Name: Author Spotlight: Advancing Large-Scale Neural Dynamics Through HD-MEA Technology
Uploaded: 2024-03-08T14:10:00
Duration: 2 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancing Large-Scale Neural Dynamics Through HD-MEA Technology at JoVE.com

Denna studie stöddes av institutionella fonder (DZNE), Helmholtz Association inom Helmholtz Validation Fund (HVF-0102) och Dresden International Graduate School for Biomedicine and Bioengineering (DIGS-BB). Vi vill också tacka plattformen för beteendemässiga djurförsök vid DZNE-Dresden (Alexander Garthe, Anne Karasinsky, Sandra Günther och Jens Bergmann) för deras stöd. Vi vill uppmärksamma att en del av figur 1 skapades med hjälp av plattformen BioRender.com.

Multimodal Large-Scale Neural Recordings and Analysis on HD-MEA 

Författarna deklarerar inga konkurrerande eller ekonomiska intressen.

Den intrikata dynamiken i spatiotemporal neuronal aktivitet, som uppstår från sammankopplade neuronala ensembler, har länge varit föremål för intriger inom neurovetenskapen. Traditionella metoder, såsom patch-clamp, standard MEA och Ca2+-avbildning, har gett värdefulla insikter om hjärnans komplexitet. De misslyckas dock ofta med att fånga den omfattande nätverksomfattande beräkningsdynamiken 21,22,23. Det tekniska protokollet för HD-MEA-plattformen, som beskrivs i denna JoVE-studie, representerar ett betydande steg framåt och erbjuder en panoramabild av neural dynamik över olika modaliteter, från cellsammansättningar till expansiva nätverk (dvs. akuta, ex-vivo mushjärnskivor och in-vitro humana iPSC-nätverk)26,29,30,32.
Akuta, ex-vivo mushjärnskivor har varit ett grundläggande verktyg i neuronal forskning, vilket underlättar undersökningar på molekylär och kretsnivå 6,7. Utmaningen med att upprätthålla vävnadens livskraft har dock varit en ihållande flaskhals. Protokollet som beskrivs i denna studie introducerar kritiska modifieringar för att optimera kvaliteten och livslängden hos dessa skivor för att utnyttja deras fördelar på HD-MEA-plattformen. Detta protokoll understryker vikten av - i) Att uppnå skivlikformighet, för vilken användningen av en vibratom är att föredra framför en vävnadshackare på grund av dess precision och minimerade vävnadsskador, trots avvägningen av längre skivningstider. ii) Säkerställa konstant karbogenering under hela processen, från extraktion till registrering, för att upprätthålla vävnadens viabilitet. iii) Reglera temperaturen och ge tillräcklig återhämtningstid före inspelning. iv) Använda ett agarosblock eller mögel för att stabilisera hjärnan, förhindra rivning och minimera limkontakt. v) Upprätthållande av optimala flödeshastigheter för karbogenerad aCSF i HD-MEA-reservoaren för att säkerställa skivans hälsa samtidigt som problem som frikoppling, brus och drift undviks (tabell 2).
För både hjärnskivor från möss och iPSC-preparat från människa är det av största vikt att förbättra kopplingen mellan elektrod och vävnad 30,46,47. Vårt protokoll understryker vikten av att använda den vidhäftningsfrämjande molekylen Poly-dl-ornitin (PDLO). Denna molekyl ökar inte bara ytan för att detektera elektriska signaler utan ökar också den elektriska ledningsförmågan46. Genom att göra det främjar det cellulär vidhäftning, tillväxt och utveckling av funktionella nätverksegenskaper. Sådan optimering spelar en avgörande roll för att förbättra effektiviteten hos HD-MEA-plattformen. Detta säkerställer i sin tur en korrekt och konsekvent analys av ex-vivo- och in-vitro-konnektomer i mikroskala och deras spatiotemporala avfyrningssekvenser. PDLO har visat sig överträffa andra substrat som polyetylenimin (PEI) och poly-l-ornitin (PLO) när det gäller att främja spontan avfyrningsaktivitet och lyhördhet för elektriska stimuli i neuronala kulturer. Dessutom har PDLO använts för ytfunktionalisering på HD-MEA och visat sig förbättra elektrod-slice-kopplingsgränssnittet och öka signal-brusförhållandet i både OB- och HC-skivor26,29. Tillägget av ett specialbyggt platinaankare förstärker ytterligare elektrod-slice-gränssnittskopplingen, vilket leder till inspelningar med ett högre signal-brusförhållande.
