Name: Forfatter Spotlight: Etablering av bakteriefri sebrafisk for studier av mikrobiota-vertsforhold
Uploaded: 2024-04-12T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Establishing Germ-Free Zebrafish for Microbiota-Host Relationship Studies at JoVE.com

Vi takker oppriktig støtten fra Chongqing Medical University Talent Project (nr. R4014 til DSP og R4020 til PPJ), National Natural Science Foundation of China (NSFC, No.32200386 til PPJ), Chongqing Postdoctoral Innovation Mentor Studio (X7928 DSP), og Program for Kina-Sri Lanka Joint Center for Water Technology Research and Demonstration av Chinese Academy of Sciences (CAS) / Kina-Sri Lanka Joint Center for utdanning og forskning ved CAS.

Fiskeforsøkene ble utført i samsvar med retningslinjene fra Animal Care and Use Committee of Chongqing og Institutional Animal Care and Use Committee of Chongqing Medical University, Kina, samt standarder for forsøksdyr utstedt av State Bureau of Quality and Technical Supervision (Approval ID: GB14922-2001 til GBT14927-2001). Sebrafisk (Danio rerio, villtype, AB-stamme) ble hentet fra Institutt for hydrobiologi, Det kinesiske vitenskapsakademi, og vedlikeholdt i laboratoriet etter tidligere rapporterte prosed...

Optimalisering av GF sebrafiskmodeller: generering, vedlikehold og mikrobielle studier

Kritiske trinn innenfor protokollene for GF fisk og GF matlaging Under genereringen av GF-fiskemodeller var flere kritiske trinn involvert, inkludert fremstilling av sterile materialer, sterilisering av embryoer, daglig fornyelse av GZM, innsamling av forskjellige prøver og steril undersøkelse av hver prøve ved hjelp av flere metoder. Blant disse trinnene er den første behandlingen av embryoer grunnleggende og avgjørende for suksessen til GF-modellene. Kontrollmidler, deres konsentrasjoner og beh...

