Name: Autor im Rampenlicht: Etablierung keimfreier Zebrafische für Mikrobiota-Wirt-Beziehungsstudien
Uploaded: 2024-04-12T13:50:00
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Wir danken herzlich für die Unterstützung durch das Chongqing Medical University Talent Project (Nr. R4014 für DSP und R4020 für PPJ), die National Natural Science Foundation of China (NSFC, Nr. 32200386 für PPJ), das Chongqing Postdoctoral Innovation Mentor Studio (X7928 DSP) und das Programm des China-Sri Lanka Joint Center for Water Technology Research and Demonstration der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (CAS)/China-Sri Lanka Joint Center for Education and Research durch CAS.

Die Fischversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Animal Care and Use Committee von Chongqing und des Institutional Animal Care and Use Committee der Chongqing Medical University, China, sowie den vom State Bureau of Quality and Technical Supervision herausgegebenen Standards für Versuchstiere (Zulassungs-ID: GB14922-2001 bis GBT14927-2001) durchgeführt. Zebrafische (Danio rerio, Wildtyp, AB-Stamm) wurden vom Institut für Hydrobiologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften bezogen un...

Optimierung von GF Zebrafischmodellen: Erzeugung, Pflege und mikrobielle Studien

Kritische Schritte innerhalb der Protokolle von GF Fisch und GF Speisenzubereitung Bei der Generierung von GF Fischmodellen waren mehrere kritische Schritte erforderlich, darunter die Aufbereitung des sterilen Materials, die Sterilisation der Embryonen, die tägliche Erneuerung des GZM, die Entnahme verschiedener Proben und die sterile Untersuchung jeder Probe mit mehreren Methoden. Unter diesen Schritten ist die Erstbehandlung von Embryonen grundlegend und entscheidend für den Erfolg der GF Modelle....

