה כדי ליצור מחסומי אנדותל בתנאים סטטיים ודינמיים כאחד. הדגמה זו מגלה כי תאי אנדותל מתיישרים לאורך כיוון הזרימה, עם ויסות מוגבר של מטרות גנים רגישות לגזירה תחת גירוי גזירה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 x 0.86 Micro Flow tubes</td>
			<td>Langer Instruments</td>
			<td>WX10-14 &#38; DG Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>95039-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS 7.4 pH</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG20-1.5X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP</td>
			<td>Jensen Global</td>
			<td>JG21-1.0HPX-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)</td>
			<td>DigiKey</td>
			<td>3M9726-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA)</td>
			<td>DigiKey</td>
			<td>3M9720-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488 conjugated phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A12379&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems&#160;TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ64100-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K171</td>
			<td>12&#34; x 12&#34; x 1/16&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8589K31</td>
			<td>12&#34; x 12&#34; x 3/32&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8560K191</td>
			<td>12&#34; x 12&#34; x 7.64&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Fibronectin, Human, 1 mg</td>
			<td>Corning</td>
			<td>47743-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10118-677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixture A1&#38;A2</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixture B1&#38;B2</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4374966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C0035C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force)</td>
			<td>K&#38;J Magnetics</td>
			<td>D31</td>
			<td>3/16&#34; dia.&#160;x 1/16&#34; thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>aa47392-9M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Langer Instruments</td>
			<td>BQ50-1J-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8 developer solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9901158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF syringe filters</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2542913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>University wafer,USA</td>
			<td>1196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3050</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0702369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target gene: eNOS (Hs01574659_m1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4331182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Pierce 20x PBS Tween 20</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100500-422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI-reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM9738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrathin Nanoporous Membrane Chip</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NPSN100-1L</td>
			<td>The design is&#160; compatible with all of SiMPore membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uSiM component 1</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uSiM component 2</td>
			<td>SiMPore Inc.</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transforming static barrier tissue models into dynamic microphysiological systems

מערכות מיקרופיזיולוגיות הן פלטפורמות ממוזערות של תרביות תאים המשמשות לחיקוי המבנה והתפקוד של רקמות אנושיות בתנאי מעבדה. עם זאת, פלטפורמות אלה לא זכו לאימוץ נרחב במעבדות ביו-מדעיות שבהן גישות פתוחות מבוססות ממברנה משמשות כתקן הזהב לחיקוי מחסומי רקמות, למרות שאין להן יכולות זרימת נוזלים. בעיה זו ניתן לייחס בעיקר את חוסר התאימות של מערכות מיקרופיזיולוגיות קיימות עם פרוטוקולים סטנדרטיים וכלים שפותחו עבור מערכות באר פתוחה.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת פלטפורמה מבוססת ממברנה הניתנת להגדרה מחדש עם מבנה באר פתוחה, יכולת שיפור זרימה ותאימות לפרוטוקולים קונבנציונליים. מערכת זו משתמשת בגישת הרכבה מגנטית המאפשרת מעבר הפיך בין מצב באר פתוחה למצב מיקרופלואיד. בגישה זו, למשתמשים יש את הגמישות להתחיל ניסוי בפורמט באר פתוחה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים ולהוסיף או להסיר יכולות זרימה לפי הצורך. כדי להדגים את השימוש המעשי במערכת זו ואת התאמתה לטכניקות סטנדרטיות, הוקמה מונושכבה של תאי אנדותל בפורמט פתוח. המערכת הוגדרה מחדש כדי להכניס זרימת נוזלים ולאחר מכן עברה לפורמט באר פתוחה כדי לבצע אימונוסטיין ומיצוי RNA. בשל תאימותו לפרוטוקולי באר פתוחה קונבנציונליים ויכולת שיפור זרימה, תכנון זה הניתן להגדרה מחדש צפוי להיות מאומץ הן על ידי מעבדות הנדסה והן על ידי מעבדות ביו-מדעיות.

Vascular barriers serve as a critical interface that separates the blood compartment from the surrounding tissue. They play a critical role in preserving homeostasis by attracting immune cells, controlling molecular permeability, and shielding against the intrusion of pathogens into the tissue1,2. In vitro culture models have been developed to mimic the in vivo microenvironment, enabling systematic investigations into the factors and conditions that impact barrier properties in both healthy and diseased states3,4.
The most widely used approach for such culture models is the Transwell-like &#34;open-well&#34; configuration5, where a porous, track-etched culture membrane separates media-filled compartments (Figure 1A). In this format, cells can be seeded on either side of the membrane, and a wide range of experimental protocols has been developed. However, these systems are limited in their ability to provide the fluid flows essential for supporting barrier maturation and mimicking immune cell circulation seen in vivo5,6. Consequently, they cannot be used for studies requiring dynamic flows that introduce drug doses, mechanical stimulation, or fluid-induced shear stresses6,7,8.
To overcome the limitations of open-well systems, microfluidic platforms that combine porous culture membranes with individually addressable fluidic channels have been developed9. These platforms offer precise control over fluid routing, perfusion, and the introduction of chemical compounds, controlled shear stimulation, and dynamic cell addition capabilities7,10,11,12,13. Despite the advanced capabilities provided by microfluidic platforms, they have not seen widespread adoption in bioscience laboratories due to complex microfluidic protocols and their incompatibility with established experimental workflows4,10,14.
To bridge the gap between these technologies, we present a protocol that employs a magnetically reconfigurable, module-based system. This system can be easily switched between open-well and microfluidic modes based on the specific needs of the experiment. The platform features an open-well device, known as m-&#181;SiM (modular microphysiological system enabled by a silicon membrane), with a 100 nm thick culture membrane (nanomembrane). This nanomembrane possesses high porosity (15%) and glass-like transparency, as illustrated in Figure 1B. It physically separates the top compartment from a bottom channel, allowing for molecular transport across physiological length scales15. Unlike conventional track-etched membranes, which have known challenges in imaging live cells with bright-field imaging, the nanomembrane&#39;s favorable optical and physical properties enable clear visualization of cells on either side of the membrane surface15,16,17.
The present protocol outlines the fabrication of specialized seeding and flow modules and explains the magnetic reconfiguration of the platform. It demonstrates how the platform can be employed to establish endothelial barriers under both static and dynamic conditions. This demonstration reveals that endothelial cells align along the flow direction, with an upregulation of shear-sensitive gene targets under shear stimulation.