Användningen av HD-MEA för både ex-vivo mushjärnskivor och in vitro humana iPSC-nätverk introducerar en metod som är skicklig på att utforska omfattande, flerskalig och multimodal dynamik. Detta innovativa tillvägagångssätt medför dock stora utmaningar, särskilt inom datahantering 48,49,50,51. En enda HD-MEA-inspelning som görs med en samplingsfrekvens på 18 kHz/elektrod genererar häpnadsväckande 155 MB/s data. Datavolymen eskalerar snabbt när man tar hänsyn till flera skivor, olika farmakologiska tillstånd eller förlängda inspelningsperioder. Ett sådant inflöde av information kräver robusta lagringsinfrastrukturer och avancerade beräkningsverktyg för strömlinjeformad bearbetning. HD-MEA-plattformens förmåga att samtidigt samla in data från tusentals neuronala ensembler är både en välsignelse och ett hinder. Det ger suveräna insikter i beräkningsdynamiken för hjärnfunktioner, men det kräver också ett förfinat analytiskt ramverk. I detta JoVE-protokoll har vi gett exempel på beräkningsstrategier, inklusive storskalig händelsedetektering, klassificering, grafteori, frekvensanalys och maskininlärning. Dessa metoder understryker de intensiva ansträngningar som görs för att ta itu med utmaningarna med att analysera komplexa neurala data. Det finns dock fortfarande stort utrymme för utveckling av mer avancerade beräkningsverktyg för att analysera dessa flerdimensionella neurala datamängder. Beväpnad med lämpliga verktyg och metoder förstoras potentialen hos HD-MEA-plattformen, vilket ger djupgående insikter i hjärnans invecklade funktioner vid både friska och patologiska tillstånd.
I huvudsak erbjuder HD-MEA-plattformen, när den integreras med de detaljerade protokoll och beräkningsverktyg som diskuteras, ett transformativt tillvägagångssätt för att förstå hjärnans intrikata funktioner. Genom att fånga storskalig, flerskalig och multimodal dynamik ger den ovärderliga insikter i processer som inlärning, minne och informationsbehandling. Dessutom har dess tillämpning i in-vitro mänskliga iPSC-nätverk potential att revolutionera läkemedelsscreening och personlig medicin. Men även om denna plattform representerar ett betydande framsteg inom neurovetenskaplig forskning, är det avgörande att erkänna och ta itu med de inneboende tekniska utmaningarna. Med pågående förfining och integration av avancerade beräkningsverktyg står HD-MEA-plattformen redo att inleda en ny era av exakta diagnostiska verktyg, identifiering av specifika biomarkörer och riktade terapier för neurologiska sjukdomar.

Neuronala ensembler, ofta kallade cellsammansättningar, är centrala i neural kodning, vilket underlättar intrikata beräkningar för bearbetning av flerskalig neural information 1,2,3. Dessa ensembler ligger till grund för bildandet av expansiva neuronala nätverk och deras nyanserade mikrokretsar4. Sådana nätverk och deras oscillerande mönster driver avancerade hjärnfunktioner, inklusive perception och kognition. Även om omfattande forskning har utforskat specifika neuronala typer och synaptiska vägar, är en djupare förståelse för hur neuroner tillsammans bildar cellsammansättningar och påverkar spatiotemporal informationsbehandling över kretsar och nätverk fortfarande svårfångad5.