Die Mikrobiota (d. h. Archaeen, Bakterien, Eukarya und Viren) spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit des Wirts und tragen zur Entwicklung verschiedener Krankheiten bei, indem sie physiologische und pathologische Prozesse durch symbiotische Wechselwirkungen innerhalb der Darmbarriere, der Epitheloberfläche und der Muzinfunktionen bei Individuen beeinflussen 1,2,3. Die Zusammensetzung der Mikrobiota in verschiedenen Lebensstadien, vom Säuglingsalter bis zur Jugend, dem Erwachsenenalter und dem Altern, sowie ihre Präsenz an verschiedenen Orten wie Nasenlöchern, Mund-, Haut- und Darmstellen wird dynamisch durch verschiedene Lebensräume und Umgebungen geprägt4. Die Darmmikrobiota in Organismen ist an der Nährstoffaufnahme, der Immunantwort, der Invasion von Krankheitserregern, der Stoffwechselregulation usw. beteiligt 5,6. Studien an Patienten haben gezeigt, dass Störungen der Darmmikrobiota mit Fettleibigkeit beim Menschen, Schlafstörungen, Depressionen, entzündlichen Darmerkrankungen (CED), neurodegenerativen Erkrankungen (Parkinson, Alzheimer), Alterung und verschiedenen Krebsarten zusammenhängen 7,8,9. Darüber hinaus umfassen interaktive Wege zwischen der Darmmikrobiota und den Wirten Entzündungsfaktoren, Neurotransmitter, Metaboliten, Darmbarriere und oxidativen Stress, wie in früheren Forschungen mit Mäuse- und Fischmodellen beobachtetwurde 10,11.
In jüngster Zeit wurden mehrere bakterienbezogene Ansätze oder Therapien, einschließlich potenzieller Probiotika und fäkaler Mikrobiota-Transplantation (FMT), für diese Erkrankungen in klinischen und Tiermodellen untersucht. Diese Untersuchungen basieren auf Entdeckungen im Zusammenhang mit der Mikrobiota-Darm-Gehirn-/Leber-/Nierenachse, von der Mikrobiota abgeleiteten Produkten und einer veränderten Rezeptoraktivität12,13. Die Entwicklung, die verschiedenen Funktionen und Mechanismen des Mikrobiota-Wirt-Systems sind jedoch aufgrund der Komplexität der mikrobiellen Gemeinschaft und der Herausforderung, leistungsfähige menschenähnliche Krankheitsmodelle zu generieren, noch unvollständig verstanden und identifiziert.
Um diese Probleme anzugehen, wurden Mitte des 19. Jahrhunderts dringend keimfreie (GF) Tiermodelle vorgeschlagen, die vor allem im 20. Jahrhundert entwickelt wurden. Spätere Verfeinerungen, einschließlich antibiotikabehandelter und gnotobiotischer Modelle, sowie Fortschritte in der mikrobiellen Nachweis- und Beobachtungstechnologie perfektionierten diese Modelle weiter 14,15,16. GF-Tiere, die durch die Auslöschung ihres eigenen Hintergrunds und die Vermeidung von Umweltmikroben entstanden sind, bieten eine hervorragende Strategie, um die Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen und ihren Wirten zu erforschen17. Durch die Anwendung von Tiermodellen und verfeinerten Protokollen ist es den Forschern gelungen, ähnliche mikrobielle Zusammensetzungen zu replizieren, die bei Patienten in GF-Mäusen und -Fischen gefunden wurden. Darüber hinaus bieten andere Tiermodelle von GF, wie z. B. Hunde, Hühner und Schweine, vielfältige Optionen als Forschungsobjektean 18,19,20,21. Dieser Ansatz hat es ermöglicht, die potenziellen therapeutischen Wirkungen kommensaler Mikrobiome auf verschiedene Krankheiten, einschließlich der Krebsimmuntherapie beim Menschen, zu untersuchen16,18. GF-Modelle bieten genauere Einblicke in die Eigenschaften und Mechanismen der spezifischen bakteriellen Besiedlung, Migration, Vermehrung und Interaktion innerhalb von Wirten. Dies liefert entscheidende neue Einblicke in das Auftreten und die Entwicklung von Mikrobiota-bedingten Krankheiten22,23. Die Geschichte der Etablierung und Anwendung von GF-Zebrafischen in der mikrobiellen Forschung hat sich von den Berichten von Rawls et al. im Jahr 2004 und Bates et al. im Jahr 2006 bis zum Protokoll von Melancon et al. im Jahr 2017entwickelt 16,24,25. Die Machbarkeit von adulten oder gezüchteten GF-Modellen ist jedoch immer noch ein langwieriger Prozess, der mit unterschiedlicher Langlebigkeit, Erfolgsraten und gesundheitlichen Herausforderungen einhergeht.
