Vi anerkjenner Jiří Macas (Biology Centre CAS, České Budějovice, Tsjekkia) for å gi den agrobakterielle stammen. Core Facility Plants Sciences av CEITEC MU er anerkjent for sin tekniske støtte. Dette arbeidet ble støttet av departementet for utdanning, ungdom og idrett i Tsjekkia med Det europeiske regionale utviklingsfondets prosjekt "SINGING PLANT" (nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) og INTER-COST-prosjektet LTC20004.

Agrobacterium-mediert hårete rotinduksjon og regenerering i planter

<ol>
	<li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-DNA+binary+vectors+and+systems.">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).</li><li>Christey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Ri-mediated+transformation+for+production+of+transgenic+plants.">Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 37 (6), 687-700 (2001).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-Mediated+Plant+Transformation:+the+Biology+behind+the+&#8220;Gene-Jockeying&#8221;+Tool.">Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the &#8220;Gene-Jockeying&#8221; Tool.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (1), 16-37 (2003).</li><li>Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-M&#252;ller, J., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+transformed+roots:+from+plant+disease+to+biotechnological+resource.">Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource.</a> Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).</li><li>Gutierrez-Valdes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+cultures&#8212;a+versatile+tool+with+multiple+applications.">Hairy root cultures&#8212;a versatile tool with multiple applications.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).</li><li>Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+planta+hairy+root+transformation:+a+powerful+platform+for+functional+analysis+of+root+traits+in+Soybean.">CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in Soybean.</a> Plants. 11 (8), 1044 (2022).</li><li>Petit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+extension+of+the+opine+concept:+plasmids+in+Agrobacterium+rhizogenes+cooperate+for+opine+degradation.">Further extension of the opine concept: plasmids in Agrobacterium rhizogenes cooperate for opine degradation.</a> Molecular and General Genetics MGG. 190 (2), 204-214 (1983).</li><li>Ozyigit, I. I., Dogan, I., Tarhan, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+and+its+biotechnological+applications+in+crops.">Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and its biotechnological applications in crops.</a> Crop improvement. , (2013).</li><li>Jedli&#269;kov&#225;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+transformation+system+as+a+tool+for+CRISPR/Cas9-directed+genome+editing+in+oilseed+rape+(Brassica+napus).">Hairy root transformation system as a tool for CRISPR/Cas9-directed genome editing in oilseed rape (Brassica napus).</a> Frontiers in Plant Science. 13, 919290 (2022).</li><li>Steinbauerov&#225;, V., Neumann, P., Macas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evidence+for+splicing+of+intron-containing+transcripts+of+plant+LTR+retrotransposon+Ogre.">Experimental evidence for splicing of intron-containing transcripts of plant LTR retrotransposon Ogre.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 427-436 (2008).</li><li>Neumann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromeres+off+the+hook:+massive+changes+in+centromere+size+and+structure+following+duplication+of+CenH3+gene+in+Fabeae+species.">Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of CenH3 gene in Fabeae species.</a> Molecular Biology and Evolution. 32 (7), 1862-1879 (2015).</li><li>Montazeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+analysis+of+the+hairy+root+induction+methods+in+Hypericum+perforatum.">A Comparative analysis of the hairy root induction methods in Hypericum perforatum.</a> Journal of Plant Molecular Breeding. 7 (1), 67-76 (2019).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peat-based+hairy+root+transformation+using+Rhizobium+rhizogenes+as+a+rapid+and+efficient+tool+for+easily+exploring+potential+genes+related+to+root-knot+nematode+parasitism+and+host+response.">Peat-based hairy root transformation using Rhizobium rhizogenes as a rapid and efficient tool for easily exploring potential genes related to root-knot nematode parasitism and host response.</a> Plant Methods. 19 (1), 22 (2023).</li><li>Christey, M. C., Sinclair, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+transgenic+kale+(Brassica+oleracea+var.+acephala),+rape+(B.+napus)+and+turnip+(B.+campestris+var.+rapifera)+plants+via+Agrobacterium+rhizogenes+mediated+transformation.">Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala), rape (B. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation.</a> Plant Science. 87 (2), 161-169 (1992).</li><li>Christey, M. C., Sinclair, B. K., Braun, R. H., Wyke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+transgenic+vegetable+brassicas+(Brassica+oleracea+and+B.+campestris)+via+Ri-mediated+transformation.">Regeneration of transgenic vegetable brassicas (Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation.</a> Plant Cell Reports. 16 (9), 587-593 (1997).</li></ol>

Forfatterne erklærer at forskningen ble utført uten kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.

