Name: Autore in primo piano: Definizione di pesce zebra privo di germi per studi sulla relazione microbiota-ospite
Uploaded: 2024-04-12T13:50:00
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Ringraziamo sinceramente il supporto del Chongqing Medical University Talent Project (n. R4014 a DSP e R4020 a PPJ), della National Natural Science Foundation of China (NSFC, n. 32200386 a PPJ), del Chongqing Postdoctoral Innovation Mentor Studio (X7928 DSP) e del Programma del Centro congiunto Cina-Sri Lanka per la ricerca e la dimostrazione sulla tecnologia dell'acqua dell'Accademia cinese delle scienze (CAS) / Centro congiunto Cina-Sri Lanka per l'istruzione e la ricerca di CAS.

Gli esperimenti sui pesci sono stati condotti in conformità con le linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali di Chongqing e del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università medica di Chongqing, in Cina, nonché con gli standard per gli animali da esperimento emessi dall'Ufficio statale per la qualità e la supervisione tecnica (ID approvazione: da GB14922-2001 a GBT14927-2001). Il pesce zebra (Danio rerio, wild type, ceppo AB) è stato acquistato dall'Istituto di id...

Ottimizzazione dei modelli GF Zebrafish: generazione, manutenzione e studi microbici

Passaggi critici all'interno dei protocolli di GF fish e preparazione del cibo GF Durante la generazione di modelli di pesci GF, sono state coinvolte diverse fasi critiche, tra cui la preparazione di materiali sterili, la sterilizzazione degli embrioni, il rinnovo giornaliero del GZM, la raccolta di vari campioni e l'esame sterile di ciascun campione utilizzando più metodi. Tra questi passaggi, il trattamento iniziale degli embrioni è fondamentale e decisivo per il successo dei modelli GF. Gli agent...