Mikrobiota (dvs. Archaea, bakterier, eukarya og virus) spiller avgjørende roller i å opprettholde vertshelsen og bidra til utviklingen av ulike sykdommer ved å påvirke fysiologiske og patologiske prosesser gjennom symbiotiske interaksjoner i tarmbarrieren, epiteloverflaten og mucinfunksjonene hos individer 1,2,3. Sammensetningen av mikrobiota på tvers av forskjellige livsstadier, fra barndom til ungdom, voksen alder og aldring, samt dens tilstedeværelse på forskjellige steder som nares, oral, hud og tarmsteder, er dynamisk formet av ulike habitater og miljøer4. Tarmmikrobiota i organismer er involvert i næringsopptak, immunrespons, patogeninvasjon, metabolsk regulering, etc 5,6. Studier på pasienter har vist at forstyrrelser i tarmmikrobiota er relatert til menneskelig fedme, søvnforstyrrelser, depresjon, inflammatorisk tarmsykdom (IBD), nevrodegenerative sykdommer (Parkinsons, Alzheimers), aldring og forskjellige kreftformer 7,8,9. Videre involverer interaktive veier mellom tarmmikrobiota og verter inflammatoriske faktorer, nevrotransmittere, metabolitter, tarmbarriere og oksidativt stress, som observert i tidligere forskning ved bruk av mus og fiskemodeller 10,11.
Nylig har flere bakterierelaterte tilnærminger eller terapier, inkludert potensielle probiotika og fekal mikrobiotatransplantasjon (FMT), blitt utforsket for disse lidelsene i kliniske og dyremodeller. Disse undersøkelsene er basert på funn relatert til mikrobiota-tarm-hjerne/lever/nyre-aksen, mikrobiota-avledede produkter og endret reseptoraktivitet12,13. Imidlertid er utviklingen, ulike funksjoner og mekanismer i mikrobiota-vertssystemet fortsatt ufullstendig forstått og identifisert på grunn av kompleksiteten i det mikrobielle samfunnet og utfordringen med å generere kraftige menneskelignende sykdomsmodeller.
For å løse disse problemene ble bakteriefrie (GF) dyremodeller raskt foreslått i midtenav det 19. århundre og primært utviklet i løpetav det 20. århundre. Påfølgende forbedringer, inkludert antibiotikabehandlede og gnotobiotiske modeller, sammen med fremskritt innen mikrobiell deteksjon og observasjonsteknologi, perfeksjonerte disse modellene ytterligere 14,15,16. GF-dyr, skapt ved å slette sin egen bakgrunn og unngå miljømikrober, tilbyr en utmerket strategi for å utforske samspillet mellom mikroorganismer og deres verter17. Gjennom bruk av dyremodeller og raffinerte protokoller har forskere vellykket replikert lignende mikrobielle sammensetninger funnet hos pasienter i GF-mus og fisk. I tillegg gir andre GF-dyremodeller, som hunder, kyllinger og griser, forskjellige alternativer som forskningspersoner 18,19,20,21. Denne tilnærmingen har gjort det mulig å undersøke potensielle terapeutiske effekter av kommensale mikrobiomer på ulike sykdommer, inkludert kreftimmunterapi hos mennesker16,18. GF-modeller gir mer nøyaktig innsikt i egenskapene og mekanismene til spesifikk bakteriell kolonisering, migrasjon, multiplikasjon og interaksjon i verter. Dette gir avgjørende ny innsikt i forekomsten og utviklingen av mikrobiota-relaterte sykdommer22,23. Historien om å etablere og anvende GF sebrafisk i mikrobiell forskning har utviklet seg fra rapportene til Rawls et al. i 2004 og Bates et al. i 2006 til Melancon et al. sin protokoll i 2017 16,24,25. Imidlertid er muligheten for voksne eller avl GF-modeller fortsatt en langvarig prosess, ledsaget av variabel levetid, suksessrate og helseutfordringer.
Blant ulike dyremodeller skiller sebrafisk (Danio rerio) seg ut som et kritisk verktøy for både grunnleggende og biomedisinsk forskning på grunn av sin fordelaktige likhet med menneskelige organer og genomikk, kort utviklingssyklus, høy fruktbarhet og gjennomsiktige embryoer19,26. Sebrafisk, som tjener som pålitelige sykdomsmodeller for mennesker, tilbyr en visuell representasjon av fysiologiske og patologiske prosesser in vivo, og gir innsikt i de attraktive egenskapene til vertsmikrobeinteraksjoner. Spesielt viser sebrafisk forskjellige cellelinjer, noe som tillater avbildning av tarmfysiologi, mikrobiell dynamikk, gonader og reproduktiv utvikling, modning av vertsimmunsystemet, oppførsel og metabolisme27. Sebrafiskembryoer utvikler seg innenfor beskyttende korioner til klekking, og blir larver 3 dager etter befruktning (dpf). De jakter aktivt på mat ved 5 dpf og når seksuell modenhet rundt 3 måneder etter befruktning (mpf)28. Den første vellykkede bakteriefrie (GF) sebrafisken, rapportert av Rawls et al.24, viste at larver fôret med autoklavfôr etter at eggeplommeabsorpsjon viste vevnekrose fra 8 dpf og total død ved 20 dpf. Dette indikerte effekten av diett eller viktigheten av å vurdere eksogen næringstilførsel i eksperimenter med langvarig (>7 dpf) GF-fisk29. Etterfølgende studier forbedret genereringsprotokollen til GF-fisk, ved å bruke steril mat og metoder perfeksjonert i forskjellige fiskemodeller16.