Vi utviklet en enkel protokoll for hårete rottransformasjon og påfølgende regenerering i B. napus og A. thaliana. Denne prosessen inkluderer injeksjonsbasert hårrotinduksjon i hypocotyl (B. napus) eller primær blomsterstandsstamme (A. thaliana). Metoden for å injisere hypocotyl med agrobakteriestamme C58C1 som bærer et Ri-plasmid var også effektiv i Fabaceae-familien 10,11, foruten medlemmene av Brassicaceae presentert i denne studien.
Et alternativ til den injeksjonsbaserte metoden er nedsenkningsbasert transformasjon bestående av nedsenking i bakteriell suspensjon, etterfulgt av samdyrking av eksplanten med agrobakterier. Fordelen med den injeksjonsbaserte metoden fremfor nedsenkingsmetoden er tiden spart ved fravær av noen protokolltrinn: eksplantepreparasjon, en test av samdyrkingstiden og kultur på et medium som inneholder hormon for induksjon av hårete røtter. Selv om begge tilnærmingene er effektive for hårete rotinduksjon, ble det observert høyere transformasjonseffektivitet hos noen arter med den injeksjonsbaserte metoden sammenlignet med explant nedsenking en12,13. Videre er injeksjonsbasert transformasjon også nyttig for å generere komposittplanter (transgene hårete røtter og skudd av vill type). Etter å ha kuttet av de opprinnelige røttene til den transformerte planten, støtter hårete røtter planteveksten, og transgenet kan studeres i sammenheng med hele planten.
Det kritiske trinnet med hårete rotinduksjon er å injisere inokulumet i hypocotyl, eller primær blomsterstandstamme. Hypokotylene til B. napus er knuselige, og kutting av hele hypokotylen kan lett skje. Det samme kan observeres med A. thaliana på grunn av blomsterstandstammens tynnhet. Hvis en sammenligning av transformasjonseffektiviteten til forskjellige arter / kultivarer er nødvendig, anbefaler vi at en person utfører alle eksperimenter for å unngå feilen forårsaket av manipulasjon og dyktighet i å injisere plantene.
Vi utviklet en effektiv protokoll for hårete rotregenerering i B. napus DH12075 og A. thaliana Col-0. Siden regenerering er en svært variabel prosess, kan noen protokollendringer brukes på en art eller kultivar av valg. For eksempel kan de hårete rotavledede skuddene fremkalles av et annet auxin/cytokinin-forhold (1:1) i B. oleracea14. Alternativt kan cytokinin tidiazuron brukes i stedet for BAP, slik som for B. campestris hårete røtter15.
Flere innsettinger av Ri-plasmid T-DNA i plantegenomet representerer en potensiell begrensning av det hårete rottransformasjons- og regenereringssystemet. I slike tilfeller avdekkes ingen planter uten TL/TR fra Ri-plasmidet etter en segregeringsanalyse av T1-frøplanter. Derfor anbefaler vi å generere flere uavhengige hårete rotlinjer for hvert transgen.
Hårete rotkulturer er et ekstremt kraftig verktøy for genfunksjonelle studier, hovedsakelig på grunn av deres raske etablering og billig vedlikehold (ingen hormoner som trengs i dyrkingsmedier). Denne protokollen dekker metodene for hårete rotinduksjon og regenerering i B. napus og A. thaliana, som kan brukes til å studere transgenet av interesse direkte i hårete rotkulturer, i sammenheng med hele planten ved hjelp av sammensatte planter, eller etter regenerering av transgene planter.

