Name: Auteur in de schijnwerpers: Kiemvrije zebravissen tot stand brengen voor microbiota-gastheerrelatiestudies
Uploaded: 2024-04-12T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Establishing Germ-Free Zebrafish for Microbiota-Host Relationship Studies at JoVE.com

We danken oprecht de steun van het Chongqing Medical University Talent Project (nr. R4014 tot DSP en R4020 tot PPJ), de National Natural Science Foundation of China (NSFC, nr. 32200386 tot PPJ), de Chongqing Postdoctoral Innovation Mentor Studio (X7928 DSP) en het programma van het China-Sri Lanka Joint Center for Water Technology Research and Demonstration door de Chinese Academie van Wetenschappen (CAS) / China-Sri Lanka Joint Center for Education and Research door CAS.

De visexperimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Animal Care and Use Committee van Chongqing en het Institutional Animal Care and Use Committee van de Chongqing Medical University, China, evenals de normen voor proefdieren uitgegeven door het State Bureau of Quality and Technical Supervision (goedkeurings-ID: GB14922-2001 tot GBT14927-2001). Zebravissen (Danio rerio, wildtype, AB-stam) waren afkomstig van het Instituut voor Hydrobiologie, Chinese Academie van Wetenschappen, en w...

Optimalisatie van GF-zebravismodellen: generatie, onderhoud en microbiële studies

Kritieke stappen binnen de protocollen van GF-vis en GF-voedselbereiding Tijdens het genereren van GF-vismodellen waren verschillende kritieke stappen betrokken, waaronder de voorbereiding van steriel materiaal, sterilisatie van embryo's, dagelijkse vernieuwing van GZM, het verzamelen van verschillende monsters en het steriele onderzoek van elk monster met behulp van meerdere methoden. Onder deze stappen is de eerste behandeling van embryo's fundamenteel en doorslaggevend voor het succes van GF-modell...