Unter den verschiedenen Tiermodellen sticht der Zebrafisch (Danio rerio) aufgrund seiner vorteilhaften Ähnlichkeit mit menschlichen Organen und Genomik, seines kurzen Entwicklungszyklus, seiner hohen Fruchtbarkeit und seiner transparenten Embryonen als wichtiges Werkzeug sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die biomedizinische Forschung hervor19,26. Zebrafische, die als zuverlässige Krankheitsmodelle für den Menschen dienen, bieten eine visuelle Darstellung physiologischer und pathologischer Prozesse in vivo und geben Einblicke in die attraktiven Eigenschaften von Wirt-Mikroben-Interaktionen. Bemerkenswert ist, dass Zebrafische unterschiedliche Zelllinien aufweisen, die eine Abbildung der Darmphysiologie, der mikrobiellen Dynamik, der Gonaden und der Fortpflanzungsentwicklung, der Reifung des Immunsystems des Wirts, des Verhaltens und des Stoffwechsels ermöglichen27. Zebrafischembryonen entwickeln sich bis zum Schlüpfen in schützenden Chorionen und werden 3 Tage nach der Befruchtung zu Larven (dpf). Sie jagen aktiv bei 5 dpf nach Nahrung und erreichen die Geschlechtsreife etwa 3 Monate nach der Befruchtung (mpf)28. Der erste erfolgreiche keimfreie (GF) Zebrafisch, der von Rawls et al.24 berichtet wurde, zeigte, dass Larven, die nach der Dotterresorption mit autoklaviertem Futter gefüttert wurden, eine Gewebenekrose ab 8 dpf und einen vollständigen Tod bei 20 dpf aufwiesen. Dies deutete auf die Auswirkungen der Ernährung oder die Bedeutung der Berücksichtigung der exogenen Nährstoffversorgung in Experimenten mit Langzeit-GF-Fischen (>7 dpf) hin29. Nachfolgende Studien verbesserten das Generationsprotokoll von GF-Fischen, indem steriles Futter und Methoden verwendet wurden, die in verschiedenen Fischmodellen perfektioniert wurden16.
Die meisten Forschungen an GF-Zebrafischmodellen konzentrierten sich jedoch auf frühe Lebensstadien, die eine bakterielle Infektion bei 5 dpf für 24 h bis 48 h beinhalteten, wobei Proben vor 7 dpf am Ende der Experimente entnommen wurden 25,30,31. Es ist allgemein anerkannt, dass die Mikrobiota in Organismen, einschließlich Menschen und Zebrafischen, zu Beginn des Lebens besiedelt und während des Wachstums und der Entwicklung geformt wird. Die Zusammensetzung bleibt im Erwachsenenstadium stabil, wobei die Rolle der Mikrobiota im Wirt während des gesamten Lebens von entscheidender Bedeutung ist, insbesondere bei Aspekten des Alterns, der neurodegenerativen, stoffwechselbedingten Fettleibigkeit und der Darmerkrankung3. So können Perspektiven von GF-Tieren mit längerem Überleben Einblicke in die Mechanismen mikrobieller Rollen bei der Entwicklung und Funktion von Wirtsorganen geben, unter Berücksichtigung des unreifen Immun- und Fortpflanzungssystems von Fischlarven im frühen Leben. Während in früheren Studien Bakterienstämme im Zebrafischdarm isoliert und identifiziert werden konnten, die das Potenzial für die Infektion von GF-Tiermodellen bieten, um Probiotika auszuwählen oder bakterielle Funktionen im Wirt zu erforschen19,25 war die Generierung und Anwendung von GF-Fischmodellen in erster Linie auf frühe Lebensstadien beschränkt. Diese Einschränkung, die auf den komplexen Produktionsprozess, die hohen Wartungskosten und die damit verbundenen Probleme mit der Nahrung und der Immunität zurückzuführen ist, behindert Forschungsbemühungen, die darauf abzielen, die entwicklungsbedingten und chronischen Auswirkungen der Mikrobiota auf den Wirt zu untersuchen.