Plantetransformasjon er flaskehalsen i enhver genetisk studie i plantebiologi. En jordbåren bakterie, Agrobacterium tumefaciens, er mye brukt som et middel for genlevering ved blomsterdukkert eller vevskultur for å generere transformanter. A. tumefaciens infiserer planter på et sårsted og forårsaker svulster på grunn av overføring og integrering av T-DNA fra et tumorinduserende (Ti) plasmid i vertsplantegenomet. Konstruerte A. tumefaciens-stammer med modifisert Ti-plasmid uten villtype T-DNA og en binær vektor med kunstig T-DNA og kloningssteder for å sette inn et gen av interesse brukes ofte som et effektivt plantetransformasjonssystem1. Imidlertid er mange modellarter og avlinger gjenstridige mot blomsterdukkert eller in vitro planteregenerering eller har lange vekstsykluser, noe som påvirker effektiviteten til dette transformasjonssystemet.
Agrobacterium rhizogenes induserer dannelsen av utilsiktede røtter, eller hårete røtter, på sårstedet etter å ha infisert en vertsplante. I likhet med A. tumefaciens overfører A. rhizogenes et T-DNA fra et rotinduserende (Ri) plasmid til vertsplantegenomet, noe som forårsaker utvikling av transgene hårete røtter. Denne prosessen styres hovedsakelig av roten onkogene loci (rol) gener 2,3. Ved å bruke agrobakteriestammer som bærer både Ri-plasmidet og en kunstig binær vektor som koder for et gen av interesse, har hårete rotkulturer blitt brukt til å produsere rekombinante proteiner, analysere funksjonen til promotorer eller gener, eller redigere genomer ved hjelp av Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs) / CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9) 4,5,6.
Vår protokoll bruker den transkonjugante stammen Ti-less A. tumefaciens C58C1 som bærer Ri-plasmidet pRiA4b7. T-DNA av Ri-plasmidet består av to regioner, høyre og venstre T-DNA (HENHOLDSVIS TR-DNA og TL-DNA), som uavhengig kan integreres i plantegenomet8. Ved å utnytte dette systemet ble den langvarige eksplanttransformasjonsprosessen i Brassica napus DH12075 cultivar optimalisert9. Protokollen beskrevet nedenfor tillater regenerering av utvalgte hårete rotlinjer og oppnå T1-planter som bærer transgenet av interesse og fri for rolgener på omtrent 1 år. Den injeksjonsbaserte hårete rottransformasjonen kan brukes i andre Brassicaceae-arter, som vist ved å transformere Arabidopsis thaliana Col-0. Mens hypocotyl brukes til å transformere B. napus, injiseres A. thaliana i den primære blomsterstandsstammen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.50 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% solution of commercial bleach&#160;</td>
			<td>SAVO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-naphthaleneacetic acid (NAA)&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td>Callus regeneration medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>108.132/108.078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M micropore tape</td>
			<td>Micropore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (BAP)&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>B0904</td>
			<td>Callus regeneration medium, Shoot elongation medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM201</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0037</td>
			<td>LB and YEB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X975.1</td>
			<td>YEB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottles</td>
			<td>DURAN</td>
			<td>L300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime sodium</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C0111</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Serva</td>
			<td>3955301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>52365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA - Titriplex III, (Ethylenendinitrilo)tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ES134-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elctroporation cuvette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophesis agar, peqGOLD universal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis chamber</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis gel reader</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electroporator GenePulser Xcell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium bromide</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser/MicroPulser electroporation cuvettes, 0.2 cm gap</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Ruler DNA ladder mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibberellic acid (GA3)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G0907</td>
			<td>Shoot elongation medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-pirerazinyl)-ethansulfonique</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1101100250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indole-3-butyric acid (IBA)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>I0902</td>
			<td>Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin monosulfate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>K0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta GA-7 Plant Culture Box w/ Lid</td>
			<td>Plant Media</td>
			<td>V8505-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES monohydrate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M1503</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (MS)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0237</td>
			<td>Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (MS) + B5 vitamins&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0231</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle Agani 26G x 1/2 - 0.45 x 13mm</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td>Callus regeneration medium, Root induction medium, Medium for germination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVP 40 (polyvinylpyrolidone Mr 40000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9003-39-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Redtaq DNA Polymerase,Taq for routine PCR with inert dye, 10X buffer included</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4309-250UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retsh mill</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Lachner</td>
			<td>30093-APO</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square Petri Dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>GOSSBP124-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Penta</td>
			<td>24970-31000</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P666.1</td>
			<td>Rotylabo syringe filters 0.22 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ticarcillin disodium</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>T0180</td>
			<td>Hairy root growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td>
			<td>Serva</td>
			<td>3719003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Milli-Q purified water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>Y1333</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hairy root transformation and regeneration in arabidopsis thaliana and brassica napus

