Name: Pleins feux sur l’auteur : Établir un poisson-zèbre exempt de germes pour les études sur les relations entre le microbiote et l’hôte
Uploaded: 2024-04-12T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Establishing Germ-Free Zebrafish for Microbiota-Host Relationship Studies at JoVE.com

Nous remercions sincèrement le soutien du Chongqing Medical University Talent Project (n° R4014 au DSP et R4020 au PPJ), de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC, n° 32200386 à PPJ), du Chongqing Postdoctoral Innovation Mentor Studio (X7928 DSP) et du Programme du Centre conjoint Chine-Sri Lanka pour la recherche et la démonstration de la technologie de l’eau de l’Académie chinoise des sciences (CAS)/Centre conjoint Chine-Sri Lanka pour l’éducation et la recherche par le CAS.

Les expériences sur les poissons ont été menées conformément aux directives du Comité de protection et d’utilisation des animaux de Chongqing et du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine de Chongqing, en Chine, ainsi qu’aux normes pour les animaux de laboratoire publiées par le Bureau d’État de la qualité et de la supervision technique (ID d’approbation : GB14922-2001 à GBT14927-2001). Les poissons-zèbres (Danio rerio, type sauvage, ...

Optimisation des modèles de poissons-zèbres GF : génération, maintenance et études microbiennes

Étapes critiques dans les protocoles du poisson GF et de la préparation des aliments GF Au cours de la génération des modèles de poissons GF, plusieurs étapes critiques ont été impliquées, notamment la préparation du matériel stérile, la stérilisation des embryons, le renouvellement quotidien du GZM, la collecte de divers échantillons et l’examen stérile de chaque échantillon à l’aide de plusieurs méthodes. Parmi ces étapes, le traitement initial des embryons est fondamental et ...