Il microbiota (cioè Archaea, Batteri, Eucarya e virus) svolge un ruolo cruciale nel mantenimento della salute dell'ospite e contribuisce allo sviluppo di varie malattie influenzando i processi fisiologici e patologici attraverso interazioni simbiotiche all'interno della barriera intestinale, della superficie epiteliale e delle funzioni della mucina negli individui 1,2,3. La composizione del microbiota nelle diverse fasi della vita, dall'infanzia alla giovinezza, all'età adulta e all'invecchiamento, nonché la sua presenza in vari luoghi come narici, siti orali, cutanei e intestinali, è modellata dinamicamente da diversi habitat e ambienti4. Il microbiota intestinale negli organismi è coinvolto nell'assorbimento dei nutrienti, nella risposta immunitaria, nell'invasione dei patogeni, nella regolazione metabolica, ecc. 5,6. Studi su pazienti hanno dimostrato che le interruzioni del microbiota intestinale sono correlate all'obesità umana, ai disturbi del sonno, alla depressione, alle malattie infiammatorie intestinali (IBD), alle malattie neurodegenerative (Parkinson, Alzheimer), all'invecchiamento e a vari tipi di cancro 7,8,9. Inoltre, i percorsi interattivi tra il microbiota intestinale e gli ospiti coinvolgono fattori infiammatori, neurotrasmettitori, metaboliti, barriera intestinale e stress ossidativo, come osservato in precedenti ricerche utilizzando modelli di topi e pesci10,11.
Recentemente, sono stati esplorati diversi approcci o terapie correlate ai batteri, inclusi potenziali probiotici e trapianto di microbiota fecale (FMT), per questi disturbi in modelli clinici e animali. Queste esplorazioni si basano su scoperte relative all'asse microbiota-intestino-cervello/fegato/rene, ai prodotti derivati dal microbiota e all'alterazione dell'attività dei recettori12,13. Tuttavia, lo sviluppo, le varie funzioni e i meccanismi del sistema microbiota-ospite sono ancora incompleti e identificati a causa della complessità della comunità microbica e della sfida di generare potenti modelli di malattia simili a quelli umani.
Per affrontare questi problemi, a metà delXIX secolo furono proposti con urgenza modelli animali privi di germi (GF) e sviluppati principalmente nel corso del XXsecolo. I successivi perfezionamenti, compresi i modelli trattati con antibiotici e gnotobiotici, insieme ai progressi nelle tecnologie di rilevamento e osservazione microbica, hanno ulteriormente perfezionato questi modelli 14,15,16. Gli animali GF, creati cancellando il proprio background ed evitando i microbi ambientali, offrono un'eccellente strategia per esplorare le interazioni tra i microrganismi e i loro ospiti17. Attraverso l'applicazione di modelli animali e protocolli raffinati, i ricercatori hanno replicato con successo composizioni microbiche simili trovate nei pazienti nei topi e nei pesci GF. Inoltre, altri modelli animali GF, come cani, polli e maiali, forniscono diverse opzioni come soggetti di ricerca 18,19,20,21. Questo approccio ha permesso di studiare i potenziali effetti terapeutici dei microbiomi commensali su varie malattie, tra cui l'immunoterapia del cancro nell'uomo16,18. I modelli GF offrono informazioni più accurate sulle caratteristiche e sui meccanismi di specifica colonizzazione, migrazione, moltiplicazione e interazione batterica all'interno degli ospiti. Ciò fornisce nuove informazioni cruciali sull'insorgenza e lo sviluppo di malattie correlate al microbiota22,23. La storia della creazione e dell'applicazione del pesce zebra GF nella ricerca microbica si è evoluta dai rapporti di Rawls et al. nel 2004 e Bates et al. nel 2006 al protocollo di Melancon et al. nel 2017 16,24,25. Tuttavia, la fattibilità di modelli GF adulti o riproduttori è ancora un processo prolungato, accompagnato da longevità, tassi di successo e problemi di salute variabili.
Tra i vari modelli animali, il pesce zebra (Danio rerio) si distingue come uno strumento fondamentale sia per la ricerca di base che per quella biomedica grazie alla sua vantaggiosa somiglianza con gli organi umani e la genomica, il breve ciclo di sviluppo, l'elevata fecondità e gli embrioni trasparenti19,26. I pesci zebra, che fungono da modelli affidabili di malattie umane, offrono una rappresentazione visiva dei processi fisiologici e patologici in vivo, fornendo informazioni sulle caratteristiche interessanti delle interazioni ospite-microbo. In particolare, il pesce zebra mostra linee cellulari distinte, consentendo l'imaging della fisiologia intestinale, della dinamica microbica, delle gonadi e dello sviluppo riproduttivo, della maturazione del sistema immunitario dell'ospite, del comportamento e del metabolismo27. Gli embrioni di pesce zebra si sviluppano all'interno di corioni protettivi fino alla schiusa, diventando larve a 3 giorni dopo la fecondazione (dpf). Cercano attivamente cibo a 5 dpf e raggiungono la maturità sessuale circa 3 mesi dopo la fecondazione (mpf)28. Il primo pesce zebra privo di germi (GF) di successo, riportato da Rawls et al.24, ha mostrato che le larve alimentate con mangime autoclavato dopo l'assorbimento del tuorlo mostravano necrosi tissutale da 8 dpf e morte totale a 20 dpf. Ciò ha indicato gli effetti della dieta o l'importanza di considerare l'apporto di nutrienti esogeni negli esperimenti che coinvolgono pesci GF a lungo termine (>7 dpf)29. Studi successivi hanno migliorato il protocollo di generazione dei pesci GF, impiegando cibo sterile e metodi perfezionati in diversi modelli di pesce16.