De microbiota (d.w.z. Archaea, bacteriën, Eukarya en virussen) spelen een cruciale rol bij het handhaven van de gezondheid van de gastheer en dragen bij aan de ontwikkeling van verschillende ziekten door fysiologische en pathologische processen te beïnvloeden door middel van symbiotische interacties binnen de darmbarrière, het epitheeloppervlak en de mucinefuncties bij individuen 1,2,3. De samenstelling van de microbiota in verschillende levensfasen, van kindertijd tot jeugd, volwassenheid en veroudering, evenals de aanwezigheid ervan op verschillende locaties zoals neusgaten, mond-, huid- en darmlocaties, wordt dynamisch gevormd door diverse habitats en omgevingen4. De darmmicrobiota in organismen is betrokken bij de opname van voedingsstoffen, immuunrespons, invasie van ziekteverwekkers, metabole regulatie, enz. 5,6. Studies bij patiënten hebben aangetoond dat verstoringen in de darmmicrobiota verband houden met obesitas bij de mens, slaapstoornissen, depressie, inflammatoire darmaandoeningen (IBD), neurodegeneratieve ziekten (Parkinson, Alzheimer), veroudering en verschillende vormen van kanker 7,8,9. Bovendien omvatten interactieve routes tussen darmmicrobiota en gastheren ontstekingsfactoren, neurotransmitters, metabolieten, darmbarrière en oxidatieve stress, zoals waargenomen in eerder onderzoek met behulp van muizen- en vismodellen10,11.
Onlangs zijn meerdere bacteriegerelateerde benaderingen of therapieën, waaronder mogelijke probiotica en fecale microbiota-transplantatie (FMT), onderzocht voor deze aandoeningen in klinische en diermodellen. Deze verkenningen zijn gebaseerd op ontdekkingen met betrekking tot de microbiota-darm-hersenen/lever/nier-as, van microbiota afgeleide producten en veranderde receptoractiviteit 12,13. De ontwikkeling, verschillende functies en mechanismen van het microbiota-gastheersysteem worden echter nog steeds onvolledig begrepen en geïdentificeerd vanwege de complexiteit van de microbiële gemeenschap en de uitdaging om krachtige mensachtige ziektemodellen te genereren.
Om deze problemen aan te pakken, werden in het midden van de19e eeuw dringend kiemvrije (GF) diermodellen voorgesteld die voornamelijk in de 20eeeuw werden ontwikkeld. Latere verfijningen, waaronder met antibiotica behandelde en gnotobiotische modellen, samen met vooruitgang in microbiële detectie- en observatietechnologieën, perfectioneerden deze modellen verder 14,15,16. GF-dieren, gecreëerd door hun eigen achtergrond uit te wissen en omgevingsmicroben te vermijden, bieden een uitstekende strategie voor het verkennen van de interacties tussen micro-organismen en hun gastheren17. Door de toepassing van diermodellen en verfijnde protocollen hebben onderzoekers met succes vergelijkbare microbiële samenstellingen gerepliceerd die bij patiënten in GF-muizen en vissen worden aangetroffen. Bovendien bieden andere GF-diermodellen, zoals honden, kippen en varkens, diverse opties als proefpersonen 18,19,20,21. Deze aanpak heeft onderzoek mogelijk gemaakt naar de mogelijke therapeutische effecten van commensale microbiomen op verschillende ziekten, waaronder kankerimmunotherapie bij mensen16,18. GF-modellen bieden nauwkeuriger inzicht in de kenmerken en mechanismen van specifieke bacteriële kolonisatie, migratie, vermenigvuldiging en interactie binnen gastheren. Dit biedt cruciale nieuwe inzichten in het voorkomen en de ontwikkeling van microbiota-gerelateerde ziekten 22,23. De geschiedenis van het vaststellen en toepassen van GF-zebravissen in microbieel onderzoek is geëvolueerd van de rapporten van Rawls et al. in 2004 en Bates et al. in 2006 tot het protocol van Melancon et al. in 2017 16,24,25. De haalbaarheid van volwassen of fokkende GF-modellen is echter nog steeds een langdurig proces, dat gepaard gaat met een variabele levensduur, slagingspercentages en gezondheidsuitdagingen.
Van de verschillende diermodellen onderscheidt de zebravis (Danio rerio) zich als een cruciaal hulpmiddel voor zowel fundamenteel als biomedisch onderzoek vanwege de voordelige gelijkenis met menselijke organen en genomica, de korte ontwikkelingscyclus, de hoge vruchtbaarheid en transparante embryo's19,26. Zebravissen, die dienen als betrouwbare menselijke ziektemodellen, bieden een visuele weergave van fysiologische en pathologische processen in vivo en geven inzicht in de aantrekkelijke kenmerken van gastheer-microbe-interacties. Met name zebravissen vertonen verschillende cellijnen, waardoor beeldvorming van darmfysiologie, microbiële dynamiek, geslachtsklieren en reproductieve ontwikkeling, rijping van het immuunsysteem van de gastheer, gedrag en metabolisme mogelijkis. Zebravisembryo's ontwikkelen zich in beschermende chorionen tot ze uitkomen en worden 3 dagen na de bevruchting (dpf) larven. Ze jagen actief op voedsel bij 5 dpf en bereiken ongeveer 3 maanden na de bevruchting (mpf) geslachtsrijpheid28. De eerste succesvolle kiemvrije (GF) zebravis, gerapporteerd door Rawls et al.24, toonde aan dat larven die na dooierabsorptie met geautoclaveerd voer werden gevoed, weefselnecrose vertoonden vanaf 8 dpf en totale dood bij 20 dpf. Dit gaf de effecten van voeding aan of het belang van het overwegen van exogene nutriëntenvoorziening in experimenten met langdurige (>7 dpf) GF-vissen29. Latere studies verbeterden het generatieprotocol van GF-vissen, met behulp van steriel voedsel en methoden die in verschillende vismodellen warengeperfectioneerd16.