Le microbiote (c’est-à-dire les archées, les bactéries, les eucarya et les virus) joue un rôle crucial dans le maintien de la santé de l’hôte et contribue au développement de diverses maladies en influençant les processus physiologiques et pathologiques par le biais d’interactions symbiotiques au sein de la barrière intestinale, de la surface épithéliale et des fonctions de la mucine chez les individus 1,2,3. La composition du microbiote à travers les différents stades de la vie, de la petite enfance à la jeunesse, à l’âge adulte et au vieillissement, ainsi que sa présence à divers endroits tels que les narines, la bouche, la peau et les intestins, sont façonnées de manière dynamique par divers habitats et environnements4. Le microbiote intestinal dans les organismes est impliqué dans l’absorption des nutriments, la réponse immunitaire, l’invasion d’agents pathogènes, la régulation métabolique, etc. 5,6. Des études sur des patients ont démontré que les perturbations du microbiote intestinal sont liées à l’obésité humaine, aux troubles du sommeil, à la dépression, aux maladies inflammatoires de l’intestin (MICI), aux maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer), au vieillissement et à divers cancers 7,8,9. De plus, les voies interactives entre le microbiote intestinal et les hôtes impliquent des facteurs inflammatoires, des neurotransmetteurs, des métabolites, la barrière intestinale et le stress oxydatif, comme observé dans des recherches antérieures utilisant des modèles de souris et de poissons10,11.
Récemment, de multiples approches ou thérapies liées aux bactéries, y compris des probiotiques potentiels et la transplantation de microbiote fécal (FMT), ont été explorées pour ces troubles dans des modèles cliniques et animaux. Ces explorations sont basées sur des découvertes liées à l’axe microbiote-intestin-cerveau/foie/rein, aux produits dérivés du microbiote et à l’activité altérée des récepteurs12,13. Cependant, le développement, les diverses fonctions et les mécanismes du système microbiote-hôte sont encore incomplètement compris et identifiés en raison de la complexité de la communauté microbienne et du défi de générer de puissants modèles de maladies semblables à celles de l’homme.
Pour résoudre ces problèmes, des modèles animaux exempts de germes (GF) ont été proposés d’urgence au milieu du 19e siècle et principalement développés au cours du 20e siècle. Des améliorations ultérieures, y compris des modèles traités aux antibiotiques et gnotobiotiques, ainsi que des progrès dans les technologies de détection et d’observation microbiennes, ont perfectionné ces modèles 14,15,16. Les animaux GF, créés en effaçant leur propre arrière-plan et en évitant les microbes environnementaux, offrent une excellente stratégie pour explorer les interactions entre les micro-organismes et leurs hôtes17. Grâce à l’application de modèles animaux et de protocoles affinés, les chercheurs ont réussi à reproduire des compositions microbiennes similaires trouvées chez des patients chez des souris et des poissons GF. De plus, d’autres modèles d’animaux GF, tels que les chiens, les poulets et les porcs, offrent diverses options en tant que sujets de recherche 18,19,20,21. Cette approche a permis d’étudier les effets thérapeutiques potentiels des microbiomes commensales sur diverses maladies, y compris l’immunothérapie du cancer chez l’homme16,18. Les modèles GF offrent des informations plus précises sur les caractéristiques et les mécanismes de la colonisation, de la migration, de la multiplication et de l’interaction bactériennes spécifiques au sein des hôtes. Cela fournit de nouvelles informations cruciales sur l’apparition et le développement des maladies liées au microbiote22,23. L’histoire de l’établissement et de l’application du poisson-zèbre GF dans la recherche microbienne a évolué depuis les rapports de Rawls et al. en 2004 et de Bates et al. en 2006 jusqu’au protocole de Melancon et al. en 2017 16,24,25. Cependant, la faisabilité de modèles de GF adultes ou reproducteurs est encore un processus prolongé, accompagné d’une longévité, de taux de réussite et de problèmes de santé variables.
Parmi les différents modèles animaux, le poisson-zèbre (Danio rerio) se distingue comme un outil essentiel pour la recherche fondamentale et biomédicale en raison de sa similitude avantageuse avec les organes humains et la génomique, de son cycle de développement court, de sa fécondité élevée et de ses embryons transparents19,26. Les poissons-zèbres, qui servent de modèles fiables de maladies humaines, offrent une représentation visuelle des processus physiologiques et pathologiques in vivo, donnant un aperçu des caractéristiques attrayantes des interactions hôte-microbe. Notamment, les poissons-zèbres présentent des lignées cellulaires distinctes, permettant l’imagerie de la physiologie intestinale, de la dynamique microbienne, des gonades et du développement reproducteur, de la maturation du système immunitaire de l’hôte, du comportement et dumétabolisme27. Les embryons de poisson-zèbre se développent dans des chorions protecteurs jusqu’à l’éclosion, devenant des larves 3 jours après la fécondation (dpf). Ils chassent activement pour se nourrir à 5 dpf et atteignent la maturité sexuelle environ 3 mois après la fécondation (mpf)28. Le premier poisson-zèbre sans germes (GF) réussi, rapporté par Rawls et al.24, a montré que les larves nourries avec de la nourriture autoclavée après absorption du vitellus présentaient une nécrose tissulaire à partir de 8 dpf et une mort totale à 20 dpf. Cela a révélé les effets de l’alimentation ou l’importance de tenir compte de l’apport exogène en nutriments dans les expériences impliquant des poissons SG à long terme (>7 dpf)29. Des études ultérieures ont amélioré le protocole de génération des poissons GF, en utilisant des aliments stériles et des méthodes perfectionnées dans différents modèles de poissons16.
