Name: Author Spotlight: Efficient Detection of Immune Cell-Infiltration in Cancer Tissues Using Fluorescent Immunohistochemistry
Uploaded: 2024-01-26T14:35:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Efficient Detection of Immune Cell-Infiltration in Cancer Tissues Using Fluorescent Immunohistochemistry at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (NO.81860413, 81960455), Фондом Юньнаньского департамента науки и технологий (202001AY070001-080), Научно-исследовательским фондом Департамента образования провинции Юньнань (2019J1274).

Исследование было одобрено комитетом по медицинской этике Юньнаньской онкологической больницы/Третьей филиальной больницы Куньминского медицинского университета. Все субъекты/законные опекуны подписали информированное согласие.
1. Подготовка слайдов
<ol><li>?...

In Situ Immunohistochemical Detection of Immune Cell Markers in Cancer Tissues

<ol>
	<li>Wanleenuwat, P., Iwanowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastases+to+the+central+nervous+system:+Molecular+basis+and+clinical+considerations.">Metastases to the central nervous system: Molecular basis and clinical considerations.</a> J Neurol Sci. 412, 116755 (2020).</li><li>Schoenmaekers, J., Dingemans, A. C., Hendriks, L. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+imaging+in+early+stage+non-small+cell+lung+cancer:+still+a+controversial+topic.">Brain imaging in early stage non-small cell lung cancer: still a controversial topic.</a> J Thorac Dis. 10, S2168-S2171 (2018).</li><li>Vilari&#241;o, N., Bruna, J., Bosch-Barrera, J., Valiente, M., Nadal, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+in+NSCLC+patients+with+brain+metastases.+Understanding+brain+tumor+microenvironment+and+dissecting+outcomes+from+immune+checkpoint+blockade+in+the+clinic.">Immunotherapy in NSCLC patients with brain metastases. Understanding brain tumor microenvironment and dissecting outcomes from immune checkpoint blockade in the clinic.</a> Cancer Treat Rev. 89, 102067 (2020).</li><li>Babar, Q., Saeed, A., Tabish, T. A., Sarwar, M., Thorat, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+tumor+microenvironment:+Potential+strategy+for+cancer+therapeutics.">Targeting the tumor microenvironment: Potential strategy for cancer therapeutics.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1869 (6), 166746 (2023).</li><li>Goldberg, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pembrolizumab+for+management+of+patients+with+NSCLC+and+brain+metastases:+long-term+results+and+biomarker+analysis+from+a+non-randomised,+open-label,+phase+2+trial.">Pembrolizumab for management of patients with NSCLC and brain metastases: long-term results and biomarker analysis from a non-randomised, open-label, phase 2 trial.</a> Lancet Oncol. 21 (5), 655-663 (2020).</li><li>Sukswai, N., Khoury, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+Innovations+for+Diagnosis+and+Tissue-Based+Biomarker+Detection.">Immunohistochemistry Innovations for Diagnosis and Tissue-Based Biomarker Detection.</a> Curr Hematol Malig Rep. 14 (5), 368-375 (2019).</li><li>Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+in+Investigative+and+Toxicologic+Pathology.">Immunohistochemistry in Investigative and Toxicologic Pathology.</a> Toxicol Pathol. 46 (5), 488-510 (2018).</li><li>Torlakovic, E. E., Nielsen, S., Vyberg, M., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+controls+under+control:+the+time+is+now+for+immunohistochemistry.">Getting controls under control: the time is now for immunohistochemistry.</a> J Clin Pathol. 68 (11), 879-882 (2015).</li><li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+multiplex+immunohistochemistry/immunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy.">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Commun (Lond). 40 (4), 135-153 (2020).</li><li>Wong, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantitative+analysis+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+and+immunotherapy+outcome+in+metastatic+melanoma.">Multiplex quantitative analysis of tumor-infiltrating lymphocytes and immunotherapy outcome in metastatic melanoma.</a> Clin Cancer Res. 25 (8), 2442-2449 (2019).</li><li>Sanchez, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunofluorescence+to+measure+dynamic+changes+in+tumor-infiltrating+lymphocytes+and+PD-L1+in+early-stage+breast+cancer.">Multiplex immunofluorescence to measure dynamic changes in tumor-infiltrating lymphocytes and PD-L1 in early-stage breast cancer.</a> Breast Cancer Res. 23 (1), 2 (2021).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+immunohistochemistry+indicates+biomarkers+in+colorectal+cancer.">Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer.</a> Neoplasma. 68 (6), 1272-1282 (2021).</li><li>Salameh, S., Nouel, D., Flores, C., Hoops, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+immunohistochemistry+protocol+for+detecting+the+guidance+cue+Netrin-1+in+neural+tissue.">An optimized immunohistochemistry protocol for detecting the guidance cue Netrin-1 in neural tissue.</a> MethodsX. 5, 1-7 (2018).</li><li>McClellan, P., Jacquet, R., Yu, Q., Landis, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+the+immunohistochemical+identification+and+localization+of+Osterix+in+periosteum-wrapped+constructs+for+tissue+engineering+of+bone.">A Method for the immunohistochemical identification and localization of Osterix in periosteum-wrapped constructs for tissue engineering of bone.</a> J Histochem Cytochem. 65 (7), 407-420 (2017).</li><li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+black+B+reduces+autofluorescence+in+murine+renal+tissue.">Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue.</a> Arch Pathol Lab Med. 135 (10), 1335-1342 (2011).</li><li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Society+for+Immunotherapy+of+Cancer+statement+on+best+practices+for+multiplex+immunohistochemistry+(IHC)+and+immunofluorescence+(IF)+staining+and+validation.">The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation.</a> J Immunother Cancer. 8 (1), 000155 (2020).</li><li>Clarke, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+automated+technology+for+multiplex+biomarker+imaging+and+application+to+breast+cancer.">A novel, automated technology for multiplex biomarker imaging and application to breast cancer.</a> Histopathology. 64 (2), 242-255 (2014).</li><li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections.">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histol Histopathol. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li><li>Ahrens, M. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+pretreatment+of+growth+plate+cartilage+increases+immunofluorescence+sensitivity.">Chemical pretreatment of growth plate cartilage increases immunofluorescence sensitivity.</a> J Histochem Cytochem. 59 (4), 408-418 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+characteristics+of+autofluorescence+in+renal+tissue+and+methods+for+reducing+fluorescence+background+in+confocal+laser+scanning+microscopy.">Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy.</a> J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).</li></ol>