Akuta, ex-vivo hjärnskivor är avgörande elektrofysiologiska verktyg för att studera intakta neurala kretsar, och erbjuder en kontrollerad miljö för att undersöka oscillerande aktivitetsmönster för neural funktion, synaptisk överföring och anslutning, med implikationer i farmakologisk testning och sjukdomsmodellering 6,7,8. Detta studieprotokoll belyser två viktiga hjärnkretsar - den hippocampus-kortikala (HC) som är involverad i inlärnings- och minnesprocesser 9,10, och luktbulben (OB) som är ansvarig för luktdiskriminering 11,12,13. I dessa två regioner genereras nya funktionella neuroner kontinuerligt av vuxen neurogenes under hela livet i däggdjurshjärnor14. Båda kretsarna uppvisar flerdimensionella dynamiska neurala aktivitetsmönster och inneboende plasticitet som deltar i omkoppling av det befintliga neurala nätverket och underlättar alternativa informationsbehandlingsstrategier vid behov15,16.
Akuta, ex-vivo hjärnsnittsmodeller är oumbärliga för att fördjupa sig i hjärnans funktionalitet och förstå sjukdomsmekanismer på mikrokretsnivå. In vitro-cellkulturer som härrör från humant inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) neuronala nätverk erbjuder dock en lovande väg för translationell forskning, som sömlöst kopplar samman resultat från djurförsök med potentiell klinisk behandlingpå människor 17,18. Dessa människocentrerade in vitro-analyser fungerar som en tillförlitlig plattform för att bedöma farmakologisk toxicitet, möjliggöra exakt läkemedelsscreening och främja forskning om innovativa cellbaserade terapeutiska strategier19,20. Med tanke på den centrala rollen för iPSC:s neuronala modell har vi dedikerat den tredje modulen i denna protokollstudie för att grundligt undersöka de funktionella egenskaperna hos dess härledda nätverk och för att finjustera de associerade cellodlingsprotokollen.
Dessa elektrogena neurala moduler har ofta studerats med hjälp av tekniker som kalcium (Ca2+-avbildning), patch-clamp-inspelningar och mikroelektrodmatriser med låg densitet (LD-MEA). Medan Ca2+-avbildning erbjuder kartläggning av encellsaktivitet, är det en cellmärkningsbaserad metod som hindras av dess låga tidsupplösning och utmaningar vid långtidsinspelningar. LD-MEA saknar rumslig precision, medan patch-clamp, som är en invasiv teknik på en enda plats och mödosam, ofta ger en låg framgångsfrekvens 21,22,23. För att ta itu med dessa utmaningar och effektivt undersöka nätverksomfattande aktivitet har storskaliga samtidiga neurala inspelningar dykt upp som ett centralt tillvägagångssätt för att förstå beräkningsprinciperna för neural dynamik som ligger till grund för hjärnans komplexitet och deras konsekvenser för hälsa och sjukdom24,25.
I detta JoVE-protokoll demonstrerar vi en storskalig neural inspelningsmetod baserad på högdensitets-MEA (HD-MEA) för att fånga spatiotemporal neuronal aktivitet över olika hjärnmodaliteter, inklusive hippocampus- och luktbulbkretsar från ex-vivo mushjärna akuta skivor (Figur 1A-C) och in-vitro humana iPSC-härledda neuronala nätverk (Figur 1D-E), tidigare rapporterad av vår grupp och andra kollegor26,27,28,29,30,31,32,33,34,35. HD-MEA, som bygger på CMOS-teknik (Complementary Metal-oxide-Semiconductor), har kretsar och förstärkning på chipet, vilket möjliggör inspelningar under millisekunder över en 7 mm2 arraystorlek36. Detta icke-invasiva tillvägagångssätt fångar multi-site, etikettfria extracellulära avfyrningsmönster från tusentals neuronala ensembler samtidigt med hjälp av 4096 mikroelektroder med en hög spatiotemporal upplösning, vilket avslöjar den intrikata dynamiken hos lokala fältpotentialer (LFP) och multiunit spiking activity (MUA)26,29.