Tuttavia, la maggior parte della ricerca sui modelli di pesce zebra GF si è concentrata sulle prime fasi di vita, che coinvolgono l'infezione batterica a 5 dpf per 24-48 ore, con campioni raccolti prima di 7 dpf alla conclusione degli esperimenti 25,30,31. È ampiamente riconosciuto che il microbiota negli organismi, compresi gli esseri umani e il pesce zebra, è colonizzato all'inizio della vita e modellato durante la crescita e lo sviluppo. La composizione rimane stabile negli stadi adulti, con i ruoli del microbiota nell'ospite cruciali per tutta la vita, specialmente negli aspetti dell'invecchiamento, dell'obesità neurodegenerativa e metabolica e delle malattie intestinali3. Pertanto, le prospettive degli animali GF con sopravvivenza più lunga possono fornire informazioni sui meccanismi dei ruoli microbici nello sviluppo e nelle funzioni degli organi ospiti, considerando i sistemi immunitari e riproduttivi immaturi delle larve di pesce nei primi anni di vita. Mentre i ceppi batterici nell'intestino del pesce zebra sono stati isolati e identificati in studi precedenti, offrendo il potenziale per infettare i modelli animali GF per selezionare probiotici o ricercare funzioni batteriche nell'ospite19,25, la generazione e l'applicazione di modelli di pesce GF sono state principalmente limitate alle prime fasi della vita. Questa limitazione, attribuita al complesso processo di produzione, agli elevati costi di manutenzione e ai problemi associati al cibo e all'immunità, ostacola gli sforzi di ricerca volti a studiare gli effetti dello sviluppo e cronici del microbiota nell'ospite.
Il tasso di sopravvivenza, il comportamento, la crescita, la maturazione e la salute generale dei pesci, specialmente nei modelli privi di germi (GF), sono significativamente influenzati dalle pratiche alimentari, che comprendono l'assunzione e l'assorbimento del nutrimento durante il periodo di apertura della bocca dalle prime larve ai giovani32,33. Tuttavia, una delle sfide nell'allevamento di pesci GF è la scarsità di diete sterili adeguate, che limita l'efficacia del supporto nutrizionale per sostenere la crescita e la sopravvivenza delle larve. Risolvere questo problema è fondamentale per ripristinare la vita dei pesci GF, considerando i loro meccanismi di difesa dello sviluppo e le deboli capacità di digestione dovute all'assenza di un microbioma intestinale. In termini di cibo, i gamberetti in salamoia vivi (Artemia sp.) emergono come la dieta più adatta per le larve a bocca aperta e per i pesci giovani. È stato osservato che i pesci nutriti con artemia salina vivi mostrano tassi di crescita e sopravvivenza più elevati rispetto a quelli alimentati con tuorlo d'uovo cotto o altre esche naturali e sintetiche34. Mentre i modelli di vita precoce dei pesci GF possono sopravvivere con il supporto del tuorlo e i modelli di larve GF possono essere mantenuti con l'alimentazione sterile, la generazione di modelli a lungo termine dalle larve ai giovani e il raggiungimento della maturità sessuale rimane una sfida. Inoltre, il cibo in scaglie o in polvere è limitato da una composizione nutrizionale ineguale e può influire sulla qualità dell'acqua. Al contrario, l'artemia viva presenta vantaggi come la sopravvivenza sia in acqua salata che in acqua dolce, dimensioni ridotte adatte alle larve agli adulti, facilità di dosaggio e maggiore qualità di schiusa35. Basandoci sui metodi precedenti 16,24,30, abbiamo semplificato il complesso processo di trattamento e affrontato la sfida della dieta stabilendo Artemia sp. GF viva facilmente incubata come alimento sterile per periodi più lunghi rispetto ai pesci GF all'inizio della vita.
Questo studio presenta un protocollo ottimizzato che copre (1) generazione, (2) mantenimento, (3) identificazione del tasso di sterilità e (4) mantenimento e alimentazione per garantire la crescita di zebrafish privo di germi (GF) dagli embrioni alle larve e agli stadi giovanili. I risultati offrono prove preliminari sulla schiusa, la sopravvivenza, la crescita e la sterilità del pesce zebra GF, insieme agli indici essenziali per GF Artemia sp. come alimento sterile. Le fasi dettagliate nella generazione del modello e nella preparazione di alimenti vivi sterili forniscono un supporto tecnico cruciale per la costruzione e l'applicazione di modelli di pesce GF a lungo termine, nonché GF Artemia sp. nella ricerca sull'interazione microbiota-ospite. Il protocollo affronta l'isolamento, l'identificazione e l'infezione batterica su modelli di pesci GF, delineando metodi per l'etichettatura della fluorescenza batterica e osservando la loro colonizzazione nell'intestino dei pesci al microscopio. I pesci GF, i pesci gnotobiotici con infezione batterica o i modelli di microbiota umano trasferiti saranno sottoposti a vari rilevamenti per chiarire le loro funzioni ed effetti sull'immunità dell'ospite, sulla digestione, sul comportamento, sulla regolazione trascrittomica e sugli aspetti metabolici. A lungo termine, questo protocollo può essere esteso a diverse specie ittiche selvatiche, come il medaka marino, e potenzialmente ad altre linee di pesce zebra transgenico selezionate correlate a tessuti o malattie specifici.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>AB-GZM</td>