Hårete rottransformasjon representerer et allsidig verktøy for plantebioteknologi i ulike arter. Infeksjon av en Agrobacterium-stamme som bærer et rotinduserende (Ri) plasmid induserer dannelsen av hårete røtter på sårstedet etter overføring av T-DNA fra Ri-plasmidet til plantegenomet. Protokollen beskriver i detalj prosedyren for injeksjonsbasert hårrotinduksjon i Brassica napus DH12075 og Arabidopsis thaliana Col-0. De hårete røttene kan brukes til å analysere et transgen av interesse eller behandles for generering av transgene planter. Regenereringsmedium som inneholder cytokinin 6-benzylaminopurin (5 mg/L) og auxin 1-naftaleneddiksyre (8 mg/L) fremkaller vellykket skudddannelse hos begge arter. Protokollen dekker genotyping og seleksjon av regeneranter og T1-planter for å oppnå planter som bærer et transgen av interesse og fri for T-DNA fra Ri-plasmidet. En alternativ prosess som fører til dannelsen av en sammensatt plante er også avbildet. I dette tilfellet holdes hårete røtter på skuddet (i stedet for de naturlige røttene), noe som muliggjør studier av et transgen i hårete rotkulturer i sammenheng med hele planten.

Plant transformation is the bottleneck of any genetic study in plant biology. A soil-borne bacterium, Agrobacterium tumefaciens, is widely used as a means for gene delivery by floral dip or tissue culture to generate transformants. A. tumefaciens infects plants at a wounding site and causes tumors due to the transfer and integration of T-DNA from a Tumor-inducing (Ti) plasmid into the host plant genome. Engineered A. tumefaciens strains with modified Ti plasmid without the wild-type T-DNA and a binary vector with artificial T-DNA and cloning sites for inserting a gene of interest are commonly used as an efficient plant transformation system1. However, many model species and crops are recalcitrant to floral dip or in vitro plant regeneration or have long growth cycles, impacting the efficiency of this transformation system.
Agrobacterium rhizogenes induces the formation of adventitious roots, or hairy roots, at the wounding site after infecting a host plant. Similar to A. tumefaciens, A. rhizogenes transfers a T-DNA from a Root-inducing (Ri) plasmid to the host plant genome, causing the development of transgenic hairy roots. This process is controlled mainly by the root oncogenic loci (rol) genes2,3. Using agrobacterial strains carrying both the Ri plasmid and an artificial binary vector encoding a gene of interest, hairy root cultures have been used to produce recombinant proteins, analyze the function of promoters or genes, or edit genomes using Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)4,5,6.
Our protocol uses the transconjugant strain Ti-less A. tumefaciens C58C1 carrying the Ri plasmid pRiA4b7. The T-DNA of the Ri plasmid consists of two regions, right and left T-DNA (TR-DNA and TL-DNA, respectively), that can independently integrate into the plant genome8. Exploiting this system, the lengthy explant transformation process in Brassica napus DH12075 cultivar was optimized9. The protocol detailed below allows for the regeneration of selected hairy root lines and obtaining T1 plants carrying the transgene of interest and free of rol genes in roughly 1 year. The injection-based hairy root transformation can be used in other Brassicaceae species, as shown by transforming Arabidopsis thaliana Col-0. While hypocotyl is used to transform B. napus, A. thaliana is injected into the primary inflorescence stem.

Forfatter Spotlight: Optimalisering av hårete rotbaserte transformasjonsprotokoller for økt effektivitet i Brassicaceae

Hårete rottransformasjon og regenerering i Arabidopsis thaliana og Brassica napus

Our research aimed at developing a protocol for an efficient transformation in Brassicaceae. Using a hair root-based transformation, we improved dramatically transformation efficiency in Brassica napus, which is crucial for our research. We also tested the protocol in model species Arabidopsis thaliana.We have optimized the protocol for spring cultivars DH12075 in Brassica napus. The next challenge is to optimize the protocol of transformation and regeneration of winter cultivars in Brassica napus, as well as for Brassica rapa and Brassica oleracea. Hairy roots can be readily propagated, and their rapid growth enables the prompt analysis of the gene of interest shortly after the transformation.Consequently, it becomes feasible to selectively regenerate specific hairy root lines that exhibit the desired trait. For example, a gene mutation introduced by CRISPR-Cas.