Cependant, la plupart des recherches sur les modèles de poissons-zèbres GF se sont concentrées sur les premiers stades de la vie, impliquant une infection bactérienne à 5 dpf pendant 24 h à 48 h, avec des échantillons collectés avant 7 dpf à la fin des expériences 25,30,31. Il est largement reconnu que le microbiote des organismes, y compris les humains et les poissons-zèbres, est colonisé au début de la vie et façonné au cours de la croissance et du développement. La composition reste stable aux stades adultes, les rôles du microbiote chez l’hôte étant cruciaux tout au long de la vie, en particulier dans les aspects du vieillissement, des maladies neurodégénératives, métaboliques et des maladies intestinales3. Ainsi, les perspectives d’animaux GF ayant une survie plus longue peuvent donner un aperçu des mécanismes des rôles microbiens dans le développement et les fonctions des organes de l’hôte, compte tenu des systèmes immunitaires et reproducteurs immatures des larves de poissons au début de la vie. Alors que des souches bactériennes dans les intestins du poisson-zèbre ont été isolées et identifiées dans des études antérieures, offrant le potentiel d’infecter des modèles animaux GF pour sélectionner des probiotiques ou rechercher les fonctions bactériennes chez l’hôte19,25, la génération et l’application de modèles de poissons GF ont été principalement limitées aux premiers stades de la vie. Cette limitation, attribuée à la complexité du processus de production, aux coûts d’entretien élevés et aux problèmes associés à l’alimentation et à l’immunité, entrave les efforts de recherche visant à étudier les effets développementaux et chroniques du microbiote chez l’hôte.
Le taux de survie, le comportement, la croissance, la maturation et la santé globale des poissons, en particulier dans les modèles sans germes (GF), sont significativement influencés par les pratiques alimentaires, englobant l’apport nutritionnel et l’absorption pendant la période d’ouverture de la bouche, des larves précoces aux juvéniles32,33. Cependant, l’un des défis de l’élevage des poissons GF est la rareté des régimes stériles appropriés, ce qui limite l’efficacité du soutien nutritionnel pour soutenir la croissance et la survie des larves. La résolution de ce problème est cruciale pour restaurer la vie des poissons GF, compte tenu de leurs mécanismes de défense développementaux et de leurs faibles capacités de digestion dues à l’absence de microbiome intestinal. En termes de nourriture, les artémias vivants (Artemia sp.) apparaissent comme le régime alimentaire le plus approprié pour les larves à bouche ouverte comme pour les poissons juvéniles. Il a été observé que les poissons nourris avec des artémias vivants présentent des taux de croissance et de survie plus élevés que ceux nourris avec du jaune d’œuf cuit ou d’autres appâts naturels et synthétiques34. Bien que les modèles précoces de poissons GF puissent survivre avec le soutien du vitellin et que les modèles de larves GF puissent être maintenus avec une alimentation stérile, il reste difficile de générer des modèles à long terme des larves aux juvéniles et d’atteindre la maturité sexuelle. De plus, les aliments en flocons ou en poudre sont limités par une composition nutritionnelle inégale et peuvent avoir un impact sur la qualité de l’eau. En revanche, les artémias vivants présentent des avantages tels que la survie en eau salée et douce, une petite taille adaptée aux larves aux adultes, une facilité de dosage et une qualité d’éclosion supérieure35. En nous appuyant sur les méthodes précédentes 16,24,30, nous avons simplifié le processus de traitement complexe et relevé le défi de l’alimentation en établissant des Artemia sp. vivants sans gluten facilement incubés comme nourriture stérile pendant de plus longues durées que les poissons sans gluten en début de vie.
Cette étude présente un protocole optimisé couvrant (1) la génération, (2) l’entretien, (3) l’identification du taux de stérileté, et (4) l’entretien et l’alimentation pour assurer la croissance du poisson-zèbre sans germes (GF) de l’embryon au stade larvaire et juvénile. Les résultats offrent des preuves préliminaires sur l’éclosion, la survie, la croissance et la stérilité du poisson-zèbre GF, ainsi que des indices essentiels pour GF Artemia sp. en tant qu’aliment stérile. Les étapes détaillées de la génération de modèles et de la préparation d’aliments vivants stériles fournissent un soutien technique crucial pour la construction et l’application de modèles à long terme de poissons GF, ainsi que GF Artemia sp. dans la recherche sur l’interaction microbiote-hôte. Le protocole aborde l’isolement, l’identification et l’infection bactériennes sur des modèles de poissons GF, en décrivant les méthodes de marquage par fluorescence bactérienne et en observant leur colonisation dans les intestins des poissons au microscope. Les poissons GF, les poissons gnotobiotiques atteints d’une infection bactérienne ou les modèles de microbiote humain transférés subiront diverses détections pour élucider leurs fonctions et leurs effets sur l’immunité de l’hôte, la digestion, le comportement, la régulation transcriptomique et les aspects métaboliques. À long terme, ce protocole peut être étendu à différentes espèces de poissons sauvages, comme le medaka marin, et potentiellement à d’autres lignées de poissons-zèbres transgéniques sélectionnées corrélées à des tissus ou à des maladies spécifiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AB-GZM</td>