Imidlertid har det meste av forskningen på GF sebrafiskmodeller fokusert på tidlige livsstadier, som involverer bakteriell infeksjon ved 5 dpf i 24 timer til 48 timer, med prøver samlet inn før 7 dpf ved avslutningen av forsøkene 25,30,31. Det er allment anerkjent at mikrobiota i organismer, inkludert mennesker og sebrafisk, er kolonisert i begynnelsen av livet og formet under vekst og utvikling. Sammensetningen forblir stabil i voksne stadier, med mikrobiotaens roller i verten som avgjørende gjennom livet, spesielt i aldring, neurodegenerativ, metabolsk relatert fedme og tarmsykdomsaspekter3. Dermed kan perspektiver fra GF-dyr med lengre overlevelse gi innsikt i mekanismene for mikrobielle roller i vertsorganutvikling og funksjoner, med tanke på de umodne immun- og reproduksjonssystemene til fiskelarver i tidlig liv. Mens bakteriestammer i sebrafisktarmene har blitt isolert og identifisert i tidligere studier, og gir potensialet for å infisere GF-dyremodeller for å velge probiotika eller forske på bakterielle funksjoner i verten19,25, har generering og anvendelse av GF-fiskemodeller primært vært begrenset til tidlige livsstadier. Denne begrensningen, som tilskrives den komplekse produksjonsprosessen, høye vedlikeholdskostnader og tilhørende problemer med mat og immunitet, hindrer forskningsinnsats for å undersøke utviklingsmessige og kroniske effekter av mikrobiota i verten.
Overlevelsesraten, atferden, veksten, modningen og den generelle helsen til fisk, spesielt i bakteriefrie (GF) modeller, påvirkes betydelig av fôringspraksis, som omfatter næringsinntak og absorpsjon i den munnåpne perioden fra tidlige larver til ungdyr32,33. En av utfordringene i GF-fiskehold er imidlertid mangelen på egnede sterile dietter, noe som begrenser effektiviteten av ernæringsstøtte for å opprettholde larvenes vekst og overlevelse. Å løse dette problemet er avgjørende for å gjenopprette livet til GF-fisk, med tanke på deres utviklingsforsvarsmekanismer og svake fordøyelsesevner på grunn av fraværet av et tarmmikrobiom. Når det gjelder mat, fremstår levende saltlakereker (Artemia sp.) som den mest egnede dietten for munnåpne larver til ungfisk. Det har blitt observert at fisk fôret med levende saltlake reker viser høyere vekst og overlevelse sammenlignet med de som er matet med kokt eggeplomme eller andre naturlige og syntetiske agn34. Mens tidlige livsmodeller av GF-fisk kan overleve med eggeplommestøtte og GF-larvemodeller kan opprettholdes med steril fôring, er det fortsatt utfordrende å generere langsiktige modeller fra larver til ungdyr og nå seksuell modenhet. I tillegg er flak eller pulvermat begrenset av ulik ernæringsmessig sammensetning og kan påvirke vannkvaliteten. I kontrast har levende Artemia fordeler som overlevelse i både salt og ferskvann, liten størrelse egnet for larver til voksne, enkel batching og høyere klekkekvalitet35. Basert på tidligere metoder 16,24,30 har vi forenklet den komplekse behandlingsprosessen og adressert diettutfordringen ved å etablere lett inkubert GF levende Artemia sp. som steril mat av lengre varighet enn GF-fisk i tidlig liv.
Denne studien presenterer en optimalisert protokoll som dekker (1) generasjon, (2) vedlikehold, (3) identifisering av steril hastighet og (4) vedlikehold og fôring for å sikre vekst av bakteriefri (GF) sebrafisk fra embryoer til larver og juvenile stadier. Resultatene gir foreløpige bevis på klekking, overlevelse, vekst og sterilitet av GF sebrafisk, sammen med viktige indekser for GF Artemia sp. som steril mat. De detaljerte trinnene i modellgenerering og tilberedning av sterile levende matvarer gir avgjørende teknisk støtte for å konstruere og anvende langsiktige GF-fiskemodeller, samt GF Artemia sp. i mikrobiota-vertinteraksjonsforskning. Protokollen adresserer bakteriell isolasjon, identifikasjon og infeksjon på GF fiskemodeller, skisserer metoder for bakteriell fluorescensmerking og observerer deres kolonisering i fisketarmene under et mikroskop. GF-fisk, gnotobiotisk fisk med bakteriell infeksjon eller overførte humane mikrobiotamodeller vil gjennomgå forskjellige deteksjoner for å belyse deres funksjoner og effekter på vertsimmunitet, fordøyelse, oppførsel, transkriptomisk regulering og metabolske aspekter. På lang sikt kan denne protokollen utvides til forskjellige villtype fiskearter, som marine medaka, og potensielt til andre utvalgte transgene sebrafisklinjer korrelert med spesifikke vev eller sykdommer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AB-GZM</td>
			<td>Amphotericin:Solarbio;&#160; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.</td>