Die Überlebensrate, das Verhalten, das Wachstum, die Reifung und die allgemeine Gesundheit von Fischen, insbesondere in keimfreien (GF) Modellen, werden signifikant von den Fütterungspraktiken beeinflusst, die die Nahrungsaufnahme und -absorption während der Zeit des offenen Mundes von den frühen Larven bis zu den Jungtieren umfassen32,33. Eine der Herausforderungen in der Fischzucht von GF ist jedoch der Mangel an geeignetem sterilem Futter, der die Wirksamkeit der Ernährungsunterstützung zur Aufrechterhaltung des Wachstums und Überlebens der Larven einschränkt. Die Lösung dieses Problems ist entscheidend für die Wiederherstellung des Lebens von GF-Fischen, wenn man ihre entwicklungsfördernden Abwehrmechanismen und ihre schwachen Verdauungsfähigkeiten aufgrund des Fehlens eines Darmmikrobioms berücksichtigt. Was die Ernährung betrifft, so erweist sich die lebende Salinengarnele (Artemia sp.) als die am besten geeignete Nahrung für Larven mit offenem Mund bis hin zu Jungfischen. Es wurde beobachtet, dass Fische, die mit lebenden Salinengarnelen gefüttert werden, höhere Wachstums- und Überlebensraten aufweisen als Fische, die mit gekochtem Eigelb oder anderen natürlichen und synthetischen Ködern gefüttert werden34. Während frühe Lebensmodelle von GF-Fischen mit Dotterunterstützung überleben können und GF-Larvenmodelle durch sterile Fütterung erhalten werden können, bleibt die Generierung von Langzeitmodellen von Larven zu Jungtieren und das Erreichen der Geschlechtsreife eine Herausforderung. Darüber hinaus wird Flocken- oder Pulverfutter durch eine ungleiche Nährstoffzusammensetzung eingeschränkt und kann die Wasserqualität beeinträchtigen. Im Gegensatz dazu hat lebende Artemia Vorteile wie das Überleben sowohl in Salz- als auch in Süßwasser, die geringe Größe, die für Larven bis hin zu erwachsenen Larven geeignet ist, die einfache Zusammenstellung und eine höhere Schlupfqualität35. Aufbauend auf den vorangegangenen Methoden 16,24,30 haben wir den komplexen Behandlungsprozess vereinfacht und die Herausforderung der Ernährung angegangen, indem wir leicht inkubierbares GF-Lebend-Artemia sp. als steriles Futter für eine längere Dauer als GF-Fische im frühen Leben etabliert haben.
Diese Studie stellt ein optimiertes Protokoll vor, das (1) die Generation, (2) die Erhaltung, (3) die Identifizierung der Sterilrate und (4) die Erhaltung und Fütterung abdeckt, um das Wachstum von keimfreien (GF) Zebrafischen von den Embryonen bis zu den Larven und Jungtieren sicherzustellen. Die Ergebnisse liefern erste Hinweise auf das Schlüpfen, das Überleben, das Wachstum und die Sterilität von GF Zebrafischen sowie essentielle Indizes für GF Artemia sp. als steriles Futter. Die detaillierten Schritte zur Modellgenerierung und -aufbereitung von sterilem Lebendfutter bieten eine entscheidende technische Unterstützung für die Konstruktion und Anwendung von Langzeitmodellen von GF Fischen sowie von GF Artemia sp. in der Erforschung der Mikrobiota-Wirt-Interaktion. Das Protokoll befasst sich mit der Isolierung, Identifizierung und Infektion von Bakterien an GF-Fischmodellen, skizziert Methoden zur bakteriellen Fluoreszenzmarkierung und zur Beobachtung ihrer Besiedlung im Fischdarm unter einem Mikroskop. GF-Fische, gnotobiotische Fische mit bakterieller Infektion oder übertragene humane Mikrobiota-Modelle werden verschiedenen Detektionen unterzogen, um ihre Funktionen und Auswirkungen auf die Immunität, die Verdauung, das Verhalten, die transkriptomische Regulation und metabolische Aspekte des Wirts aufzuklären. Langfristig kann dieses Protokoll auf verschiedene Wildtyp-Fischarten, wie z. B. marine Medaka, und möglicherweise auf andere ausgewählte transgene Zebrafischlinien ausgeweitet werden, die mit bestimmten Geweben oder Krankheiten korrelieren.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>AB-GZM</td>
			<td>Amphotericin:Solarbio;&#160; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.</td>
			<td>Amphotericin:CAS:1397-89-3; 
			kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.</td>
			<td>49.6 mL GZM, 50 &#181;L amphotericin stock solution (250 &#181;g/mL), 25 &#181;L kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 &#181;L ampicillin stock solution (20 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-15-M</td>
			<td>To collect samples, and hold agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates, 24-, 48- well plates</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>11112</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aeronomas</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178499</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic work station</td>