Med tanke på omfattningen av de data som genereras av denna metod är det nödvändigt med en sofistikerad analytisk ram, men den medför utmaningar37. Vi har utvecklat beräkningsverktyg som omfattar automatisk händelsedetektering, klassificering, grafteori, maskininlärning och andra avancerade tekniker (Figur 1F)26,29,38,39. Genom att integrera HD-MEA med dessa analysverktyg utformas ett holistiskt tillvägagångssätt för att undersöka den intrikata dynamiken från enskilda cellsammansättningar till bredare neurala nätverk över olika neurala modaliteter. Detta kombinerade tillvägagångssätt fördjupar vårt grepp om beräkningsdynamiken i normala hjärnfunktioner och ger insikter om anomalier som finns i patologiska tillstånd28. Dessutom kan insikter från detta tillvägagångssätt driva framsteg inom hjärninspirerad modellering, neuromorfisk databehandling och neurala inlärningsalgoritmer. I slutändan är denna metod lovande när det gäller att avslöja kärnmekanismerna bakom neurala nätverksstörningar, potentiellt identifiera biomarkörer och vägleda skapandet av exakta diagnostiska verktyg och riktade behandlingar för neurologiska tillstånd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>150 mm Glass Petri Dish</td>
			<td>generic</td>
			<td>generic</td>
			<td>Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m Sterile Filter Unit&#160;</td>
			<td>Assorted</td>
			<td>Assorted</td>
			<td>Assorted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Plastic Culture Dish</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td>Brain Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6351.5</td>
			<td>Brain Preparation Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Mold</td>
			<td>CUSTOM</td>
			<td>CUSTOM</td>
			<td>Brain Preparation Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>generic</td>
			<td>generic</td>
			<td>Brain Extraction Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia chamber</td>
			<td>generic</td>
			<td>generic</td>
			<td>Brain Extraction Workspace; Assorted Beaker, Bedding etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td>Solution Preparation Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assorted Beakers</td>
			<td>generic</td>
			<td>generic</td>
			<td>Solution Preparation Workspace; 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assorted Luers</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>45511-00</td>
			<td>Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assorted Volumetric flasks</td>
			<td>generic</td>
			<td>generic</td>
			<td>Solution Preparation Workspace; 500 mL, 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>BrainXell Commercial Supplier Protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td>BrainXell Commercial Supplier Protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Safety Cabinet with UV Lamp</td>
			<td>Assorted</td>
			<td>Assorted</td>
			<td>HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Neuronal Medium&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>05790&#160;</td>
			<td>CDI, and BrainXell Commerical Supplier Protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brainwave Software</td>
			<td>3Brain AG</td>
			<td>Version 4</td>
			<td>Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainXell&#160;Glutamatergic Neuron Assay&#160;</td>
			<td>BrainXell</td>
			<td>&#160;BX-0300&#160;</td>
			<td>BrainXell Commercial Supplier Protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>21115-100ML</td>
			<td>Solution Preparation Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen</td>
			<td>generic</td>
			<td>generic</td>
			<td>All Workspaces; 95%/5% O2 and CO2 mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Incubator&#160;</td>
			<td>Assorted</td>
			<td>Assorted</td>
			<td>Assorted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS-based HD-MEA chip</td>
			<td>3Brain AG</td>
			<td>CUSTOM</td>
			<td>Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes, 50 mL, Falcon (Centrifuge Tubes)&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>38010&#160;</td>
			<td>CDI Commerical Supplier Protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crocodile Clip Grounding Cables</td>
			<td>JWQIDI</td>
			<td>B06WGZG17W</td>
			<td>Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11052-10</td>
			<td>Brain Extraction Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>&#160;11330-032</td>
			<td>BrainXell Commercial Supplier Protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS)</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>37350&#160;</td>
			<td>CDI Commerical Supplier Protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>531 011</td>
			<td>Brain Preparation Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Brush</td>
			<td>Leonhardy</td>
			<td>773</td>
			<td>Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>VITLAB</td>
			<td>67895</td>
			<td>Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td>BrainXell Commercial Supplier Protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1413201</td>
			<td>BrainXell Commercial Supplier Protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipette</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4518</td>
			<td>Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td>Solution Preparation Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>BrainXell Commercial Supplier Protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gravity-based Perfusion System</td>
			<td>ALA</td>
			<td>VC3-8xG</td>
			<td>Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HD-MEA Recording platform</td>
			<td>3Brain AG</td>
			<td>CUSTOM</td>