			<td>Amphotericin:Solarbio;&#160; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.</td>
			<td>Amphotericin:CAS:1397-89-3; 
			kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.</td>
			<td>49.6 mL GZM, 50 &#181;L amphotericin stock solution (250 &#181;g/mL), 25 &#181;L kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 &#181;L ampicillin stock solution (20 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-15-M</td>
			<td>To collect samples, and hold agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates, 24-, 48- well plates</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>11112</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aeronomas</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178499</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic work station</td>
			<td>GENE SCIENCE</td>
			<td>E200G</td>
			<td>Bacterial isolation, sterile testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis</td>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>v6.07</td>
			<td>To analysis the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API 20 E kits</td>
			<td>&#160;BioMerieux SA, France</td>
			<td>No.1005915090</td>
			<td>Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia (Brine shrimp)</td>
			<td>Shangjia Aquarium Co., Ltd.</td>
			<td>Aquamaster brand</td>
			<td>Artemia cysts, and brine shrimp eggs&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto cycle system for fish culture</td>
			<td>Ningbo Hairui Technology Co., Ltd</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Maintain the fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Zeal Way</td>
			<td>G154DWS</td>
			<td>Prepare the materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Aerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Anaerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>LongYue Co., Ltd</td>
			<td>SPX</td>
			<td>For fish and plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Haier</td>
			<td>HR40-IIA2</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood plates</td>
			<td>sheep blood:Solarbio</td>
			<td>Cat. NO. TX0030</td>
			<td>Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-Dil dyes</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Cat#C7000&#160;&#160;</td>
			<td>To label the bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature shaking incubator</td>
			<td>Peiving Co., Ltd</td>
			<td>HZQ-X100</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>Bacteria and Archaea database</td>
			<td>Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ 
			Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pasteur pipette</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>bs-xh-03l</td>
			<td>Used to change water, and transfer eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dish</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-90-D</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA kits</td>
			<td>Solaribio</td>
			<td>Cat#D1600</td>
			<td>Bacterial genomic DNA extraction kits&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric pipette</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>Levo me</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exiguobacterium</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178504</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZM</td>
			<td>Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd.</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory pure water system</td>
			<td>Hitech Co., Ltd</td>
			<td>Prima-S15</td>
			<td>Prepare the agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td>With fluorescent light to observe fish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR kits</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>Cat#ET101</td>
			<td>Taq DNA Polymerase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>sp-013-10</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine (PVP-I)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>Lot#H1217005</td>
			<td>Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timing converter</td>
			<td>PinYi Co., Ltd</td>
			<td>AL-06</td>
			<td>To regulate the light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Aerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Anaerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clean workbench</td>
			<td>Airtech</td>
			<td>SW-CJ-2FD</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure flow system for fish culture</td>
			<td>Marine Biological Equipment company</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Produce water for fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178501</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, maintenance, and identification of germ-free zebrafish models from larvae to juvenile stages