			<td>GENE SCIENCE</td>
			<td>E200G</td>
			<td>Bacterial isolation, sterile testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis</td>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>v6.07</td>
			<td>To analysis the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API 20 E kits</td>
			<td>&#160;BioMerieux SA, France</td>
			<td>No.1005915090</td>
			<td>Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia (Brine shrimp)</td>
			<td>Shangjia Aquarium Co., Ltd.</td>
			<td>Aquamaster brand</td>
			<td>Artemia cysts, and brine shrimp eggs&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto cycle system for fish culture</td>
			<td>Ningbo Hairui Technology Co., Ltd</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Maintain the fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Zeal Way</td>
			<td>G154DWS</td>
			<td>Prepare the materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Aerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Anaerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>LongYue Co., Ltd</td>
			<td>SPX</td>
			<td>For fish and plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Haier</td>
			<td>HR40-IIA2</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood plates</td>
			<td>sheep blood:Solarbio</td>
			<td>Cat. NO. TX0030</td>
			<td>Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-Dil dyes</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Cat#C7000&#160;&#160;</td>
			<td>To label the bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature shaking incubator</td>
			<td>Peiving Co., Ltd</td>
			<td>HZQ-X100</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>Bacteria and Archaea database</td>
			<td>Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ 
			Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pasteur pipette</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>bs-xh-03l</td>
			<td>Used to change water, and transfer eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dish</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-90-D</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA kits</td>
			<td>Solaribio</td>
			<td>Cat#D1600</td>
			<td>Bacterial genomic DNA extraction kits&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric pipette</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>Levo me</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exiguobacterium</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178504</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZM</td>
			<td>Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd.</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory pure water system</td>
			<td>Hitech Co., Ltd</td>
			<td>Prima-S15</td>
			<td>Prepare the agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td>With fluorescent light to observe fish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR kits</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>Cat#ET101</td>
			<td>Taq DNA Polymerase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>sp-013-10</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine (PVP-I)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>Lot#H1217005</td>
			<td>Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timing converter</td>
			<td>PinYi Co., Ltd</td>
			<td>AL-06</td>
			<td>To regulate the light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Aerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Anaerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clean workbench</td>
			<td>Airtech</td>
			<td>SW-CJ-2FD</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure flow system for fish culture</td>
			<td>Marine Biological Equipment company</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Produce water for fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178501</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, maintenance, and identification of germ-free zebrafish models from larvae to juvenile stages