			<td>Amphotericin:CAS:1397-89-3; 
			kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.</td>
			<td>49.6 mL GZM, 50 &#181;L amphotericin stock solution (250 &#181;g/mL), 25 &#181;L kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 &#181;L ampicillin stock solution (20 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-15-M</td>
			<td>To collect samples, and hold agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates, 24-, 48- well plates</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>11112</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aeronomas</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178499</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic work station</td>
			<td>GENE SCIENCE</td>
			<td>E200G</td>
			<td>Bacterial isolation, sterile testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis</td>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>v6.07</td>
			<td>To analysis the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API 20 E kits</td>
			<td>&#160;BioMerieux SA, France</td>
			<td>No.1005915090</td>
			<td>Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia (Brine shrimp)</td>
			<td>Shangjia Aquarium Co., Ltd.</td>
			<td>Aquamaster brand</td>
			<td>Artemia cysts, and brine shrimp eggs&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto cycle system for fish culture</td>
			<td>Ningbo Hairui Technology Co., Ltd</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Maintain the fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Zeal Way</td>
			<td>G154DWS</td>
			<td>Prepare the materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Aerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Anaerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>LongYue Co., Ltd</td>
			<td>SPX</td>
			<td>For fish and plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Haier</td>
			<td>HR40-IIA2</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood plates</td>
			<td>sheep blood:Solarbio</td>
			<td>Cat. NO. TX0030</td>
			<td>Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-Dil dyes</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Cat#C7000&#160;&#160;</td>
			<td>To label the bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature shaking incubator</td>
			<td>Peiving Co., Ltd</td>
			<td>HZQ-X100</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>Bacteria and Archaea database</td>
			<td>Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ 
			Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pasteur pipette</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>bs-xh-03l</td>
			<td>Used to change water, and transfer eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dish</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-90-D</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA kits</td>
			<td>Solaribio</td>
			<td>Cat#D1600</td>
			<td>Bacterial genomic DNA extraction kits&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric pipette</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>Levo me</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exiguobacterium</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178504</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZM</td>
			<td>Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd.</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory pure water system</td>
			<td>Hitech Co., Ltd</td>
			<td>Prima-S15</td>
			<td>Prepare the agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td>With fluorescent light to observe fish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR kits</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>Cat#ET101</td>
			<td>Taq DNA Polymerase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>sp-013-10</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine (PVP-I)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>Lot#H1217005</td>
			<td>Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timing converter</td>
			<td>PinYi Co., Ltd</td>
			<td>AL-06</td>
			<td>To regulate the light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Aerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Anaerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clean workbench</td>
			<td>Airtech</td>
			<td>SW-CJ-2FD</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure flow system for fish culture</td>
			<td>Marine Biological Equipment company</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Produce water for fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178501</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, maintenance, and identification of germ-free zebrafish models from larvae to juvenile stages