Vi har tidligere optimalisert en protokoll for injeksjonsbasert hårrotinduksjon i tre kultivarer av Brassica napus, nemlig DH12075, Topas DH4079 og Westar9. For å anvende denne transformasjonsprotokollen på modellarten A. thaliana, ble de primære blomsterstandsstammene til 1 måned gamle plantetter injisert med et agrobakterielt inokulum. Hårete røtter dukket opp på injeksjonsstedet etter 2-4 uker. Hårete røtter ble skåret ut og dyrket på det faste medium. Sammenligningen av metoden i disse to artene er vist i figur 1.
Utvalgte hårete rotlinjer ble overført til regenereringsmediet for å indusere skudddannelse. I A. thaliana ble gul calli indusert innen 14 dager i alle 10 testede hårete rotlinjer. Første skudd primordia synlig som mørkegrønne flekker dukket opp innen 3 uker etter overføring til regenereringsmediet (figur 2). Etter 4 ukers kultur dekket skuddene de hårete røttene i 9 av 10 hårete rotlinjer (90% regenereringseffektivitet). I noen tilfeller ble utilsiktede røtter fremkalt fra callus (figur 2H). En linje regenererte ikke selv etter 3 måneder på regenereringsmediet (hver 4. uke ble de hårete røttene overført til et friskt medium). Dermed ligner regenereringseffektiviteten til A. thaliana hårete røtter effektiviteten til B. napus DH120759.
Hårete rotregeneranter av B. napus og A. thaliana viser en dvergfenotype (figur 3), et typisk trekk ved de hårete rotavledede plantene2. Vi observerte også tette rotsystemer, rynkete blader og endringer i blomstringstid. Denne såkalte hårete rot (eller Ri) fenotypen er forårsaket av rolgenene fra Ri-plasmidet satt inn i plantegenomet. Innsettingen av Ri T-DNA og transgenet kodet på en binær vektor kan være uavhengig eller koblet. Dermed bidrar en segregeringsanalyse av T1-avkom skapt av selvbestøvning til å identifisere rolfrie planter som uttrykker transgenet av interesse. Genotyping av T1-plantene utføres av PCR-primere som er spesifikke for ORFene til TL og TR og transgenet av interesse. Fraværet av agrobakteriell kontaminasjon bekreftes ved fravær av PCR-produkter fra virC-primere (figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig01.jpg"> Figur 1 Sammendrag av prosedyren i A. thaliana og B. napus. Injeksjonen av Agrobacterium inoculum i hypocotyl eller primær blomsterstandstammen induserer utviklingen av hårete røtter. De hårete røttene kan erstatte de innfødte røttene for å generere en sammensatt plante som vil bli genotypet og analysert (blå piler). Kultiverte hårete røtter kan regenereres til T0-planter, forplantes i T1-planter og genotypes (grønne piler). De hårete røttene kan også subkultureres for funksjonell analyse (svart pil). Eksempler på genotypingsresultater presenteres. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig02.jpg"> Figur 2: Regenerering av hårete røtter i A. thaliana. (A) Hårete rotkultur 1 dag etter overføring til plater. (B, C) Calli utviklet seg innen 2 uker med kultur på regenereringsmedium. (D, E) Skyt primordia dukket opp etter 3 uker med kultur. (G, H) Skudd dannes etter 4 uker. (H) Utilsiktede røtter utviklet fra callus. (C, F, I) Ikke-regenererende hårete rotlinje. Skalastenger representerer 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig03.jpg"> Figur 3: Representative bilder av B. napus og A. thaliana villtypeplanter og hårrotavledede regeneranter (T0-planter). Legg merke til Ri-fenotypen til regenerantene. Skalastenger representerer 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus at JoVE.com

Protokollen beskriver hårete rotinduksjon ved hjelp av Arabidopsis primære blomsterstandsstengler og Brassica napus hypocotyls. De hårete røttene kan dyrkes og brukes som eksplanter for å regenerere transgene planter.