Zebrafische dienen als wertvolle Modelle für die Erforschung von Wachstum, Immunität und Darmmikrobiota aufgrund ihrer genomischen Ähnlichkeiten mit Säugetieren, transparenten Embryonen, die sich in einer relativ sauberen Chorionumgebung entwickelt haben, und der extrem schnellen Entwicklung von Larven im Vergleich zu Nagetiermodellen. Keimfreie (GF) Zebrafische (Danio rerio) sind entscheidend für die Bewertung der Schadstofftoxizität und die Etablierung menschenähnlicher Krankheitsmodelle in Bezug auf mikrobielle Funktionen. Im Vergleich zu konventionell gezüchteten (CR) Modellen (Fische in gemeinsamer Haltung) ermöglichen GF-Zebrafische eine genauere Manipulation der Wirtsmikrobiota und helfen bei der Bestimmung des kausalen Zusammenhangs zwischen Mikroorganismen und Wirten. Folglich spielen sie eine entscheidende Rolle bei der Verbesserung unseres Verständnisses dieser Beziehungen. GF-Zebrafischmodelle werden jedoch in der Regel in den frühen Lebensstadien (vom Embryo bis zur Larve) erstellt und erforscht, da die Immunfunktion und die Nährstoffaufnahme eingeschränkt sind. Diese Studie optimiert die Generierung, Erhaltung und Identifizierung von frühen GF-Zebrafischmodellen ohne Fütterung und mit langfristiger Fütterung mit GF-Futter (wie Artemia sp., Salinengarnelen). Während des gesamten Prozesses wurden täglich Probenahmen und Kulturen durchgeführt und durch mehrere Detektionen, einschließlich Platten und 16S rRNA-Sequenzierung, identifiziert. Die aseptische Rate, das Überleben und die Entwicklungsindizes von GF Zebrafischen wurden erfasst, um die Qualität und Quantität der generierten Modelle sicherzustellen. Wichtig ist, dass diese Studie Details zur bakteriellen Isolierung und zu Infektionstechniken für GF Fische liefert, die die effiziente Erstellung von GF Fischmodellen von der Larve bis zum Jungstadium mit GF Futterunterstützung ermöglichen. Durch die Anwendung dieser Verfahren in der biomedizinischen Forschung können Wissenschaftler die Zusammenhänge zwischen den bakteriellen Funktionen des Darms und der Gesundheit des Wirts besser verstehen.