Sebrafisk tjener som verdifulle modeller for forskning på vekst, immunitet og tarmmikrobiota på grunn av deres genomiske likheter med pattedyr, gjennomsiktige embryoer utviklet i et relativt rent korionmiljø og ekstremt rask utvikling av larver sammenlignet med gnagermodeller. Bakteriefri (GF) sebrafisk (Danio rerio) er avgjørende for å evaluere toksisitet av forurensende stoffer og etablere menneskelignende sykdomsmodeller relatert til mikrobielle funksjoner. Sammenlignet med konvensjonelt hevede (CR) modeller (fisk i vanlig husdyrhold), tillater GF sebrafisk mer nøyaktig manipulering av vertsmikrobiotaen, noe som hjelper til med å bestemme årsakssammenhengen mellom mikroorganismer og verter. Følgelig spiller de en kritisk rolle i å fremme vår forståelse av disse forholdene. Imidlertid genereres og forskes GF-sebrafiskmodeller vanligvis i de tidlige livsstadiene (fra embryoer til larver) på grunn av begrensninger i immunfunksjon og næringsopptak. Denne studien optimaliserer generering, vedlikehold og identifisering av tidlige GF sebrafiskmodeller uten fôring og med langtidsfôring ved bruk av GF-mat (som Artemia sp., saltlake reker). Gjennom hele prosessen ble daglig prøvetaking og kultur utført og identifisert gjennom flere deteksjoner, inkludert plater og 16S rRNA-sekvensering. Den aseptiske hastigheten, overlevelsen og utviklingsindeksene til GF sebrafisk ble registrert for å sikre kvaliteten og kvantiteten til de genererte modellene. Det er viktig at denne studien gir detaljer om bakteriell isolasjon og infeksjonsteknikker for GF-fisk, noe som muliggjør effektiv opprettelse av GF-fiskemodeller fra larver til juvenile stadier med GF-matstøtte. Ved å anvende disse prosedyrene i biomedisinsk forskning, kan forskere bedre forstå forholdet mellom tarmbakterielle funksjoner og vertshelse.