Описан процесс мультиплексного циклического флуоресцентного иммуногистохимического окрашивания. Первичный выбор антител является решающим аспектом флуоресцентного иммуногистохимического анализа, и моноклональные антитела рекомендуются для лучшей специфичности и воспроизводимо...

Метастазы в головной мозг (БМ) представляют собой наиболее распространенные опухоли центральной нервной системы (ЦНС), встречающиеся почти в половине случаев немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) с неблагоприятным прогнозом1. По оценкам, 10–20% пациентов с НМРЛ уже имеют БМ на момент постановки первоначального диагноза, и примерно у 40% пациентов с НМРЛ БМ развивается в течение курса лечения2. Микроокружение опухоли (ТМЭ) тесно связано с возникновением НМРЛ и БМ, включая различные компоненты, такие как кровеносные сосуды, фибробласты, макрофаги, внеклеточный матрикс (ВКМ), лимфоидные иммунные клетки, иммунные клетки костного мозга и сигнальные молекулы 3,4. Иммунные клетки микроокружения играют решающую роль во влиянии на рост и развитие раковых клеток. Метастазы в головном мозге представляют собой многочисленные потенциальные мишени для лечения, характеризующиеся сложным иммунологическим микроокружением и сигнальными процессами. Например, ингибиторы PD-1 показали клиническую эффективность у пациентов с метастазами рака легких в головной мозг (ЛКМ) в качестве ингибитора контрольных точек иммунного ответа (ИКТИ). Тем не менее, частота ответов на терапию PD-1 варьируется между первичным НМРЛ и LCBM5, что позволяет предположить, что опухолевое иммунное микроокружение действует как важнейший регулятор ICI.
Иммуногистохимия (ИГХ) является бесценным инструментом в области биологии, фундаментальной медицины и патологии6. Этот метод детекции визуализирует экспрессию антигена через взаимодействие антиген-антитело на предметном стеклеткани 7. ВПХ используется для диагностики прогностических маркеров, оценки прогностических маркеров, назначения таргетной терапии и изучения биологических функций опухолевых клеток8. Однако традиционный метод ВПХ может обнаружить только один биомаркер за раз. Чтобы устранить это ограничение, инновация иммуногистохимической технологии привела к разработке мультиплексной флуоресцентной иммуногистохимии (mfIHC), которая позволяет одновременно идентифицировать несколько белковых маркеров на одном и том же предметном стекле ткани, как в светлом, так и во флуоресцентном поле9. Это достижение обеспечивает точный анализ клеточного состава и молекулярных взаимодействий между стромальными клетками, иммунными клетками и раковыми клетками в пределах TME.
В данном исследовании представлен протокол мультиплексной циклической иммуногистохимии для анализа пространственного распределения иммунных клеток. Для инкубации одновременно выбираются два первичных антитела разных видов, таких как кролик и крыса, за которыми следуют флуоресцентно меченные вторичные антитела. Забор антигена проводится после каждого раунда реакции антиген-антитело. Аутофлуоресценция блокируется, и для окрашивания ядер используется 4', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). Панель включает последовательное определение CD3, CD8, CD20 и КФК, клетки классифицируются по маркерам: опухолевые клетки (CK+), зрелые Т-клетки (CD3+), цитотоксические Т-клетки (CD3+CD8+), В-клетки (CD20+)10,11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.15 mol/L KmnO4</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co. Ltd.</td>
			<td>MST-8005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x sodium citrate&#160;</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>MVS-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% hydrogen peroxide</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>SP KIT-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Pannoramic MIDI</td>
			<td>3D histech Ltd</td>
			<td>Pannoramic MIDI 1.18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond primary antibody diluent</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>AR9352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>kit-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#160;kit-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>RMA-0514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co. Ltd.</td>
			<td>MAB-0671,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>sig-ma</td>
			<td>D8417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histocore Multicut</td>
			<td>lecia</td>
			<td>2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS(powder)</td>
			<td>Maixin Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>PBS-0061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide viwer&#160;</td>
			<td>3D histech Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD</td>
			<td>10023418</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplex cyclic fluorescent immunohistochemistry