			<td>Amphotericin:Solarbio;&#160; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.</td>
			<td>Amphotericin:CAS:1397-89-3; 
			kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.</td>
			<td>49.6 mL GZM, 50 &#181;L amphotericin stock solution (250 &#181;g/mL), 25 &#181;L kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 &#181;L ampicillin stock solution (20 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-15-M</td>
			<td>To collect samples, and hold agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates, 24-, 48- well plates</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>11112</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aeronomas</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178499</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic work station</td>
			<td>GENE SCIENCE</td>
			<td>E200G</td>
			<td>Bacterial isolation, sterile testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis</td>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>v6.07</td>
			<td>To analysis the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API 20 E kits</td>
			<td>&#160;BioMerieux SA, France</td>
			<td>No.1005915090</td>
			<td>Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia (Brine shrimp)</td>
			<td>Shangjia Aquarium Co., Ltd.</td>
			<td>Aquamaster brand</td>
			<td>Artemia cysts, and brine shrimp eggs&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto cycle system for fish culture</td>
			<td>Ningbo Hairui Technology Co., Ltd</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Maintain the fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Zeal Way</td>
			<td>G154DWS</td>
			<td>Prepare the materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Aerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Anaerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>LongYue Co., Ltd</td>
			<td>SPX</td>
			<td>For fish and plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Haier</td>
			<td>HR40-IIA2</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood plates</td>
			<td>sheep blood:Solarbio</td>
			<td>Cat. NO. TX0030</td>
			<td>Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-Dil dyes</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Cat#C7000&#160;&#160;</td>
			<td>To label the bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature shaking incubator</td>
			<td>Peiving Co., Ltd</td>
			<td>HZQ-X100</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>Bacteria and Archaea database</td>
			<td>Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ 
			Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pasteur pipette</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>bs-xh-03l</td>
			<td>Used to change water, and transfer eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dish</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-90-D</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA kits</td>
			<td>Solaribio</td>
			<td>Cat#D1600</td>
			<td>Bacterial genomic DNA extraction kits&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric pipette</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>Levo me</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exiguobacterium</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178504</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZM</td>
			<td>Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd.</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory pure water system</td>
			<td>Hitech Co., Ltd</td>
			<td>Prima-S15</td>
			<td>Prepare the agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td>With fluorescent light to observe fish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR kits</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>Cat#ET101</td>
			<td>Taq DNA Polymerase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>sp-013-10</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine (PVP-I)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>Lot#H1217005</td>
			<td>Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timing converter</td>
			<td>PinYi Co., Ltd</td>
			<td>AL-06</td>
			<td>To regulate the light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Aerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Anaerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clean workbench</td>
			<td>Airtech</td>
			<td>SW-CJ-2FD</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure flow system for fish culture</td>
			<td>Marine Biological Equipment company</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Produce water for fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178501</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, maintenance, and identification of germ-free zebrafish models from larvae to juvenile stages