The microbiota (i.e., Archaea, Bacteria, Eukarya, and viruses) play crucial roles in maintaining host health and contributing to the development of various diseases by influencing physiological and pathological processes through symbiotic interactions within the intestinal barrier, epithelial surface, and mucin functions in individuals1,2,3. The composition of the microbiota across different life stages, from infancy to juvenility, adulthood, and aging, as well as its presence in various locations such as nares, oral, skin, and gut sites, is dynamically shaped by diverse habitats and environments4. The intestinal microbiota in organisms is involved in nutrient absorption, immune response, pathogen invasion, metabolic regulation, etc5,6. Studies on patients have demonstrated that disruptions in gut microbiota are related to human obesity, sleep disorders, depression, inflammatory bowel disease (IBD), neurodegenerative diseases (Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s), aging, and various cancers7,8,9. Furthermore, interactive pathways between gut microbiota and hosts involve inflammatory factors, neurotransmitters, metabolites, intestinal barrier, and oxidative stress, as observed in previous research using mice and fish models10,11.
Recently, multiple bacteria-related approaches or therapies, including potential probiotics and fecal microbiota transplantation (FMT), have been explored for these disorders in clinical and animal models. These explorations are based on discoveries related to the microbiota-gut-brain/liver/kidney axis, microbiota-derived products, and altered receptor activity12,13. However, the development, various functions, and mechanisms of the microbiota-host system are still incompletely understood and identified due to the complexity of the microbial community and the challenge of generating powerful human-like disease models.
To address these issues, germ-free (GF) animal models were urgently proposed in the mid-19th century and primarily developed during the 20th century. Subsequent refinements, including antibiotic-treated and gnotobiotic models, along with advancements in microbial detection and observation technologies, further perfected these models14,15,16. GF animals, created by erasing their own background and avoiding environmental microbes, offer an excellent strategy for exploring the interactions between microorganisms and their hosts17. Through the application of animal models and refined protocols, researchers have successfully replicated similar microbial compositions found in patients in GF mice and fish. Additionally, other GF animal models, such as dogs, chickens, and pigs, provide diverse options as research subjects18,19,20,21. This approach has enabled investigations into the potential therapeutic effects of commensal microbiomes on various diseases, including cancer immunotherapy in humans16,18. GF models offer more accurate insights into the characteristics and mechanisms of specific bacterial colonization, migration, multiplication, and interaction within hosts. This provides crucial novel insights into the occurrence and development of microbiota-related diseases22,23. The history of establishing and applying GF zebrafish in microbial research has evolved from the reports of Rawls et al. in 2004 and Bates et al. in 2006 to Melancon et al.&#39;s protocol in 201716,24,25. However, the feasibility of adult or breeding GF models is still a prolonged process, accompanied by variable longevity, success rates, and health challenges.
Among various animal models, zebrafish (Danio rerio) stands out as a critical tool for both basic and biomedical research due to its advantageous similarity to human organs and genomics, short developmental cycle, high fecundity, and transparent embryos19,26. Zebrafish, serving as reliable human disease models, offer a visual representation of physiological and pathological processes in vivo, providing insights into the attractive features of host-microbe interactions. Notably, zebrafish exhibit distinct cell lineages, allowing imaging of intestinal physiology, microbial dynamics, gonads and reproductive development, maturation of the host immune system, behavior, and metabolism27. Zebrafish embryos develop within protective chorions until hatching, becoming larvae at 3 days post-fertilization (dpf). They actively hunt for food at 5 dpf and reach sexual maturity around 3 months post-fertilization (mpf)28. The first successful germ-free (GF) zebrafish, reported by Rawls et al.24, showed that larvae fed with autoclaved feed after yolk absorption exhibited tissue necrosis from 8 dpf and total death at 20 dpf. This indicated the effects of diet or the importance of considering exogenous nutrient supply in experiments involving long-term (&#62;7 dpf) GF fish29. Subsequent studies improved the generation protocol of GF fish, employing sterile food and methods perfected in different fish models16.
However, most research on GF zebrafish models has focused on early life stages, involving bacterial infection at 5 dpf for 24 h to 48 h, with samples collected before 7 dpf at the conclusion of the experiments25,30,31. It&#39;s widely acknowledged that the microbiota in organisms, including humans and zebrafish, is colonized at the beginning of life and shaped during growth and development. The composition remains stable at adult stages, with the roles of microbiota in the host being crucial throughout life, especially in aging, neurodegenerative, metabolic-related obesity, and intestinal disease aspects3. Thus, perspectives from GF animals with longer survival can provide insights into the mechanisms of microbial roles in host organ development and functions, considering the immature immune and reproductive systems of fish larvae in early life. While bacterial strains in zebrafish intestines have been isolated and identified in previous studies, offering the potential for infecting GF animal models to select probiotics or research bacterial functions in the host19,25, the generation and application of GF fish models have primarily been restricted to early life stages. This limitation, attributed to the complex production process, high maintenance costs, and associated issues with food and immunity, hinders research efforts aimed at investigating the developmental and chronic effects of microbiota in the host.
The survival rate, behavior, growth, maturation, and overall health of fish, especially in germ-free (GF) models, are significantly influenced by feeding practices, encompassing nutrition intake and absorption during the mouth-open period from early larvae to juveniles32,33. However, one of the challenges in GF fish husbandry is the scarcity of suitable sterile diets, limiting the effectiveness of nutritional support for sustaining the growth and survival of larvae. Resolving this issue is crucial to restoring the life of GF fish, considering their developmental defense mechanisms and weak digestion abilities due to the absence of an intestinal microbiome. In terms of food, live brine shrimp (Artemia sp.) emerges as the most suitable diet for mouth-open larvae to juvenile fish. It has been observed that fish fed with live brine shrimp exhibit higher growth and survival rates compared to those fed with cooked egg yolk or other natural and synthetic baits34. While early life models of GF fish can survive with yolk support and GF larvae models can be maintained with sterile feeding, generating long-term models from larvae to juveniles and reaching sexual maturity remains challenging. Additionally, flake or powder food is limited by unequal nutritional composition and can impact water quality. In contrast, live Artemia has advantages such as survival in both salt and freshwater, small size suitable for larvae to adults, ease of batching, and higher hatching quality35. Building upon previous methods16,24,30, we have simplified the complex treatment process and addressed the diet challenge by establishing easily incubated GF live Artemia sp. as sterile food for longer durations than early-life GF fish.
This study presents an optimized protocol covering (1) generation, (2) maintenance, (3) identification of sterile rate, and (4) maintenance and feeding to ensure the growth of germ-free (GF) zebrafish from embryos to larvae and juvenile stages. The results offer preliminary evidence on the hatching, survival, growth, and sterility of GF zebrafish, along with essential indices for GF Artemia sp. as sterile food. The detailed steps in model generation and preparation of sterile live foods provide crucial technical support for constructing and applying long-term GF fish models, as well as GF Artemia sp. in microbiota-host interaction research. The protocol addresses bacterial isolation, identification, and infection on GF fish models, outlining methods for bacterial fluorescence labeling and observing their colonization in fish intestines under a microscope. GF fish, gnotobiotic fish with bacterial infection, or transferred human microbiota models will undergo various detections to elucidate their functions and effects on host immunity, digestion, behavior, transcriptomic regulation, and metabolic aspects. In the long term, this protocol can be extended to different wild-type fish species, such as marine medaka, and potentially to other selected transgenic zebrafish lines correlated to specific tissues or diseases.