Het meeste onderzoek naar GF-zebravismodellen is echter gericht op vroege levensfasen, waarbij bacteriële infectie optreedt bij 5 dpf gedurende 24 uur tot 48 uur, met monsters verzameld vóór 7 dpf aan het einde van de experimenten 25,30,31. Het wordt algemeen erkend dat de microbiota in organismen, waaronder mensen en zebravissen, aan het begin van het leven wordt gekoloniseerd en gevormd tijdens groei en ontwikkeling. De samenstelling blijft stabiel in de volwassen stadia, waarbij de rol van de microbiota in de gastheer gedurende het hele leven cruciaal is, vooral bij veroudering, neurodegeneratieve, metabole obesitas en aspecten van darmziekten. Perspectieven van GF-dieren met een langere overleving kunnen dus inzicht geven in de mechanismen van microbiële rollen in de ontwikkeling en functies van gastheerorganen, rekening houdend met de onvolgroeide immuun- en voortplantingssystemen van vislarven in het vroege leven. Hoewel bacteriestammen in de darmen van zebravissen in eerdere studies zijn geïsoleerd en geïdentificeerd, wat het potentieel biedt voor het infecteren van GF-diermodellen om probiotica te selecteren of bacteriële functies in de gastheer te onderzoeken19,25, zijn het genereren en toepassen van GF-vismodellen voornamelijk beperkt tot vroege levensfasen. Deze beperking, toegeschreven aan het complexe productieproces, de hoge onderhoudskosten en de daarmee samenhangende problemen met voedsel en immuniteit, belemmert onderzoeksinspanningen die gericht zijn op het onderzoeken van de ontwikkelings- en chronische effecten van microbiota in de gastheer.
Het overlevingspercentage, het gedrag, de groei, de rijping en de algehele gezondheid van vissen, vooral in kiemvrije (GF) modellen, worden aanzienlijk beïnvloed door voedingspraktijken, waaronder de inname en absorptie van voeding tijdens de mondopen-periode van vroege larven tot juvenielen 32,33. Een van de uitdagingen bij de GF-visteelt is echter de schaarste aan geschikte steriele diëten, waardoor de effectiviteit van voedingsondersteuning voor het ondersteunen van de groei en overleving van larven wordt beperkt. Het oplossen van dit probleem is cruciaal voor het herstellen van het leven van GF-vissen, gezien hun ontwikkelingsafweermechanismen en zwakke spijsverteringsvermogen als gevolg van de afwezigheid van een darmmicrobioom. Levende artemia (Artemia sp.) komt qua voedsel naar voren als het meest geschikte dieet voor mondopen larven tot jonge vissen. Er is waargenomen dat vissen die worden gevoed met levende artemia hogere groei- en overlevingspercentages vertonen in vergelijking met vissen die worden gevoed met gekookt eigeel of ander natuurlijk en synthetisch aas34. Hoewel modellen voor het vroege leven van GF-vissen kunnen overleven met dooierondersteuning en GF-larvenmodellen kunnen worden onderhouden met steriele voeding, blijft het genereren van langetermijnmodellen van larven tot juvenielen en het bereiken van geslachtsrijpheid een uitdaging. Bovendien wordt vlokken- of poedervoer beperkt door een ongelijke voedingssamenstelling en kan het de waterkwaliteit beïnvloeden. Daarentegen heeft levende Artemia voordelen zoals overleving in zowel zout als zoet water, klein formaat geschikt voor larven tot volwassenen, gemak van batching en een hogere broedkwaliteit35. Voortbouwend op eerdere methoden 16,24,30, hebben we het complexe behandelingsproces vereenvoudigd en de dieetuitdaging aangepakt door gemakkelijk te incuberen GF levende Artemia sp. als steriel voedsel voor langere duur dan jonge GF-vissen.
Deze studie presenteert een geoptimaliseerd protocol dat (1) generatie, (2) onderhoud, (3) identificatie van steriele snelheid en (4) onderhoud en voeding omvat om de groei van kiemvrije (GF) zebravissen van embryo's tot larven en juveniele stadia te garanderen. De resultaten bieden voorlopig bewijs voor het uitkomen, de overleving, de groei en de steriliteit van GF-zebravissen, samen met essentiële indices voor GF Artemia sp. als steriel voedsel. De gedetailleerde stappen in het genereren en bereiden van steriel levend voedsel bieden cruciale technische ondersteuning voor het construeren en toepassen van GF-vismodellen op lange termijn, evenals GF Artemia sp. in onderzoek naar microbiota-gastheerinteractie. Het protocol richt zich op bacteriële isolatie, identificatie en infectie op GF-vismodellen, schetst methoden voor bacteriële fluorescentie-etikettering en observeert hun kolonisatie in visdarmen onder een microscoop. GF-vissen, gnotobiotische vissen met een bacteriële infectie of overgedragen menselijke microbiota-modellen zullen verschillende detecties ondergaan om hun functies en effecten op de immuniteit, spijsvertering, gedrag, transcriptomische regulatie en metabole aspecten van de gastheer op te helderen. Op de lange termijn kan dit protocol worden uitgebreid naar verschillende wildtype vissoorten, zoals mariene medaka, en mogelijk naar andere geselecteerde transgene zebravislijnen die gecorreleerd zijn met specifieke weefsels of ziekten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AB-GZM</td>