The microbiota (i.e., Archaea, Bacteria, Eukarya, and viruses) play crucial roles in maintaining host health and contributing to the development of various diseases by influencing physiological and pathological processes through symbiotic interactions within the intestinal barrier, epithelial surface, and mucin functions in individuals1,2,3. The composition of the microbiota across different life stages, from infancy to juvenility, adulthood, and aging, as well as its presence in various locations such as nares, oral, skin, and gut sites, is dynamically shaped by diverse habitats and environments4. The intestinal microbiota in organisms is involved in nutrient absorption, immune response, pathogen invasion, metabolic regulation, etc5,6. Studies on patients have demonstrated that disruptions in gut microbiota are related to human obesity, sleep disorders, depression, inflammatory bowel disease (IBD), neurodegenerative diseases (Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s), aging, and various cancers7,8,9. Furthermore, interactive pathways between gut microbiota and hosts involve inflammatory factors, neurotransmitters, metabolites, intestinal barrier, and oxidative stress, as observed in previous research using mice and fish models10,11.
Recently, multiple bacteria-related approaches or therapies, including potential probiotics and fecal microbiota transplantation (FMT), have been explored for these disorders in clinical and animal models. These explorations are based on discoveries related to the microbiota-gut-brain/liver/kidney axis, microbiota-derived products, and altered receptor activity12,13. However, the development, various functions, and mechanisms of the microbiota-host system are still incompletely understood and identified due to the complexity of the microbial community and the challenge of generating powerful human-like disease models.
To address these issues, germ-free (GF) animal models were urgently proposed in the mid-19th century and primarily developed during the 20th century. Subsequent refinements, including antibiotic-treated and gnotobiotic models, along with advancements in microbial detection and observation technologies, further perfected these models14,15,16. GF animals, created by erasing their own background and avoiding environmental microbes, offer an excellent strategy for exploring the interactions between microorganisms and their hosts17. Through the application of animal models and refined protocols, researchers have successfully replicated similar microbial compositions found in patients in GF mice and fish. Additionally, other GF animal models, such as dogs, chickens, and pigs, provide diverse options as research subjects18,19,20,21. This approach has enabled investigations into the potential therapeutic effects of commensal microbiomes on various diseases, including cancer immunotherapy in humans16,18. GF models offer more accurate insights into the characteristics and mechanisms of specific bacterial colonization, migration, multiplication, and interaction within hosts. This provides crucial novel insights into the occurrence and development of microbiota-related diseases22,23. The history of establishing and applying GF zebrafish in microbial research has evolved from the reports of Rawls et al. in 2004 and Bates et al. in 2006 to Melancon et al.&#39;s protocol in 201716,24,25. However, the feasibility of adult or breeding GF models is still a prolonged process, accompanied by variable longevity, success rates, and health challenges.
Among various animal models, zebrafish (Danio rerio) stands out as a critical tool for both basic and biomedical research due to its advantageous similarity to human organs and genomics, short developmental cycle, high fecundity, and transparent embryos19,26. Zebrafish, serving as reliable human disease models, offer a visual representation of physiological and pathological processes in vivo, providing insights into the attractive features of host-microbe interactions. Notably, zebrafish exhibit distinct cell lineages, allowing imaging of intestinal physiology, microbial dynamics, gonads and reproductive development, maturation of the host immune system, behavior, and metabolism27. Zebrafish embryos develop within protective chorions until hatching, becoming larvae at 3 days post-fertilization (dpf). They actively hunt for food at 5 dpf and reach sexual maturity around 3 months post-fertilization (mpf)28. The first successful germ-free (GF) zebrafish, reported by Rawls et al.24, showed that larvae fed with autoclaved feed after yolk absorption exhibited tissue necrosis from 8 dpf and total death at 20 dpf. This indicated the effects of diet or the importance of considering exogenous nutrient supply in experiments involving long-term (&#62;7 dpf) GF fish29. Subsequent studies improved the generation protocol of GF fish, employing sterile food and methods perfected in different fish models16.
However, most research on GF zebrafish models has focused on early life stages, involving bacterial infection at 5 dpf for 24 h to 48 h, with samples collected before 7 dpf at the conclusion of the experiments25,30,31. It&#39;s widely acknowledged that the microbiota in organisms, including humans and zebrafish, is colonized at the beginning of life and shaped during growth and development. The composition remains stable at adult stages, with the roles of microbiota in the host being crucial throughout life, especially in aging, neurodegenerative, metabolic-related obesity, and intestinal disease aspects3. Thus, perspectives from GF animals with longer survival can provide insights into the mechanisms of microbial roles in host organ development and functions, considering the immature immune and reproductive systems of fish larvae in early life. While bacterial strains in zebrafish intestines have been isolated and identified in previous studies, offering the potential for infecting GF animal models to select probiotics or research bacterial functions in the host19,25, the generation and application of GF fish models have primarily been restricted to early life stages. This limitation, attributed to the complex production process, high maintenance costs, and associated issues with food and immunity, hinders research efforts aimed at investigating the developmental and chronic effects of microbiota in the host.
The survival rate, behavior, growth, maturation, and overall health of fish, especially in germ-free (GF) models, are significantly influenced by feeding practices, encompassing nutrition intake and absorption during the mouth-open period from early larvae to juveniles32,33. However, one of the challenges in GF fish husbandry is the scarcity of suitable sterile diets, limiting the effectiveness of nutritional support for sustaining the growth and survival of larvae. Resolving this issue is crucial to restoring the life of GF fish, considering their developmental defense mechanisms and weak digestion abilities due to the absence of an intestinal microbiome. In terms of food, live brine shrimp (Artemia sp.) emerges as the most suitable diet for mouth-open larvae to juvenile fish. It has been observed that fish fed with live brine shrimp exhibit higher growth and survival rates compared to those fed with cooked egg yolk or other natural and synthetic baits34. While early life models of GF fish can survive with yolk support and GF larvae models can be maintained with sterile feeding, generating long-term models from larvae to juveniles and reaching sexual maturity remains challenging. Additionally, flake or powder food is limited by unequal nutritional composition and can impact water quality. In contrast, live Artemia has advantages such as survival in both salt and freshwater, small size suitable for larvae to adults, ease of batching, and higher hatching quality35. Building upon previous methods16,24,30, we have simplified the complex treatment process and addressed the diet challenge by establishing easily incubated GF live Artemia sp. as sterile food for longer durations than early-life GF fish.
This study presents an optimized protocol covering (1) generation, (2) maintenance, (3) identification of sterile rate, and (4) maintenance and feeding to ensure the growth of germ-free (GF) zebrafish from embryos to larvae and juvenile stages. The results offer preliminary evidence on the hatching, survival, growth, and sterility of GF zebrafish, along with essential indices for GF Artemia sp. as sterile food. The detailed steps in model generation and preparation of sterile live foods provide crucial technical support for constructing and applying long-term GF fish models, as well as GF Artemia sp. in microbiota-host interaction research. The protocol addresses bacterial isolation, identification, and infection on GF fish models, outlining methods for bacterial fluorescence labeling and observing their colonization in fish intestines under a microscope. GF fish, gnotobiotic fish with bacterial infection, or transferred human microbiota models will undergo various detections to elucidate their functions and effects on host immunity, digestion, behavior, transcriptomic regulation, and metabolic aspects. In the long term, this protocol can be extended to different wild-type fish species, such as marine medaka, and potentially to other selected transgenic zebrafish lines correlated to specific tissues or diseases.