Forfatter Spotlight: Etablering av bakteriefri sebrafisk for studier av mikrobiota-vertsforhold

Generering, vedlikehold og identifisering av bakteriefrie sebrafiskmodeller fra larver til ungstadier

The scope of this research is generation of novel, germ-free animal models, which will be helpful and powerful tools in investigation of various microbiome functions. In this field, the early germ-free fish models have been used recently, but the long-term models are still limited due to various culture conditions and the staff developmental defense. The current GF fish models are normally early life ones.Thus, the technologies including the sterile scale, the sample detection methods, and providing sterile food are very important challenges to overcome. The germ-free zebrafish model is crucial for studying host-microbiota interaction and their impacts on development and the immunity and disease. This model allows researchers to precisely manipulate the single gut bacteria and observe its effect on the transparent zebrafish embryos.It provides valuable insights into the roles of gut microbes inheriting the disease. In the future, our research will mainly focused on establishing a germ-free zebrafish model for entire life cycle to better understanding the function of the gut microbiome.

GF-sebrafiskmodellene kan effektivt produseres ved å utnytte de rike eggene som gytes av par sebrafisk, med protokollen optimalisert basert på tidligere GF-fiskemodeller35. En enkelt 6-brønns plate kan dyrke omtrent 30-48 embryoer / larver, noe som muliggjør rikelig datainnsamling og statistisk analyse. Etter steril behandling dyrkes GF-embryoene i en ren inkubator til klekking til larver ved 48-72 timer, og endres GZM daglig med påvisning av innsamlede prøver, noe som er avgjørende for å ...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Establishing Germ-Free Zebrafish for Microbiota-Host Relationship Studies at JoVE.com

Denne protokollen skisserer de primære trinnene for å oppnå bakteriefrie (GF) fiskeembryoer og opprettholde dem fra larver til juvenilstadiet, inkludert prøvetaking og påvisning av deres sterile status. Bruk av GF-modeller med infeksjon er viktig for å forstå mikrobers rolle i vertshelsen.

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Omfanget av denne forskningen er generering av nye, bakteriefrie dyremodeller, som vil være nyttige og kraftige verktøy i undersøkelsen av ulike mikrobiomfunksjoner. På dette feltet har de tidlige bakteriefrie fiskemodellene blitt brukt nylig, men de langsiktige modellene er fortsatt begrenset på grunn av ulike kulturforhold og personalets utviklingsforsvar. De nåværende GF-fiskemodellene er normalt de som lever tidlig i livet.Dermed er teknologiene, inkludert steril skala, prøvedeteksjonsmetoder og levering av steril mat, svært viktige utfordringer å overvinne. Den bakteriefrie sebrafiskmodellen er avgjørende for å studere vertsmikrobiota-interaksjon og deres innvirkning på utvikling og immunitet og sykdom. Denne modellen lar forskere nøyaktig manipulere de enkelte tarmbakteriene og observere effekten på de gjennomsiktige sebrafiskembryoene.Det gir verdifull innsikt i rollene til tarmmikrober som arver sykdommen. I fremtiden vil forskningen vår hovedsakelig fokusere på å etablere en bakteriefri sebrafiskmodell for hele livssyklusen for bedre å forstå funksjonen til tarmmikrobiomet.

generation-maintenance-identification-germ-free-zebrafish-models-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

Generation of Germ-Free Zebrafish Models from Embryos

Generering av bakteriefrie sebrafiskmodeller fra embryoer

GF Artemia nauplii Preparation for Chronic GF Zebrafish Nutrition

To begin, obtain 0.25 grams of Artemia cysts and rinse them with 2.4 grams per liter sodium hypochlorite for five minutes. Filter the rinsed cysts with a sterilized ultra dense filter and wash with sterilized ultrapure water for one to two minutes. After three washes, transfer them to 100 milliliters of 2.5%sterile saline and mix well.Pack 50 milliliters of treated Artemia cyst mix into a sterile 100-milliliter bottle. Using a film, seal the bottle thoroughly and place it in a shaking incubator with light. Next, using a Pasteur pipette, extract 30 milliliters of hatching Artemia nauplii from the middle and lower layers.After filtering, wash the Artemia three times with sterile ultrapure water for about one minute, and add four milliliters of sterile ultrapure water. Finally, using a disposable Pasteur pipette, retrieve actively swimming Artemia from the upper layer, wash, and prepare the solution for feeding. Microscopic observation confirmed efficient hatching of Artemia cysts after the treatment.