			<td>Amphotericin:Solarbio;&#160; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.</td>
			<td>Amphotericin:CAS:1397-89-3; 
			kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.</td>
			<td>49.6 mL GZM, 50 &#181;L amphotericin stock solution (250 &#181;g/mL), 25 &#181;L kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 &#181;L ampicillin stock solution (20 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-15-M</td>
			<td>To collect samples, and hold agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates, 24-, 48- well plates</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>11112</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aeronomas</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178499</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic work station</td>
			<td>GENE SCIENCE</td>
			<td>E200G</td>
			<td>Bacterial isolation, sterile testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis</td>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>v6.07</td>
			<td>To analysis the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API 20 E kits</td>
			<td>&#160;BioMerieux SA, France</td>
			<td>No.1005915090</td>
			<td>Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia (Brine shrimp)</td>
			<td>Shangjia Aquarium Co., Ltd.</td>
			<td>Aquamaster brand</td>
			<td>Artemia cysts, and brine shrimp eggs&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto cycle system for fish culture</td>
			<td>Ningbo Hairui Technology Co., Ltd</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Maintain the fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Zeal Way</td>
			<td>G154DWS</td>
			<td>Prepare the materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Aerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Anaerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>LongYue Co., Ltd</td>
			<td>SPX</td>
			<td>For fish and plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Haier</td>
			<td>HR40-IIA2</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood plates</td>
			<td>sheep blood:Solarbio</td>
			<td>Cat. NO. TX0030</td>
			<td>Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-Dil dyes</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Cat#C7000&#160;&#160;</td>
			<td>To label the bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature shaking incubator</td>
			<td>Peiving Co., Ltd</td>
			<td>HZQ-X100</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>Bacteria and Archaea database</td>
			<td>Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ 
			Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pasteur pipette</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>bs-xh-03l</td>
			<td>Used to change water, and transfer eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dish</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-90-D</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA kits</td>
			<td>Solaribio</td>
			<td>Cat#D1600</td>
			<td>Bacterial genomic DNA extraction kits&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric pipette</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>Levo me</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exiguobacterium</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178504</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZM</td>
			<td>Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd.</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory pure water system</td>
			<td>Hitech Co., Ltd</td>
			<td>Prima-S15</td>
			<td>Prepare the agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td>With fluorescent light to observe fish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR kits</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>Cat#ET101</td>
			<td>Taq DNA Polymerase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>sp-013-10</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine (PVP-I)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>Lot#H1217005</td>
			<td>Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timing converter</td>
			<td>PinYi Co., Ltd</td>
			<td>AL-06</td>
			<td>To regulate the light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Aerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Anaerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clean workbench</td>
			<td>Airtech</td>
			<td>SW-CJ-2FD</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure flow system for fish culture</td>
			<td>Marine Biological Equipment company</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Produce water for fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178501</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, maintenance, and identification of germ-free zebrafish models from larvae to juvenile stages