Les poissons-zèbres servent de modèles précieux pour la recherche sur la croissance, l’immunité et le microbiote intestinal en raison de leurs similitudes génomiques avec les mammifères, de leurs embryons transparents développés dans un environnement de chorion relativement propre et du développement extrêmement rapide des larves par rapport aux modèles de rongeurs. Les poissons-zèbres exempts de germes (Danio rerio) sont essentiels pour évaluer la toxicité des polluants et établir des modèles de maladies similaires à celles de l’homme liées aux fonctions microbiennes. Par rapport aux modèles élevés de manière conventionnelle (RC) (poissons en élevage commun), le poisson-zèbre GF permet une manipulation plus précise du microbiote de l’hôte, aidant à déterminer la relation de cause à effet entre les micro-organismes et les hôtes. Par conséquent, ils jouent un rôle essentiel dans l’avancement de notre compréhension de ces relations. Cependant, les modèles de poisson-zèbre GF sont généralement générés et étudiés au cours des premiers stades de la vie (de l’embryon à la larve) en raison des limitations de la fonction immunitaire et de l’absorption des nutriments. Cette étude optimise la génération, la maintenance et l’identification des premiers modèles de poissons-zèbres GF sans alimentation et avec une alimentation à long terme avec des aliments GF (tels que Artemia sp., artémias ). Tout au long du processus, des échantillonnages et des cultures quotidiens ont été effectués et identifiés grâce à de multiples détections, y compris des plaques et le séquençage de l’ARNr 16S. Le taux d’asepsie, la survie et les indices de développement du poisson-zèbre GF ont été enregistrés pour garantir la qualité et la quantité des modèles générés. Il est important de noter que cette étude fournit des détails sur les techniques d’isolement bactérien et d’infection des poissons GF, permettant la création efficace de modèles de poissons GF des larves aux stades juvéniles avec un soutien alimentaire GF. En appliquant ces procédures dans la recherche biomédicale, les scientifiques peuvent mieux comprendre les relations entre les fonctions bactériennes intestinales et la santé de l’hôte.