			<td>Brain Slice and Human iPSC Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heater</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324C</td>
			<td>Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer or Automated Cell Counter</td>
			<td>Assorted</td>
			<td>Assorted</td>
			<td>HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypo Needles</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>641489</td>
			<td>Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell GlutaNeurons Kit, 01279&#160;</td>
			<td>CDI</td>
			<td>R1061&#160;</td>
			<td>CDI Commerical Supplier Protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>Vantage</td>
			<td>V95-304</td>
			<td>Brain Extraction Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>HDG9623</td>
			<td>Brain Extraction Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5405-250G</td>
			<td>Solution Preparation Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>L2020&#160;</td>
			<td>CDI Commerical Supplier Protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen Storage Unit&#160;</td>
			<td>Assorted</td>
			<td>Assorted</td>
			<td>HD-MEA Coating, Plating, Mainainance Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>generic</td>
			<td>generic</td>
			<td>Solution Preparation Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal Screws</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>HW-KIT2/M</td>
			<td>Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028-100ML</td>
			<td>Solution Preparation Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63138-250G</td>
			<td>Solution Preparation Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection Tool Holder&#160;</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td>Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection Tool Needle</td>
			<td>Braun&#160;</td>
			<td>9186166</td>
			<td>Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modular Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CUSTOM</td>
			<td>Brain Slice Recording Workspace; custom specifications and modifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>CDI, and BrainXell Commercial Supplier Protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S3014-1KG</td>
			<td>Solution Preparation Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S0751-100G</td>
			<td>Solution Preparation Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td>Solution Preparation Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>BrainXell Commercial Supplier Protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Cage System</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Assorted</td>
			<td>Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Table w/Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SDA7590</td>
			<td>Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDLO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P0671</td>
			<td>HD-MEA Coating, Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin, 100x&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>15140-122&#160;</td>
			<td>CDI Commerical Supplier Protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>TipONE</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td>Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors&#160;</td>
			<td>Assorted</td>
			<td>Assorted</td>
			<td>Assorted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Anchor</td>
			<td>CUSTOM</td>
			<td>CUSTOM</td>
			<td>Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing</td>
			<td>Assorted</td>
			<td>Assorted</td>
			<td>Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump</td>
			<td>MasterFlex</td>
			<td>78018-22</td>
			<td>Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor Blade</td>
			<td>Apollo</td>
			<td>10179960</td>
			<td>Brain Preparation Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reference Electrode Cell Culture Cap</td>
			<td>CUSTOM</td>
			<td>CUSTOM</td>
			<td>Human iPSC Recording Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Pipette Bulb</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>292000205</td>
			<td>Brain Slice Preparation Workspace, Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes, 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL</td>
			<td>Assorted</td>
			<td>Assorted</td>
			<td>Assorted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Recovery Chamber</td>
			<td>CUSTOM</td>
			<td>CUSTOM</td>
			<td>Brain Slice Recovery Workspace; Custom designed 3D Printer Design, available upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>ISOLAB</td>
			<td>047.06.150</td>
			<td>Brain Preparation Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>84100-1KG</td>
			<td>Solution Preparation Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>UHU</td>
			<td>358221</td>
			<td>Brain Slice Preparation Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Peters Instruments</td>
			<td>BC 344</td>
			<td>Brain Extraction Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Centrifuge&#160;</td>
			<td>Assorted</td>
			<td>Assorted</td>
			<td>Assorted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#946;1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-21C</td>
			<td>BrainXell Commercial Supplier Protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Paper</td>
			<td>generic</td>
			<td>generic</td>
			<td>Brain Extraction Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>07050&#160;</td>
			<td>CDI Commerical Supplier Protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CUSTOM</td>
			<td>Imaging Workspace; Custom specifications and modifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacusip</td>