I pesci zebra fungono da modelli preziosi per la ricerca sulla crescita, l'immunità e il microbiota intestinale grazie alle loro somiglianze genomiche con i mammiferi, agli embrioni trasparenti sviluppati in un ambiente corionico relativamente pulito e allo sviluppo estremamente rapido delle larve rispetto ai modelli di roditori. Il pesce zebra privo di germi (Danio rerio) è fondamentale per valutare la tossicità degli inquinanti e stabilire modelli di malattie simili a quelle umane correlate alle funzioni microbiche. Rispetto ai modelli allevati in modo convenzionale (CR) (pesci in allevamento comune), il pesce zebra GF consente una manipolazione più accurata del microbiota dell'ospite, aiutando a determinare la relazione causale tra microrganismi e ospiti. Di conseguenza, svolgono un ruolo fondamentale nel far progredire la nostra comprensione di queste relazioni. Tuttavia, i modelli di pesce zebra GF sono tipicamente generati e studiati durante le prime fasi di vita (dagli embrioni alle larve) a causa delle limitazioni nella funzione immunitaria e nell'assorbimento dei nutrienti. Questo studio ottimizza la generazione, il mantenimento e l'identificazione dei primi modelli di pesce zebra GF senza alimentazione e con alimentazione a lungo termine utilizzando alimenti GF (come Artemia sp., artemia salina). Durante tutto il processo, sono stati eseguiti campionamenti e colture giornalieri e identificati attraverso rilevamenti multipli, tra cui piastre e sequenziamento dell'rRNA 16S. Sono stati registrati il tasso asettico, la sopravvivenza e gli indici di sviluppo del pesce zebra GF per garantire la qualità e la quantità dei modelli generati. È importante sottolineare che questo studio fornisce dettagli sull'isolamento batterico e sulle tecniche di infezione per i pesci GF, consentendo la creazione efficiente di modelli di pesci GF dalle larve agli stadi giovanili con supporto alimentare GF. Applicando queste procedure nella ricerca biomedica, gli scienziati possono comprendere meglio le relazioni tra le funzioni batteriche intestinali e la salute dell'ospite.