The microbiota (i.e., Archaea, Bacteria, Eukarya, and viruses) play crucial roles in maintaining host health and contributing to the development of various diseases by influencing physiological and pathological processes through symbiotic interactions within the intestinal barrier, epithelial surface, and mucin functions in individuals1,2,3. The composition of the microbiota across different life stages, from infancy to juvenility, adulthood, and aging, as well as its presence in various locations such as nares, oral, skin, and gut sites, is dynamically shaped by diverse habitats and environments4. The intestinal microbiota in organisms is involved in nutrient absorption, immune response, pathogen invasion, metabolic regulation, etc5,6. Studies on patients have demonstrated that disruptions in gut microbiota are related to human obesity, sleep disorders, depression, inflammatory bowel disease (IBD), neurodegenerative diseases (Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s), aging, and various cancers7,8,9. Furthermore, interactive pathways between gut microbiota and hosts involve inflammatory factors, neurotransmitters, metabolites, intestinal barrier, and oxidative stress, as observed in previous research using mice and fish models10,11.
Recently, multiple bacteria-related approaches or therapies, including potential probiotics and fecal microbiota transplantation (FMT), have been explored for these disorders in clinical and animal models. These explorations are based on discoveries related to the microbiota-gut-brain/liver/kidney axis, microbiota-derived products, and altered receptor activity12,13. However, the development, various functions, and mechanisms of the microbiota-host system are still incompletely understood and identified due to the complexity of the microbial community and the challenge of generating powerful human-like disease models.
To address these issues, germ-free (GF) animal models were urgently proposed in the mid-19th century and primarily developed during the 20th century. Subsequent refinements, including antibiotic-treated and gnotobiotic models, along with advancements in microbial detection and observation technologies, further perfected these models14,15,16. GF animals, created by erasing their own background and avoiding environmental microbes, offer an excellent strategy for exploring the interactions between microorganisms and their hosts17. Through the application of animal models and refined protocols, researchers have successfully replicated similar microbial compositions found in patients in GF mice and fish. Additionally, other GF animal models, such as dogs, chickens, and pigs, provide diverse options as research subjects18,19,20,21. This approach has enabled investigations into the potential therapeutic effects of commensal microbiomes on various diseases, including cancer immunotherapy in humans16,18. GF models offer more accurate insights into the characteristics and mechanisms of specific bacterial colonization, migration, multiplication, and interaction within hosts. This provides crucial novel insights into the occurrence and development of microbiota-related diseases22,23. The history of establishing and applying GF zebrafish in microbial research has evolved from the reports of Rawls et al. in 2004 and Bates et al. in 2006 to Melancon et al.&#39;s protocol in 201716,24,25. However, the feasibility of adult or breeding GF models is still a prolonged process, accompanied by variable longevity, success rates, and health challenges.
Among various animal models, zebrafish (Danio rerio) stands out as a critical tool for both basic and biomedical research due to its advantageous similarity to human organs and genomics, short developmental cycle, high fecundity, and transparent embryos19,26. Zebrafish, serving as reliable human disease models, offer a visual representation of physiological and pathological processes in vivo, providing insights into the attractive features of host-microbe interactions. Notably, zebrafish exhibit distinct cell lineages, allowing imaging of intestinal physiology, microbial dynamics, gonads and reproductive development, maturation of the host immune system, behavior, and metabolism27. Zebrafish embryos develop within protective chorions until hatching, becoming larvae at 3 days post-fertilization (dpf). They actively hunt for food at 5 dpf and reach sexual maturity around 3 months post-fertilization (mpf)28. The first successful germ-free (GF) zebrafish, reported by Rawls et al.24, showed that larvae fed with autoclaved feed after yolk absorption exhibited tissue necrosis from 8 dpf and total death at 20 dpf. This indicated the effects of diet or the importance of considering exogenous nutrient supply in experiments involving long-term (&#62;7 dpf) GF fish29. Subsequent studies improved the generation protocol of GF fish, employing sterile food and methods perfected in different fish models16.
However, most research on GF zebrafish models has focused on early life stages, involving bacterial infection at 5 dpf for 24 h to 48 h, with samples collected before 7 dpf at the conclusion of the experiments25,30,31. It&#39;s widely acknowledged that the microbiota in organisms, including humans and zebrafish, is colonized at the beginning of life and shaped during growth and development. The composition remains stable at adult stages, with the roles of microbiota in the host being crucial throughout life, especially in aging, neurodegenerative, metabolic-related obesity, and intestinal disease aspects3. Thus, perspectives from GF animals with longer survival can provide insights into the mechanisms of microbial roles in host organ development and functions, considering the immature immune and reproductive systems of fish larvae in early life. While bacterial strains in zebrafish intestines have been isolated and identified in previous studies, offering the potential for infecting GF animal models to select probiotics or research bacterial functions in the host19,25, the generation and application of GF fish models have primarily been restricted to early life stages. This limitation, attributed to the complex production process, high maintenance costs, and associated issues with food and immunity, hinders research efforts aimed at investigating the developmental and chronic effects of microbiota in the host.
The survival rate, behavior, growth, maturation, and overall health of fish, especially in germ-free (GF) models, are significantly influenced by feeding practices, encompassing nutrition intake and absorption during the mouth-open period from early larvae to juveniles32,33. However, one of the challenges in GF fish husbandry is the scarcity of suitable sterile diets, limiting the effectiveness of nutritional support for sustaining the growth and survival of larvae. Resolving this issue is crucial to restoring the life of GF fish, considering their developmental defense mechanisms and weak digestion abilities due to the absence of an intestinal microbiome. In terms of food, live brine shrimp (Artemia sp.) emerges as the most suitable diet for mouth-open larvae to juvenile fish. It has been observed that fish fed with live brine shrimp exhibit higher growth and survival rates compared to those fed with cooked egg yolk or other natural and synthetic baits34. While early life models of GF fish can survive with yolk support and GF larvae models can be maintained with sterile feeding, generating long-term models from larvae to juveniles and reaching sexual maturity remains challenging. Additionally, flake or powder food is limited by unequal nutritional composition and can impact water quality. In contrast, live Artemia has advantages such as survival in both salt and freshwater, small size suitable for larvae to adults, ease of batching, and higher hatching quality35. Building upon previous methods16,24,30, we have simplified the complex treatment process and addressed the diet challenge by establishing easily incubated GF live Artemia sp. as sterile food for longer durations than early-life GF fish.
This study presents an optimized protocol covering (1) generation, (2) maintenance, (3) identification of sterile rate, and (4) maintenance and feeding to ensure the growth of germ-free (GF) zebrafish from embryos to larvae and juvenile stages. The results offer preliminary evidence on the hatching, survival, growth, and sterility of GF zebrafish, along with essential indices for GF Artemia sp. as sterile food. The detailed steps in model generation and preparation of sterile live foods provide crucial technical support for constructing and applying long-term GF fish models, as well as GF Artemia sp. in microbiota-host interaction research. The protocol addresses bacterial isolation, identification, and infection on GF fish models, outlining methods for bacterial fluorescence labeling and observing their colonization in fish intestines under a microscope. GF fish, gnotobiotic fish with bacterial infection, or transferred human microbiota models will undergo various detections to elucidate their functions and effects on host immunity, digestion, behavior, transcriptomic regulation, and metabolic aspects. In the long term, this protocol can be extended to different wild-type fish species, such as marine medaka, and potentially to other selected transgenic zebrafish lines correlated to specific tissues or diseases.