Zebravissen dienen als waardevolle modellen voor onderzoek naar groei, immuniteit en darmmicrobiota vanwege hun genomische overeenkomsten met zoogdieren, transparante embryo's ontwikkeld in een relatief schone chorionomgeving en extreem snelle ontwikkeling van larven in vergelijking met knaagdiermodellen. Kiemvrije (GF) zebravissen (Danio rerio) zijn cruciaal voor het evalueren van de toxiciteit van verontreinigende stoffen en het opstellen van mensachtige ziektemodellen die verband houden met microbiële functies. In vergelijking met conventioneel gekweekte (CR) modellen (vissen in de gewone houderij), maken GF-zebravissen een nauwkeurigere manipulatie van de gastheermicrobiota mogelijk, wat helpt bij het bepalen van het oorzakelijk verband tussen micro-organismen en gastheren. Bijgevolg spelen ze een cruciale rol bij het bevorderen van ons begrip van deze relaties. GF-zebravismodellen worden echter meestal gegenereerd en onderzocht tijdens de vroege levensfasen (van embryo's tot larven) vanwege beperkingen in de immuunfunctie en de opname van voedingsstoffen. Deze studie optimaliseert het genereren, onderhouden en identificeren van vroege GF-zebravismodellen zonder voeding en met langdurige voeding met GF-voer (zoals Artemia sp., artemia). Gedurende het hele proces werden dagelijkse bemonstering en kweek uitgevoerd en geïdentificeerd door middel van meerdere detecties, waaronder platen en 16S rRNA-sequencing. De aseptische snelheid, overleving en ontwikkelingsindexen van GF-zebravissen werden geregistreerd om de kwaliteit en kwantiteit van de gegenereerde modellen te waarborgen. Belangrijk is dat deze studie details geeft over bacteriële isolatie- en infectietechnieken voor GF-vissen, waardoor de efficiënte creatie van GF-vismodellen van larven tot juveniele stadia mogelijk wordt met GF-voedselondersteuning. Door deze procedures toe te passen in biomedisch onderzoek, kunnen wetenschappers de relaties tussen bacteriële darmfuncties en de gezondheid van de gastheer beter begrijpen.