			<td>Integra</td>
			<td>159010</td>
			<td>Brain Slice Recording Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200s</td>
			<td>Brain Slice Preparation Workspace; Includes: Specimen plate, buffer tray, ice tray, specimen plate holding tool, vibratome blade adjusting tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Blade</td>
			<td>Personna</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Brain Slice Preparation Workspace</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Lauda</td>
			<td>L000595</td>
			<td>Brain Slice Recovery Workspace</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recording and analyzing multimodal large-scale neuronal ensemble dynamics on cmos-integrated high-density microelectrode array

Storskaliga neuronala nätverk och deras komplexa distribuerade mikrokretsar är viktiga för att generera perception, kognition och beteende som uppstår från mönster av spatiotemporal neuronal aktivitet. Dessa dynamiska mönster som uppstår från funktionella grupper av sammankopplade neuronala ensembler underlättar exakta beräkningar för bearbetning och kodning av neural information i flera skalor, vilket driver högre hjärnfunktioner. För att undersöka beräkningsprinciperna för neural dynamik som ligger till grund för denna komplexitet och undersöka den flerskaliga effekten av biologiska processer i hälsa och sjukdom, har storskaliga samtidiga inspelningar blivit avgörande. Här används en mikroelektrod med hög densitet (HD-MEA) för att studera två modaliteter av neural dynamik - hippocampus- och luktbulbkretsar från ex-vivo mushjärnskivor och neuronala nätverk från in-vitro cellkulturer av humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). HD-MEA-plattformen, med 4096 mikroelektroder, möjliggör icke-invasiva, etikettfria inspelningar av extracellulära avfyrningsmönster från tusentals neuronala ensembler samtidigt med hög spatiotemporal upplösning. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att karakterisera flera elektrofysiologiska nätverksomfattande egenskaper, inklusive spikaktivitetsmönster med en eller flera enheter och lokala fältpotentialsvängningar. För att granska dessa flerdimensionella neurala data har vi utvecklat flera beräkningsverktyg som innehåller maskininlärningsalgoritmer, automatisk händelsedetektering och klassificering, grafteori och andra avancerade analyser. Genom att komplettera dessa beräkningspipelines med denna plattform tillhandahåller vi en metodik för att studera den stora, flerskaliga och multimodala dynamiken från cellsammansättningar till nätverk. Detta kan potentiellt öka vår förståelse för komplexa hjärnfunktioner och kognitiva processer i hälsa och sjukdom. Engagemang för öppen vetenskap och insikter i storskalig beräkningsneural dynamik kan förbättra hjärninspirerad modellering, neuromorfisk databehandling och neurala inlärningsalgoritmer. Att förstå de underliggande mekanismerna för försämrade storskaliga neurala beräkningar och deras sammankopplade mikrokretsdynamik kan dessutom leda till identifiering av specifika biomarkörer, vilket banar väg för mer exakta diagnostiska verktyg och riktade terapier för neurologiska sjukdomar.

Recording and Analyzing Multimodal Large-Scale Neuronal Ensemble Dynamics on CMOS-Integrated High-Density Microelectrode Array

Multimodell spatiotemporal kartläggning och extraktion av oscillerande avfyrningsegenskaper För att kvantifiera nätverksomfattande LFP- och spikhändelser som uppstod från dynamiska neuronala ensembler, undersökte vi synkrona storskaliga avfyrningsmönster i HC- och OB-kretsar och mänskliga iPSC-nätverk. Inspelade hjärnskivkretsar från steg 3.2 och inspelade iPSC-nätverk från steg 3.3 analyserades enligt steg 4.1-4.2 i protokollet. Först utfördes händelsedetektering och denoising för alla inspelade datauppsättningar och regionalt upplösta enligt kretsspecifikationer. Därefter plottades topografisk pseudo-färgrumslig kartläggning av medelvärden för storskaliga LFP- och spikavfyrningsmönster, rastergram för detekterade händelser och representativa 5-s-spår av filtrerade vågformer (figur 3 A-I). Topografisk pseudofärgkartläggning av storskaliga LFP- och spikavfyrningshastighetsmönster överlagrades på respektive mikroskoptagna optiska bilder av HC (Figur 3A), OB (Figur 3B) och humant iPSC-neuronalt nätverk (Figur 3C). Detta gör det möjligt att undersöka enskilda kretsar och nätverksbaserade oscillerande mönster och svar. HC- och OB-rastergram innehåller detekterade LFP-händelseantal sorterade över DG-, Hilus-, CA3-, CA1-, EC- och PC-lagren i HC-kretsen och ONL-, OCx-, GL-, PL- och GCL-skikten i OB-nätverket över ett 60-sekunders tidsintervall (figur 3D,E). Det mänskliga iPSC-rastergrammet visar synkront detekterade spikhändelser i det sammankopplade odlade nätverket över ett 20 sekunders tidsintervall (figur 3G). Därefter visar 5s representativa händelsespår från storskaliga HD-MEA-inspelningsplatser ett intervall av registrerade oscillerande frekvenser i HC (dvs. vald elektrod i CA3) (figur 3G) och OB (dvs. vald elektrod i GL) (figur 3H) kretsar och multiunit spike bursting-aktivitet i det mänskliga iPSC-nätverket från fyra utvalda aktiva elektroder i arrayen (figur 3I). Dessa exemplifierande signaler visar biosignalsignaturer, inklusive lågfrekventa LFP-svängningar (1-100 Hz) med bandpassfiltrerade δ, θ, β och γ frekvensband; skarpa vågkrusningar (SWR) (140-220 Hz); och högfrekvent singel och MUA (300-3500 Hz). Slutligen användes analys av effektspektral densitet (PSD) för att samtidigt kvantifiera ett specifikt oscillerande bands effektstorlek i den sammankopplade HC- och OB-kretsen som registrerats från HD-MEA (figur 3J,K).