Pleins feux sur l’auteur : Établir un poisson-zèbre exempt de germes pour les études sur les relations entre le microbiote et l’hôte

Génération, maintenance et identification de modèles de poissons-zèbres exempts de germes, des larves aux stades juvéniles

The scope of this research is generation of novel, germ-free animal models, which will be helpful and powerful tools in investigation of various microbiome functions. In this field, the early germ-free fish models have been used recently, but the long-term models are still limited due to various culture conditions and the staff developmental defense. The current GF fish models are normally early life ones.Thus, the technologies including the sterile scale, the sample detection methods, and providing sterile food are very important challenges to overcome. The germ-free zebrafish model is crucial for studying host-microbiota interaction and their impacts on development and the immunity and disease. This model allows researchers to precisely manipulate the single gut bacteria and observe its effect on the transparent zebrafish embryos.It provides valuable insights into the roles of gut microbes inheriting the disease. In the future, our research will mainly focused on establishing a germ-free zebrafish model for entire life cycle to better understanding the function of the gut microbiome.

Les modèles de poisson-zèbre GF peuvent être produits efficacement en utilisant les œufs abondants pondus par les couples de poissons-zèbres, avec le protocole optimisé sur la base des modèles de poissons GF précédents35. Une seule plaque à 6 puits peut élever environ 30 à 48 embryons/larves, ce qui permet une collecte de données et une analyse statistique suffisantes. Après le traitement stérile, les embryons GF sont cultivés dans un incubateur propre jusqu’à l’éclosion des ...

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Ce protocole décrit les principales étapes à suivre pour obtenir des embryons de poissons exempts de germes (GF) et les maintenir depuis l’état larvaire jusqu’au stade juvénile, y compris l’échantillonnage et la détection de leur statut stérile. L’utilisation de modèles GF avec infection est importante pour comprendre le rôle des microbes dans la santé de l’hôte.

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

La portée de cette recherche est la génération de nouveaux modèles animaux exempts de germes, qui seront des outils utiles et puissants dans l’étude de diverses fonctions du microbiome. Dans ce domaine, les premiers modèles de poissons exempts de germes ont été utilisés récemment, mais les modèles à long terme sont encore limités en raison de diverses conditions d’élevage et de la défense du développement du personnel. Les modèles actuels de poissons GF sont normalement des modèles de vie précoce.Ainsi, les technologies telles que la balance stérile, les méthodes de détection des échantillons et la fourniture d’aliments stériles sont des défis très importants à surmonter. Le modèle du poisson-zèbre sans germes est crucial pour étudier l’interaction hôte-microbiote et leurs impacts sur le développement, l’immunité et la maladie. Ce modèle permet aux chercheurs de manipuler avec précision les bactéries intestinales uniques et d’observer leur effet sur les embryons transparents de poisson-zèbre.Il fournit des informations précieuses sur le rôle des microbes intestinaux dans l’héritage de la maladie. À l’avenir, nos recherches se concentreront principalement sur l’établissement d’un modèle de poisson-zèbre exempt de germes pour l’ensemble du cycle de vie afin de mieux comprendre la fonction du microbiome intestinal.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

Recherche

Biologie du développement

Generation of Germ-Free Zebrafish Models from Embryos

Génération de modèles de poissons-zèbres exempts de germes à partir d’embryons

GF Artemia nauplii Preparation for Chronic GF Zebrafish Nutrition

To begin, obtain 0.25 grams of Artemia cysts and rinse them with 2.4 grams per liter sodium hypochlorite for five minutes. Filter the rinsed cysts with a sterilized ultra dense filter and wash with sterilized ultrapure water for one to two minutes. After three washes, transfer them to 100 milliliters of 2.5%sterile saline and mix well.Pack 50 milliliters of treated Artemia cyst mix into a sterile 100-milliliter bottle. Using a film, seal the bottle thoroughly and place it in a shaking incubator with light. Next, using a Pasteur pipette, extract 30 milliliters of hatching Artemia nauplii from the middle and lower layers.After filtering, wash the Artemia three times with sterile ultrapure water for about one minute, and add four milliliters of sterile ultrapure water. Finally, using a disposable Pasteur pipette, retrieve actively swimming Artemia from the upper layer, wash, and prepare the solution for feeding. Microscopic observation confirmed efficient hatching of Artemia cysts after the treatment.