Микроокружение опухоли включает в себя взаимодействие между клетками хозяина, опухолевыми клетками, иммунными клетками, стромальными клетками и сосудистой сетью. Характеристика и пространственная организация субпопуляций иммунных клеток и белков-мишеней имеют решающее значение для прогностических и терапевтических целей. Это привело к разработке мультиплексных иммуногистохимических методов окрашивания. Мультиплексная флуоресцентная иммуногистохимия позволяет одновременно обнаруживать несколько маркеров, способствуя всестороннему пониманию функции клеток и межклеточных взаимодействий. В данной работе описывается рабочий процесс мультиплексного циклического флуоресцентного иммуногистохимического анализа и его применение в количественном анализе субпопуляций лимфоцитов. Мультиплексное циклическое флуоресцентное иммуногистохимическое окрашивание проходит те же этапы и реагенты, что и стандартная иммуногистохимия, включая извлечение антигена, циклическую инкубацию антител и окрашивание на предметном стекле ткани, закрепленном формалином и парафином (FFPE). Во время реакции антиген-антитело готовится смесь антител разных видов. Такие условия, как время извлечения антигена и концентрация антител, оптимизируются и проверяются для увеличения отношения сигнал/шум. Этот метод воспроизводим и служит ценным инструментом для исследований в области иммунотерапии и клинического применения.

Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry

Представлен протокол циклической детекции антигена с использованием 5-цветной мультиплексной флуоресценции на одном предметном стекле. Благодаря оптимизации анализа мы обеспечиваем инкубацию двух антител разных видов (рис. 1). К необходимым приспособлениям для провед...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Efficient Detection of Immune Cell-Infiltration in Cancer Tissues Using Fluorescent Immunohistochemistry at JoVE.com

Author Spotlight: Efficient Detection of Immune Cell-Infiltration in Cancer Tissues Using Fluorescent Immunohistochemistry

Мультиплексная циклическая иммуногистохимия позволяет in situ обнаруживать несколько маркеров одновременно с помощью повторной инкубации антиген-антитело, сканирования изображений, выравнивания и интеграции изображений. Здесь мы представляем операционный протокол идентификации субстратов иммунных клеток с помощью этой технологии в образцах рака легких и парных метастазов в головном мозге.

Мультиплексная циклическая флуоресцентная иммуногистохимия

The tumor microenvironment involves interactions between host cells, tumor cells, immune cells, stromal cells, and vasculature. Characterizing and ...

Задача иммуногистохимии состоит в том, чтобы выбрать виды первичных и вторичных моноклональных антител, чтобы избежать перекрестной реактивности и получить лучшую специфичность и повторяемость. Решение о половой принадлежности необходимо для оптимизации коэффициента разведения антител. Между тем, еще одной проблемой является согласование локализации и подструктур.Использование этого протокола соответствует технической эволюции распределения трех лимфоцитарных субпопуляций, таких как КТ три, положительная КТ 3, КТ 8 положительная и КТ 20 положительная, на основе количества клеток и экспрессии белка в консервативных тканях, также можно наблюдать уровень инфильтрации. В нашем протоколе параметр Антитела и вторичные антитела к фтору получены из разных видов в смеси iso, что делает нас эффективными. Этот показатель также показывает специфическую меру между антителом и антигеном.