מחבר זרקור: פיתוח מערכת מיקרופיזיולוגית מודולרית ייחודית לחיקוי רקמת מחסום אנושית

הפיכת מודלים של רקמת מחסום סטטי למערכות מיקרופיזיולוגיות דינמיות

We're developing modular microphysiological systems that mimic human barrier tissues. Our system is unique because it can be reconfigured from a static open well culture to a flow-enhanced system. This flexibility allows the platform to be used in both bioscience and engineering-focused laboratories.We present a protocol for creating a reconfigurable open well platform with flow-enhanced culture and lifestyle imaging. It is compatible with conventional bioscience protocols. Our reconfigurable design allows users to switch between the open well and microfluidic modes during an experiment, and allows the user to conduct each step using a format they are comfortable with.

מודול הליבה הפתוח ממוקם בתחילה בתוך חלל ספציפי שנוצר על-ידי בית תחתון וכיסוי, כפי שמודגם באיור 6A. לאחר מכן, מודול הזרימה, הכולל מיקרו-ערוץ ויציאות גישה, מוכנס לבאר של מודול הליבה. מודול הזרימה אטום היטב כנגד שכבת התמיכה בסיליקון של הממברנה עקב כוח המשיכה המגנטי בין מגנטים המ...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Developing a Unique Modular Microphysiological System to Mimic Human Barrier Tissue at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר פלטפורמת תרבית תאים מבוססת קרום הניתנת להגדרה מחדש המשלבת את פורמט הבאר הפתוחה עם יכולות זרימת נוזלים. פלטפורמה זו תואמת לפרוטוקולים סטנדרטיים ומאפשרת מעברים הפיכים בין מצבי תרבית פתוחה ומיקרופלואידית, תוך מתן מענה לצרכים של מעבדות הנדסה וביו-מדע כאחד.

Microphysiological systems are miniaturized cell culture platforms used to mimic the structure and function of human tissues in a laboratory setting. ...

אנחנו מפתחים מערכות מיקרופיזיולוגיות מודולריות שמחקות רקמות מחסום אנושיות. המערכת שלנו ייחודית מכיוון שניתן להגדיר אותה מחדש מתרבות באר פתוחה סטטית למערכת משופרת זרימה. גמישות זו מאפשרת להשתמש בפלטפורמה הן במעבדות ביו-מדעיות והן במעבדות ממוקדות הנדסה.אנו מציגים פרוטוקול ליצירת פלטפורמת באר פתוחה הניתנת להגדרה מחדש עם תרבות משופרת זרימה והדמיית סגנון חיים. הוא תואם לפרוטוקולים קונבנציונליים של מדעי החיים. העיצוב הניתן להגדרה מחדש שלנו מאפשר למשתמשים לעבור בין מצב באר פתוחה למצב מיקרופלואיד במהלך ניסוי, ומאפשר למשתמש לבצע כל שלב באמצעות פורמט שנוח לו.

transforming-static-barrier-tissue-models-into-dynamic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Transforming Static Barrier Tissue Models into Dynamic Microphysiological Systems

Microphysiological systems are miniaturized cell culture platforms used to mimic the structure and function of human tissues in a laboratory setting. However, these platforms have not gained widespread adoption in bioscience laboratories where open-well, membrane-based approaches serve as the gold standard for mimicking tissue barriers, despite lacking fluid flow capabilities. This issue can be primarily attributed to the incompatibility of existing microphysiological systems with standard protocols and tools developed for open-well systems.
Here, we present a protocol for creating a reconfigurable membrane-based platform with an open-well structure, flow enhancement capability, and compatibility with conventional protocols. This system utilizes a magnetic assembly approach that enables reversible switching between open-well and microfluidic modes. With this approach, users have the flexibility to begin an experiment in the open-well format using standard protocols and add or remove flow capabilities as needed. To demonstrate the practical usage of this system and its compatibility with standard techniques, an endothelial cell monolayer was established in an open-well format. The system was reconfigured to introduce fluid flow and then switched to the open-well format to conduct immunostaining and RNA extraction. Due to its compatibility with conventional open-well protocols and flow enhancement capability, this reconfigurable design is expected to be adopted by both engineering and bioscience laboratories.

This protocol describes a reconfigurable membrane-based cell culture platform that integrates the open-well format with fluid flow capabilities. This platform is compatible with standard protocols and allows for reversible transitions between open-well and microfluidic culture modes, accommodating the needs of both engineering and bioscience laboratories.