Multimodal nätverksomfattande funktionell konnektivitet För att härleda den storskaliga konnektiviteten hos flerskiktade neurala nätverk från samtidiga avfyrningsmönster av samtidigt aktiva neuronala ensembler, beräknades korskovariansen mellan par av aktiva elektroder i detekterade händelser enligt steg 4.2.6 i protokollet. Här sorterades korrelationskoefficienten baserat på lager i HC- och OB-kretsen eller osorterad i iPSC-nätverket och lagrades sedan i en symmetrisk matris. Funktionella konnektomer av HC- och OB-kretsar genererades genom att tillämpa multivariat Granger-kausalitet och riktad överföringsfunktion (DTF) för att kvantifiera påverkan av en tidsserie på en annan och bedöma det riktade informationsflödet inom de korrelerade länkarna i de distinkta nätverken. Connectome-mappning av HC (Figur 4A) och OB (Figur 4B) och nätverksvisualisering utfördes med Gephi-programmet 9.2 version (https://gephi.org). Liknande parameterbegränsningar placerades på de funktionella länkarna för att jämföra HC- och OB-hjärnsegmentkretsarna och illustrerade 100 s av den funktionella konnektiviteten för detekterade LFP-händelser. Noder skalas efter gradstyrka med nodfärg som indikerar lager och länkfärg som identifierar anslutningarna inom och mellan lager. Funktionella konnektomer av mänskliga iPSC-nätverk genererades genom att tillämpa spatial-temporala filter (STF) och avståndsberoende latenströsklar (DdLT) för att förbättra urvalet av signifikanta länkar och förfina identifieringen av meningsfulla anslutningar genom att tillämpa filtrerad och normaliserad korskorrelationshistogramanalys (FNCCH). Connectome-mappning av mänskliga iPSC-nätverk på hela HD-MEA-chipvisualiseringen (figur 4C) utförd med Gephi. Nodfärg indikerar excitatorisk eller hämmande ingång, och länkfärg identifierar anslutningar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66473/66473fig01v2.jpg"> Figur 1: Översikt över den experimentella och beräkningsmässiga plattformen för storskalig HD-MEA. (A) Isometrisk schematisk representation av våra multimodala biohybrida neuroelektroniska plattformar realiserade med CMOS-baserad HD-MEA för att fånga neural dynamik från HC, OB och humana iPSC neuronala kretsar och nätverk. (B) Schematiskt arbetsflöde för skivning av mushjärnor och dess arbetslandskap för att erhålla HC- och OB-skivor. (C) Topografiska representationer av de storskaliga avfyrningsmönstren som registrerats samtidigt från hela HC- och OB-skivorna överlagrade med de extraherade extracellulära vågformerna till de optiska bilderna. (D) Schematisk representation av iPSC neuronala nätverk erhållet från människor. (E) Fluorescensmikroskop som visar cellulärt c-fos och somatisk/dendritisk MAP-2 av hela det humana neuronala nätverket på HD-MEA-chip (vänster) matchat med hela den genomsnittliga avfyrningsaktivitetskartan (höger). (F) Beräkningsramverk inklusive avancerad dataanalys, konnektivitetskartläggning och AI-maskininlärningsverktyg för att analysera flerdimensionella neurala data som erhållits från storskaliga inspelningar på HD-MEA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/66473fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66473/66473fig02v2.jpg"> Figur 2: Layouter för ex-vivo hjärnskivor och in vitro mänskliga iPSC-odlingsberedning och inspelningsarbetsytor. A) Schematiskt arbetsflöde som illustrerar inställningarna för beredning av HC- och OB-skivor, med nödvändiga verktyg och utrustning i varje arbetsyta. B) Schematisk framställning av iPSC-odling på människa, inklusive nödvändiga verktyg och anordningar. En fullständig materialförteckning finns