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a ...

Vår forskning tok sikte på å utvikle en protokoll for en effektiv transformasjon i Brassicaceae. Ved hjelp av en hårrotbasert transformasjon forbedret vi dramatisk transformasjonseffektiviteten i Brassica napus, noe som er avgjørende for vår forskning. Vi testet også protokollen i modellarten Arabidopsis thaliana.Vi har optimalisert protokollen for vårsortene DH12075 i Brassica napus. Den neste utfordringen er å optimalisere protokollen for transformasjon og regenerering av vinterkultivarer i Brassica napus, samt for Brassica rapa og Brassica oleracea. Hårete røtter kan lett forplantes, og deres raske vekst muliggjør rask analyse av genet av interesse kort tid etter transformasjonen.Følgelig blir det mulig å selektivt regenerere spesifikke hårete rotlinjer som viser ønsket egenskap. For eksempel en genmutasjon introdusert av CRISPR-Cas.

hairy-root-transformation-regeneration-arabidopsis-thaliana-brassica

Research

JoVE Journal

Biology

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

2.0K Views.  Masaryk University. Our research aimed at developing a protocol for an efficient transformation in Brassicaceae. Using a hair root-based transformation, we improved dramatically transformation efficiency in Brassica napus, which is crucial for our research. We also tested the protocol in model species Arabidopsis thaliana.We have optimized the protocol for spring cultivars DH12075 in Brassica napus. The next challenge is to optimize the protocol of transformation and regeneration of winter cultivars in Br...

Video: Author Spotlight: Optimizing Hairy Root-Based Transformation Protocols for Enhanced Efficiency in Brassicaceae

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a Root-inducing (Ri) plasmid induces the formation of hairy roots at the wounding site after the transfer of T-DNA from the Ri plasmid into the plant genome. The protocol describes in detail the procedure of the injection-based hairy root induction in Brassica napus DH12075 and Arabidopsis thaliana Col-0. The hairy roots may be used to analyze a transgene of interest or processed for the generation of transgenic plants. Regeneration medium containing cytokinin 6-benzylaminopurine (5 mg/L) and auxin 1-naphthaleneacetic acid (8 mg/L) successfully elicits shoot formation in both species. The protocol covers the genotyping and selection of regenerants and T1 plants to obtain plants carrying a transgene of interest and free of T-DNA from the Ri plasmid. An alternative process leading to the formation of a composite plant is also depicted. In this case, hairy roots are kept on the shoot (instead of the natural roots), which enables the study of a transgene in hairy root cultures in the context of the whole plant.

The protocol describes hairy root induction using Arabidopsis primary inflorescence stems and Brassica napus hypocotyls. The hairy roots can be cultured and used as explants to regenerate transgenic plants.

Agrobacterium-Mediated Hairy Root Transformation in Brassica napus DH12075

To begin, place the seeds of Brassica napus DH12075 in micro-tubes. To degrease the seeds, add water and 0.1%detergent to the micro-tube, and shake for 60 seconds. Now rinse the seeds with water followed by 70%ethanol, each for 60 seconds.Next, place the seeds in 10%sodium hypochlorite solution and shake for 20 minutes. After removing the bleach, wash the seeds four times with sterile water for 60 seconds each. Place the seeds on a Petri dish containing the seed germination medium.Cold stratify the seeds at four degrees celsius overnight before moving the dish to a cultivation room. After five days, transfer the seedlings to a plant culture box containing a plant growth medium. Inoculate Ti less agrobacterium tumefaciens C58C1 carrying a hairy root-inducing plasmid PRIA 4B in five milliliters of LB medium.Grow the culture overnight at 28 degrees Celsius until it reaches an optical density at 600 nanometers of 0.9 to one. Transfer the bacterial inoculum into the syringe. Using a 26-gauge needle mounted on the syringe, puncture the hypocotyl of an 18-day-old seedling at about one centimeter above the growth medium.Inject approximately 50 microliters of inoculum into the wound and scratch the tissue on the surface of the hypocotyl. Return the plant to the cultivation room at 21 degrees Celsius for two to four weeks. Next, cut off the callus with emerged hairy roots from the hypocotyl.Place the callus with hairy roots on a Petri dish containing hairy-root growth medium and antibiotics to suppress agrobacterial growth. Seal the dish with gas-permeable tape before incubating it at 24 degrees Celsius. After incubation, isolate the hairy roots from the callus, and transfer the individual roots to a hairy-root growth medium.Alternatively, to generate a composite plant consisting of wild-type shoots and transgenic hairy roots, remove the native roots of the plant. Then transfer the plant with emerging hairy roots to a culture box containing plant-growth medium and antibiotics to suppress agrobacterial growth.