The microbiota (i.e., Archaea, Bacteria, Eukarya, and viruses) play crucial roles in maintaining host health and contributing to the development of various diseases by influencing physiological and pathological processes through symbiotic interactions within the intestinal barrier, epithelial surface, and mucin functions in individuals1,2,3. The composition of the microbiota across different life stages, from infancy to juvenility, adulthood, and aging, as well as its presence in various locations such as nares, oral, skin, and gut sites, is dynamically shaped by diverse habitats and environments4. The intestinal microbiota in organisms is involved in nutrient absorption, immune response, pathogen invasion, metabolic regulation, etc5,6. Studies on patients have demonstrated that disruptions in gut microbiota are related to human obesity, sleep disorders, depression, inflammatory bowel disease (IBD), neurodegenerative diseases (Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s), aging, and various cancers7,8,9. Furthermore, interactive pathways between gut microbiota and hosts involve inflammatory factors, neurotransmitters, metabolites, intestinal barrier, and oxidative stress, as observed in previous research using mice and fish models10,11.
Recently, multiple bacteria-related approaches or therapies, including potential probiotics and fecal microbiota transplantation (FMT), have been explored for these disorders in clinical and animal models. These explorations are based on discoveries related to the microbiota-gut-brain/liver/kidney axis, microbiota-derived products, and altered receptor activity12,13. However, the development, various functions, and mechanisms of the microbiota-host system are still incompletely understood and identified due to the complexity of the microbial community and the challenge of generating powerful human-like disease models.
To address these issues, germ-free (GF) animal models were urgently proposed in the mid-19th century and primarily developed during the 20th century. Subsequent refinements, including antibiotic-treated and gnotobiotic models, along with advancements in microbial detection and observation technologies, further perfected these models14,15,16. GF animals, created by erasing their own background and avoiding environmental microbes, offer an excellent strategy for exploring the interactions between microorganisms and their hosts17. Through the application of animal models and refined protocols, researchers have successfully replicated similar microbial compositions found in patients in GF mice and fish. Additionally, other GF animal models, such as dogs, chickens, and pigs, provide diverse options as research subjects18,19,20,21. This approach has enabled investigations into the potential therapeutic effects of commensal microbiomes on various diseases, including cancer immunotherapy in humans16,18. GF models offer more accurate insights into the characteristics and mechanisms of specific bacterial colonization, migration, multiplication, and interaction within hosts. This provides crucial novel insights into the occurrence and development of microbiota-related diseases22,23. The history of establishing and applying GF zebrafish in microbial research has evolved from the reports of Rawls et al. in 2004 and Bates et al. in 2006 to Melancon et al.&#39;s protocol in 201716,24,25. However, the feasibility of adult or breeding GF models is still a prolonged process, accompanied by variable longevity, success rates, and health challenges.
Among various animal models, zebrafish (Danio rerio) stands out as a critical tool for both basic and biomedical research due to its advantageous similarity to human organs and genomics, short developmental cycle, high fecundity, and transparent embryos19,26. Zebrafish, serving as reliable human disease models, offer a visual representation of physiological and pathological processes in vivo, providing insights into the attractive features of host-microbe interactions. Notably, zebrafish exhibit distinct cell lineages, allowing imaging of intestinal physiology, microbial dynamics, gonads and reproductive development, maturation of the host immune system, behavior, and metabolism27. Zebrafish embryos develop within protective chorions until hatching, becoming larvae at 3 days post-fertilization (dpf). They actively hunt for food at 5 dpf and reach sexual maturity around 3 months post-fertilization (mpf)28. The first successful germ-free (GF) zebrafish, reported by Rawls et al.24, showed that larvae fed with autoclaved feed after yolk absorption exhibited tissue necrosis from 8 dpf and total death at 20 dpf. This indicated the effects of diet or the importance of considering exogenous nutrient supply in experiments involving long-term (&#62;7 dpf) GF fish29. Subsequent studies improved the generation protocol of GF fish, employing sterile food and methods perfected in different fish models16.
However, most research on GF zebrafish models has focused on early life stages, involving bacterial infection at 5 dpf for 24 h to 48 h, with samples collected before 7 dpf at the conclusion of the experiments25,30,31. It&#39;s widely acknowledged that the microbiota in organisms, including humans and zebrafish, is colonized at the beginning of life and shaped during growth and development. The composition remains stable at adult stages, with the roles of microbiota in the host being crucial throughout life, especially in aging, neurodegenerative, metabolic-related obesity, and intestinal disease aspects3. Thus, perspectives from GF animals with longer survival can provide insights into the mechanisms of microbial roles in host organ development and functions, considering the immature immune and reproductive systems of fish larvae in early life. While bacterial strains in zebrafish intestines have been isolated and identified in previous studies, offering the potential for infecting GF animal models to select probiotics or research bacterial functions in the host19,25, the generation and application of GF fish models have primarily been restricted to early life stages. This limitation, attributed to the complex production process, high maintenance costs, and associated issues with food and immunity, hinders research efforts aimed at investigating the developmental and chronic effects of microbiota in the host.
The survival rate, behavior, growth, maturation, and overall health of fish, especially in germ-free (GF) models, are significantly influenced by feeding practices, encompassing nutrition intake and absorption during the mouth-open period from early larvae to juveniles32,33. However, one of the challenges in GF fish husbandry is the scarcity of suitable sterile diets, limiting the effectiveness of nutritional support for sustaining the growth and survival of larvae. Resolving this issue is crucial to restoring the life of GF fish, considering their developmental defense mechanisms and weak digestion abilities due to the absence of an intestinal microbiome. In terms of food, live brine shrimp (Artemia sp.) emerges as the most suitable diet for mouth-open larvae to juvenile fish. It has been observed that fish fed with live brine shrimp exhibit higher growth and survival rates compared to those fed with cooked egg yolk or other natural and synthetic baits34. While early life models of GF fish can survive with yolk support and GF larvae models can be maintained with sterile feeding, generating long-term models from larvae to juveniles and reaching sexual maturity remains challenging. Additionally, flake or powder food is limited by unequal nutritional composition and can impact water quality. In contrast, live Artemia has advantages such as survival in both salt and freshwater, small size suitable for larvae to adults, ease of batching, and higher hatching quality35. Building upon previous methods16,24,30, we have simplified the complex treatment process and addressed the diet challenge by establishing easily incubated GF live Artemia sp. as sterile food for longer durations than early-life GF fish.
This study presents an optimized protocol covering (1) generation, (2) maintenance, (3) identification of sterile rate, and (4) maintenance and feeding to ensure the growth of germ-free (GF) zebrafish from embryos to larvae and juvenile stages. The results offer preliminary evidence on the hatching, survival, growth, and sterility of GF zebrafish, along with essential indices for GF Artemia sp. as sterile food. The detailed steps in model generation and preparation of sterile live foods provide crucial technical support for constructing and applying long-term GF fish models, as well as GF Artemia sp. in microbiota-host interaction research. The protocol addresses bacterial isolation, identification, and infection on GF fish models, outlining methods for bacterial fluorescence labeling and observing their colonization in fish intestines under a microscope. GF fish, gnotobiotic fish with bacterial infection, or transferred human microbiota models will undergo various detections to elucidate their functions and effects on host immunity, digestion, behavior, transcriptomic regulation, and metabolic aspects. In the long term, this protocol can be extended to different wild-type fish species, such as marine medaka, and potentially to other selected transgenic zebrafish lines correlated to specific tissues or diseases.