i steg 1.2.2, 2.1, 2.2, 3.1.1, 3.3 och i materialförteckningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/66473fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66473/66473fig03v2.jpg"> Figur 3: Kartläggning och extrahering av spatiotemporala mönster av nätverksdynamik. (A-C) Genomsnittliga LFP- och spikhastighetskartor, beräknade över femminutersinspelningar, överlagrade på mikroskopets ljusbild. (D-F) Rasterdiagram som visar upptäckta, nedtonade LFP-händelser i ett 60-sekunders datadelurval och toppar i ett 20-sekunders datadelurval. (G-I) Representativ extrahering av vågformsspår från ett 5-sekunders segment av delprovet av rasterdiagramdata (markerat rött i rasterdiagrammet), visas som råa LFP-oscillerande band (1–100 Hz). δ (1–4 Hz), θ (5–12 Hz), β (13–35 Hz) och γ (35–100 Hz) frekvensband. SWR (140-220 Hz); och högfrekvent enkel- och MUA-spikning (300-3500 Hz). (J,K) Effektspektrala densitetskartor för snabba och långsamma oscillerande LFP:er (1-100 Hz) och SWR (140-220 Hz). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/66473fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66473/66473fig04v2.jpg"> Figur 4: Organisering av multimodala nätverksomfattande funktionella konnektomer. (A-C) Gephi-kartor som illustrerar nodal funktionell anslutning, där noder motsvarar en av exempelförklaringarna för färgfältet (nedan), medan länkarna (eller kanterna) är skuggade för att matcha de anslutande noderna. Exempelförklaringar för (A) HC-, (B) OB och (C) iPSC-lager visas på en 64 x 64-matris. HC- och OB-lager ritas över ett tidsintervall på 100 sekunder för att effektivt minska antalet synliga noder och länkar i visualiseringssyfte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/66473fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Tabell 1: Lösningar för beredning av hjärnskivor och media för iPSC-neuronala kulturer. A) Lösning för styckning med hög sackaroshalt för ex-vivo beredning av hjärnskivor. B) Lösning för registrering av aCSF för beredning och registrering av hjärnskivor ex vivo. (C-D) Human neuronal iPSC Media Protocol, där (C) är BrainPhys kompletta media som används för cellupptining, HD-MEA-chipbeläggning och odlat HD-MEA-underhåll, och (D) dotting-mediet som används för HD-MEA-cellplätering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/Table%201.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>
Tabell 2: Felsökning av vanliga problem med HD-MEA-inspelning. En lista över vanliga problem, deras potentiella orsaker och felsökningslösningar relaterade till HD-MEA-chips, inspelningsplattform, systembrus och programvara. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66473/Table%202.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancing Large-Scale Neural Dynamics Through HD-MEA Technology at JoVE.com

Author Spotlight: Advancing Large-Scale Neural Dynamics Through HD-MEA Technology

Här använder vi HD-MEA för att fördjupa oss i beräkningsdynamik för storskaliga neuronala ensembler, särskilt i hippocampus, luktbulbkretsar och mänskliga neuronala nätverk. Att fånga spatiotemporal aktivitet, i kombination med beräkningsverktyg, ger insikter i neuronal ensemblekomplexitet. Metoden ökar förståelsen för hjärnans funktioner och kan potentiellt identifiera biomarkörer och behandlingar för neurologiska sjukdomar.

Inspelning och analys av multimodal storskalig neuronal ensembledynamik på CMOS-integrerad mikroelektrod med hög densitet

Large-scale neuronal networks and their complex distributed microcircuits are essential to generate perception, cognition, and behavior that emerge from ...