Agrobacterium-mediert hårete rottransformasjon i Brassica napus DH12075

Regeneration and Selection Methods for Brassica napus DH12075 Regenerants and T1 Plants

Under sterile conditions, using tweezers, transfer five to 10 hairy root lines of Brassica napus on a dish containing regeneration medium. Seal the dish with gas permeable tape and culture at 21 degrees Celsius in a long-day photoperiod. Every three to four weeks, transfer the hairy roots to a Petri dish with fresh regeneration medium.Observe the callous formation after approximately two weeks and shoot from the callous after two more weeks of callous formation. Individualize the shoots and transfer them to the plant culture box containing the shoot elongation medium. After two to three weeks, cut off the remnants of the callous from the shoot and transfer the elongated shoots to the plant culture box containing root induction medium.Now transfer the rooted plant to the soil and acclimatize it first in the phytotrons Then transfer the plant to a greenhouse for flowering. To speed up the production of T1 plants, collect siliques containing mature green seeds from the T0 regenerants. While working in a sterile flow box, surface sterilize the siliques with 70%ethanol.Place the siliques on a plate lid or a slide. Using a 24 gauge needle mounted on a one milliliter syringe, slit the siliques along the valve margins. Open the carpals and put them aside.Collect the immature seeds and transfer them to a plate containing seed germination medium. Seal the plate and place it in a cultivation room until germination. Compared to the wild-type, hairy root regenerative of B.napus displayed a dwarf phenotype with dense root systems, wrinkled leaves, and altered flowering time.

Regenererings- og seleksjonsmetoder for Brassica napus DH12075 regeneranter og T1-planter

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana Col-0

To begin, place the surface-sterilized Arabidopsis thaliana Col-0 seeds onto a plate containing seed germination medium. After two days of cold stratification, move the plate to a cultivation room set at 21 degrees Celsius with a long day photoperiod and 50%humidity. Transfer one-week old seedlings to a plant culture box with a plant growth medium.Grow the Agrobacterium tumefaciens culture in LB medium until it reaches an optical density at 600 nanometers of 0.9 to 1. Using a needle mounted on an insulin syringe, inject approximately 50 microliters of bacterial culture at the base of the primary inflorescent stem of a one-month old Arabidopsis plantlet. Scratch the tissue on the surface of the primary stem with the syringe.After two to four weeks, excise the emerging hairy roots and cultivate them on a Petri dish with the hairy root growth medium supplemented with antibiotics to suppress agrobacterial growth. Culture the hairy root at 24 degrees Celsius in the dark. After one to two weeks, individualize the hairy roots on the plate with hairy root growth medium and transfer selected hairy root lines to a fresh medium every four to five weeks.Transfer the hairy roots to a plate with a regeneration medium to induce callus formation, and culture at 21 degrees Celsius in a long day photoperiod. Once the shoots emerge from the callus, cut the shoots and transfer them to a shoot elongation medium for two to three weeks to promote growth and elongation. Then transfer the elongated shoots to the root induction medium.Finally, transfer the rooted plant to the soil to perform transgenic selection. In A.thaliana, yellow calli were induced within 14 days in all tested hairy root lines. First shoot primordia, visible as dark green spots, emerged within three weeks after transfer to the regeneration medium.After four weeks, shoots covered the hairy roots in 90%of the lines, with some cases showing adventitious root formation. However, one line did not regenerate even after three months. Compared to the wild type, hairy root regenerants of A.thaliana displayed a dwarf phenotype with dense root systems, wrinkled leaves, and altered flowering time.