Autor im Rampenlicht: Etablierung keimfreier Zebrafische für Mikrobiota-Wirt-Beziehungsstudien

Generierung, Pflege und Identifizierung von keimfreien Zebrafischmodellen von der Larve bis zum Jungstadium

The scope of this research is generation of novel, germ-free animal models, which will be helpful and powerful tools in investigation of various microbiome functions. In this field, the early germ-free fish models have been used recently, but the long-term models are still limited due to various culture conditions and the staff developmental defense. The current GF fish models are normally early life ones.Thus, the technologies including the sterile scale, the sample detection methods, and providing sterile food are very important challenges to overcome. The germ-free zebrafish model is crucial for studying host-microbiota interaction and their impacts on development and the immunity and disease. This model allows researchers to precisely manipulate the single gut bacteria and observe its effect on the transparent zebrafish embryos.It provides valuable insights into the roles of gut microbes inheriting the disease. In the future, our research will mainly focused on establishing a germ-free zebrafish model for entire life cycle to better understanding the function of the gut microbiome.

Die GF-Zebrafischmodelle können effizient hergestellt werden, indem die reichlich vorhandenen Eier von Zebrafischpaaren verwendet werden, wobei das Protokoll auf der Grundlage früherer GF-Fischmodelle optimiert wurde35. Eine einzige 6-Well-Platte kann etwa 30-48 Embryonen/Larven kultivieren, was eine umfangreiche Datenerfassung und statistische Analyse ermöglicht. Nach der sterilen Behandlung werden die GF-Embryonen in einem sauberen Inkubator kultiviert, bis sie nach 48-72 Stunden zu den Larve...

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Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte zur Gewinnung keimfreier (GF) Fischembryonen und deren Erhaltung von Larven bis zum Jugendstadium, einschließlich der Probenahme und des Nachweises ihres sterilen Status. Die Verwendung von GF-Modellen mit Infektionen ist wichtig, um die Rolle von Mikroben für die Gesundheit des Wirts zu verstehen.

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Ziel dieser Forschung ist die Generierung neuartiger, keimfreier Tiermodelle, die hilfreiche und leistungsfähige Werkzeuge bei der Untersuchung verschiedener Mikrobiomfunktionen sein werden. In diesem Bereich wurden in letzter Zeit die frühen keimfreien Fischmodelle verwendet, aber die Langzeitmodelle sind aufgrund verschiedener Kulturbedingungen und der Entwicklungsabwehr des Personals noch begrenzt. Bei den aktuellen GF-Fischmodellen handelt es sich in der Regel um Fischmodelle im frühen Leben.Daher sind die Technologien, einschließlich der sterilen Waage, der Probennachweismethoden und der Bereitstellung steriler Lebensmittel, sehr wichtige Herausforderungen, die es zu bewältigen gilt. Das keimfreie Zebrafischmodell ist entscheidend für die Untersuchung der Interaktion zwischen Wirt und Mikrobiota und deren Auswirkungen auf die Entwicklung, die Immunität und die Krankheit. Dieses Modell ermöglicht es den Forschern, die einzelnen Darmbakterien präzise zu manipulieren und ihre Wirkung auf die transparenten Zebrafischembryonen zu beobachten.Es bietet wertvolle Einblicke in die Rolle der Darmmikroben, die die Krankheit erben. In Zukunft wird sich unsere Forschung vor allem darauf konzentrieren, ein keimfreies Zebrafischmodell für den gesamten Lebenszyklus zu etablieren, um die Funktion des Darmmikrobioms besser zu verstehen.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generation of Germ-Free Zebrafish Models from Embryos

Generierung keimfreier Zebrafischmodelle aus Embryonen

GF Artemia nauplii Preparation for Chronic GF Zebrafish Nutrition

To begin, obtain 0.25 grams of Artemia cysts and rinse them with 2.4 grams per liter sodium hypochlorite for five minutes. Filter the rinsed cysts with a sterilized ultra dense filter and wash with sterilized ultrapure water for one to two minutes. After three washes, transfer them to 100 milliliters of 2.5%sterile saline and mix well.Pack 50 milliliters of treated Artemia cyst mix into a sterile 100-milliliter bottle. Using a film, seal the bottle thoroughly and place it in a shaking incubator with light. Next, using a Pasteur pipette, extract 30 milliliters of hatching Artemia nauplii from the middle and lower layers.After filtering, wash the Artemia three times with sterile ultrapure water for about one minute, and add four milliliters of sterile ultrapure water. Finally, using a disposable Pasteur pipette, retrieve actively swimming Artemia from the upper layer, wash, and prepare the solution for feeding. Microscopic observation confirmed efficient hatching of Artemia cysts after the treatment.