Autore in primo piano: Definizione di pesce zebra privo di germi per studi sulla relazione microbiota-ospite

Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili

The scope of this research is generation of novel, germ-free animal models, which will be helpful and powerful tools in investigation of various microbiome functions. In this field, the early germ-free fish models have been used recently, but the long-term models are still limited due to various culture conditions and the staff developmental defense. The current GF fish models are normally early life ones.Thus, the technologies including the sterile scale, the sample detection methods, and providing sterile food are very important challenges to overcome. The germ-free zebrafish model is crucial for studying host-microbiota interaction and their impacts on development and the immunity and disease. This model allows researchers to precisely manipulate the single gut bacteria and observe its effect on the transparent zebrafish embryos.It provides valuable insights into the roles of gut microbes inheriting the disease. In the future, our research will mainly focused on establishing a germ-free zebrafish model for entire life cycle to better understanding the function of the gut microbiome.

I modelli GF zebrafish possono essere prodotti in modo efficiente utilizzando le abbondanti uova deposte dalle coppie di zebrafish, con il protocollo ottimizzato sulla base dei precedenti modelli di pesce GF35. Una singola piastra a 6 pozzetti può coltivare circa 30-48 embrioni/larve, consentendo un'ampia raccolta di dati e analisi statistiche. Dopo il trattamento sterile, gli embrioni GF vengono coltivati in un'incubatrice pulita fino alla schiusa in larve a 48-72 ore e cambiati GZM ogni giorno ...

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Questo protocollo delinea i passaggi principali per ottenere embrioni di pesce privi di germi (GF) e mantenerli dalle larve fino allo stadio giovanile, compreso il campionamento e il rilevamento del loro stato di sterilità. L'uso di modelli GF con infezione è importante per comprendere il ruolo dei microbi nella salute dell'ospite.

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Lo scopo di questa ricerca è la generazione di nuovi modelli animali privi di germi, che saranno strumenti utili e potenti nello studio di varie funzioni del microbioma. In questo campo, i primi modelli di pesci privi di germi sono stati utilizzati di recente, ma i modelli a lungo termine sono ancora limitati a causa delle varie condizioni di coltura e della difesa dello sviluppo del personale. Gli attuali modelli di pesci GF sono normalmente quelli dei primi anni di vita.Pertanto, le tecnologie tra cui la bilancia sterile, i metodi di rilevamento dei campioni e la fornitura di cibo sterile sono sfide molto importanti da superare. Il modello di pesce zebra privo di germi è fondamentale per studiare l'interazione ospite-microbiota e il loro impatto sullo sviluppo, sull'immunità e sulla malattia. Questo modello consente ai ricercatori di manipolare con precisione i singoli batteri intestinali e osservarne l'effetto sugli embrioni trasparenti di pesce zebra.Fornisce preziose informazioni sui ruoli dei microbi intestinali che ereditano la malattia. In futuro, la nostra ricerca si concentrerà principalmente sulla creazione di un modello di zebrafish privo di germi per l'intero ciclo di vita per comprendere meglio la funzione del microbioma intestinale.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Generation of Germ-Free Zebrafish Models from Embryos

Generazione di modelli di zebrafish privi di germi da embrioni

GF Artemia nauplii Preparation for Chronic GF Zebrafish Nutrition

To begin, obtain 0.25 grams of Artemia cysts and rinse them with 2.4 grams per liter sodium hypochlorite for five minutes. Filter the rinsed cysts with a sterilized ultra dense filter and wash with sterilized ultrapure water for one to two minutes. After three washes, transfer them to 100 milliliters of 2.5%sterile saline and mix well.Pack 50 milliliters of treated Artemia cyst mix into a sterile 100-milliliter bottle. Using a film, seal the bottle thoroughly and place it in a shaking incubator with light. Next, using a Pasteur pipette, extract 30 milliliters of hatching Artemia nauplii from the middle and lower layers.After filtering, wash the Artemia three times with sterile ultrapure water for about one minute, and add four milliliters of sterile ultrapure water. Finally, using a disposable Pasteur pipette, retrieve actively swimming Artemia from the upper layer, wash, and prepare the solution for feeding. Microscopic observation confirmed efficient hatching of Artemia cysts after the treatment.