The microbiota (i.e., Archaea, Bacteria, Eukarya, and viruses) play crucial roles in maintaining host health and contributing to the development of various diseases by influencing physiological and pathological processes through symbiotic interactions within the intestinal barrier, epithelial surface, and mucin functions in individuals1,2,3. The composition of the microbiota across different life stages, from infancy to juvenility, adulthood, and aging, as well as its presence in various locations such as nares, oral, skin, and gut sites, is dynamically shaped by diverse habitats and environments4. The intestinal microbiota in organisms is involved in nutrient absorption, immune response, pathogen invasion, metabolic regulation, etc5,6. Studies on patients have demonstrated that disruptions in gut microbiota are related to human obesity, sleep disorders, depression, inflammatory bowel disease (IBD), neurodegenerative diseases (Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s), aging, and various cancers7,8,9. Furthermore, interactive pathways between gut microbiota and hosts involve inflammatory factors, neurotransmitters, metabolites, intestinal barrier, and oxidative stress, as observed in previous research using mice and fish models10,11.
Recently, multiple bacteria-related approaches or therapies, including potential probiotics and fecal microbiota transplantation (FMT), have been explored for these disorders in clinical and animal models. These explorations are based on discoveries related to the microbiota-gut-brain/liver/kidney axis, microbiota-derived products, and altered receptor activity12,13. However, the development, various functions, and mechanisms of the microbiota-host system are still incompletely understood and identified due to the complexity of the microbial community and the challenge of generating powerful human-like disease models.
To address these issues, germ-free (GF) animal models were urgently proposed in the mid-19th century and primarily developed during the 20th century. Subsequent refinements, including antibiotic-treated and gnotobiotic models, along with advancements in microbial detection and observation technologies, further perfected these models14,15,16. GF animals, created by erasing their own background and avoiding environmental microbes, offer an excellent strategy for exploring the interactions between microorganisms and their hosts17. Through the application of animal models and refined protocols, researchers have successfully replicated similar microbial compositions found in patients in GF mice and fish. Additionally, other GF animal models, such as dogs, chickens, and pigs, provide diverse options as research subjects18,19,20,21. This approach has enabled investigations into the potential therapeutic effects of commensal microbiomes on various diseases, including cancer immunotherapy in humans16,18. GF models offer more accurate insights into the characteristics and mechanisms of specific bacterial colonization, migration, multiplication, and interaction within hosts. This provides crucial novel insights into the occurrence and development of microbiota-related diseases22,23. The history of establishing and applying GF zebrafish in microbial research has evolved from the reports of Rawls et al. in 2004 and Bates et al. in 2006 to Melancon et al.&#39;s protocol in 201716,24,25. However, the feasibility of adult or breeding GF models is still a prolonged process, accompanied by variable longevity, success rates, and health challenges.
Among various animal models, zebrafish (Danio rerio) stands out as a critical tool for both basic and biomedical research due to its advantageous similarity to human organs and genomics, short developmental cycle, high fecundity, and transparent embryos19,26. Zebrafish, serving as reliable human disease models, offer a visual representation of physiological and pathological processes in vivo, providing insights into the attractive features of host-microbe interactions. Notably, zebrafish exhibit distinct cell lineages, allowing imaging of intestinal physiology, microbial dynamics, gonads and reproductive development, maturation of the host immune system, behavior, and metabolism27. Zebrafish embryos develop within protective chorions until hatching, becoming larvae at 3 days post-fertilization (dpf). They actively hunt for food at 5 dpf and reach sexual maturity around 3 months post-fertilization (mpf)28. The first successful germ-free (GF) zebrafish, reported by Rawls et al.24, showed that larvae fed with autoclaved feed after yolk absorption exhibited tissue necrosis from 8 dpf and total death at 20 dpf. This indicated the effects of diet or the importance of considering exogenous nutrient supply in experiments involving long-term (&#62;7 dpf) GF fish29. Subsequent studies improved the generation protocol of GF fish, employing sterile food and methods perfected in different fish models16.
However, most research on GF zebrafish models has focused on early life stages, involving bacterial infection at 5 dpf for 24 h to 48 h, with samples collected before 7 dpf at the conclusion of the experiments25,30,31. It&#39;s widely acknowledged that the microbiota in organisms, including humans and zebrafish, is colonized at the beginning of life and shaped during growth and development. The composition remains stable at adult stages, with the roles of microbiota in the host being crucial throughout life, especially in aging, neurodegenerative, metabolic-related obesity, and intestinal disease aspects3. Thus, perspectives from GF animals with longer survival can provide insights into the mechanisms of microbial roles in host organ development and functions, considering the immature immune and reproductive systems of fish larvae in early life. While bacterial strains in zebrafish intestines have been isolated and identified in previous studies, offering the potential for infecting GF animal models to select probiotics or research bacterial functions in the host19,25, the generation and application of GF fish models have primarily been restricted to early life stages. This limitation, attributed to the complex production process, high maintenance costs, and associated issues with food and immunity, hinders research efforts aimed at investigating the developmental and chronic effects of microbiota in the host.
The survival rate, behavior, growth, maturation, and overall health of fish, especially in germ-free (GF) models, are significantly influenced by feeding practices, encompassing nutrition intake and absorption during the mouth-open period from early larvae to juveniles32,33. However, one of the challenges in GF fish husbandry is the scarcity of suitable sterile diets, limiting the effectiveness of nutritional support for sustaining the growth and survival of larvae. Resolving this issue is crucial to restoring the life of GF fish, considering their developmental defense mechanisms and weak digestion abilities due to the absence of an intestinal microbiome. In terms of food, live brine shrimp (Artemia sp.) emerges as the most suitable diet for mouth-open larvae to juvenile fish. It has been observed that fish fed with live brine shrimp exhibit higher growth and survival rates compared to those fed with cooked egg yolk or other natural and synthetic baits34. While early life models of GF fish can survive with yolk support and GF larvae models can be maintained with sterile feeding, generating long-term models from larvae to juveniles and reaching sexual maturity remains challenging. Additionally, flake or powder food is limited by unequal nutritional composition and can impact water quality. In contrast, live Artemia has advantages such as survival in both salt and freshwater, small size suitable for larvae to adults, ease of batching, and higher hatching quality35. Building upon previous methods16,24,30, we have simplified the complex treatment process and addressed the diet challenge by establishing easily incubated GF live Artemia sp. as sterile food for longer durations than early-life GF fish.
This study presents an optimized protocol covering (1) generation, (2) maintenance, (3) identification of sterile rate, and (4) maintenance and feeding to ensure the growth of germ-free (GF) zebrafish from embryos to larvae and juvenile stages. The results offer preliminary evidence on the hatching, survival, growth, and sterility of GF zebrafish, along with essential indices for GF Artemia sp. as sterile food. The detailed steps in model generation and preparation of sterile live foods provide crucial technical support for constructing and applying long-term GF fish models, as well as GF Artemia sp. in microbiota-host interaction research. The protocol addresses bacterial isolation, identification, and infection on GF fish models, outlining methods for bacterial fluorescence labeling and observing their colonization in fish intestines under a microscope. GF fish, gnotobiotic fish with bacterial infection, or transferred human microbiota models will undergo various detections to elucidate their functions and effects on host immunity, digestion, behavior, transcriptomic regulation, and metabolic aspects. In the long term, this protocol can be extended to different wild-type fish species, such as marine medaka, and potentially to other selected transgenic zebrafish lines correlated to specific tissues or diseases.

Auteur in de schijnwerpers: Kiemvrije zebravissen tot stand brengen voor microbiota-gastheerrelatiestudies

Generatie, onderhoud en identificatie van kiemvrije zebravismodellen van larven tot juveniele stadia

The scope of this research is generation of novel, germ-free animal models, which will be helpful and powerful tools in investigation of various microbiome functions. In this field, the early germ-free fish models have been used recently, but the long-term models are still limited due to various culture conditions and the staff developmental defense. The current GF fish models are normally early life ones.Thus, the technologies including the sterile scale, the sample detection methods, and providing sterile food are very important challenges to overcome. The germ-free zebrafish model is crucial for studying host-microbiota interaction and their impacts on development and the immunity and disease. This model allows researchers to precisely manipulate the single gut bacteria and observe its effect on the transparent zebrafish embryos.It provides valuable insights into the roles of gut microbes inheriting the disease. In the future, our research will mainly focused on establishing a germ-free zebrafish model for entire life cycle to better understanding the function of the gut microbiome.

De GF-zebravismodellen kunnen efficiënt worden geproduceerd door gebruik te maken van de overvloedige eieren die worden voortgebracht door paren zebravissen, waarbij het protocol is geoptimaliseerd op basis van eerdere GF-vismodellen35. Een enkele plaat met 6 putjes kan ongeveer 30-48 embryo's/larven kweken, waardoor voldoende gegevens kunnen worden verzameld en statistische analyse kan worden uitgevoerd. Na steriele behandeling worden de GF-embryo's gekweekt in een schone incubator tot ze uitkom...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Establishing Germ-Free Zebrafish for Microbiota-Host Relationship Studies at JoVE.com

Dit protocol schetst de belangrijkste stappen voor het verkrijgen van kiemvrije (GF) visembryo's en het onderhouden ervan vanaf de larven tot het juveniele stadium, inclusief bemonstering en het detecteren van hun steriele status. Het gebruik van GF-modellen met infectie is belangrijk voor het begrijpen van de rol van microben in de gezondheid van de gastheer.

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

De reikwijdte van dit onderzoek is het genereren van nieuwe, kiemvrije diermodellen, die nuttige en krachtige hulpmiddelen zullen zijn bij het onderzoeken van verschillende microbioomfuncties. In dit veld zijn de vroege kiemvrije vismodellen recentelijk gebruikt, maar de langetermijnmodellen zijn nog steeds beperkt vanwege verschillende kweekomstandigheden en de ontwikkelingsverdediging van het personeel. De huidige GF-vismodellen zijn normaal gesproken vroege levensmodellen.De technologieën, waaronder de steriele weegschaal, de methoden voor het detecteren van monsters en het verstrekken van steriel voedsel, zijn dus zeer belangrijke uitdagingen die moeten worden overwonnen. Het kiemvrije zebravismodel is cruciaal voor het bestuderen van de interactie tussen gastheer en microbiota en hun impact op de ontwikkeling en de immuniteit en ziekte. Dit model stelt onderzoekers in staat om de enkele darmbacteriën nauwkeurig te manipuleren en het effect ervan op de transparante zebravisembryo's te observeren.Het biedt waardevolle inzichten in de rol van darmmicroben die de ziekte erven. In de toekomst zal ons onderzoek vooral gericht zijn op het opzetten van een kiemvrij zebravismodel voor de gehele levenscyclus om de functie van het darmmicrobioom beter te begrijpen.

generation-maintenance-identification-germ-free-zebrafish-models-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

Generation of Germ-Free Zebrafish Models from Embryos

Generatie van kiemvrije zebravismodellen uit embryo's

GF Artemia nauplii Preparation for Chronic GF Zebrafish Nutrition

To begin, obtain 0.25 grams of Artemia cysts and rinse them with 2.4 grams per liter sodium hypochlorite for five minutes. Filter the rinsed cysts with a sterilized ultra dense filter and wash with sterilized ultrapure water for one to two minutes. After three washes, transfer them to 100 milliliters of 2.5%sterile saline and mix well.Pack 50 milliliters of treated Artemia cyst mix into a sterile 100-milliliter bottle. Using a film, seal the bottle thoroughly and place it in a shaking incubator with light. Next, using a Pasteur pipette, extract 30 milliliters of hatching Artemia nauplii from the middle and lower layers.After filtering, wash the Artemia three times with sterile ultrapure water for about one minute, and add four milliliters of sterile ultrapure water. Finally, using a disposable Pasteur pipette, retrieve actively swimming Artemia from the upper layer, wash, and prepare the solution for feeding. Microscopic observation confirmed efficient hatching of Artemia cysts after the treatment.