Name: Autor em destaque: Estabelecendo o peixe-zebra livre de germes para estudos de relacionamento entre microbiota e hospedeiro
Uploaded: 2024-04-12T13:50:00
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Agradecemos sinceramente o apoio do Projeto de Talentos da Universidade Médica de Chongqing (nº R4014 para DSP e R4020 para PPJ), Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NSFC, nº 32200386 para PPJ), Estúdio de Mentores de Inovação de Pós-Doutorado de Chongqing (X7928 DSP) e Programa do Centro Conjunto China-Sri Lanka para Pesquisa e Demonstração de Tecnologia da Água pela Academia Chinesa de Ciências (CAS)/Centro Conjunto China-Sri Lanka para Educação e Pesquisa pelo CAS.

Os experimentos com peixes foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso de Animais de Chongqing e do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica de Chongqing, China, bem como os padrões para animais experimentais emitidos pelo Departamento Estadual de Qualidade e Supervisão Técnica (ID de aprovação: GB14922-2001 a GBT14927-2001). O peixe-zebra (Danio rerio, tipo selvagem, cepa AB) foi obtido no Instituto de Hidrobiologia da Academia Chinesa de Ciê...

Otimizando modelos de peixe-zebra GF: geração, manutenção e estudos microbianos

Etapas críticas dentro dos protocolos de preparação de peixes e alimentos GF Durante a geração de modelos de peixes GF, várias etapas críticas foram envolvidas, incluindo a preparação de materiais estéreis, esterilização de embriões, renovação diária de GZM, coleta de várias amostras e o exame estéril de cada amostra usando vários métodos. Dentre essas etapas, o tratamento inicial dos embriões é fundamental e decisivo para o sucesso dos modelos GF. Os agentes de controle, suas co...

A microbiota (ou seja, Archaea, Bacteria, Eukarya e vírus) desempenha papéis cruciais na manutenção da saúde do hospedeiro e contribui para o desenvolvimento de várias doenças, influenciando processos fisiológicos e patológicos por meio de interações simbióticas dentro da barreira intestinal, superfície epitelial e funções de mucina em indivíduos 1,2,3. A composição da microbiota em diferentes fases da vida, desde a infância até a juventude, idade adulta e envelhecimento, bem como sua presença em vários locais, como narinas, locais orais, cutâneos e intestinais, é moldada dinamicamente por diversos habitats e ambientes4. A microbiota intestinal nos organismos está envolvida na absorção de nutrientes, resposta imune, invasão de patógenos, regulação metabólica, etc 5,6. Estudos em pacientes demonstraram que as interrupções na microbiota intestinal estão relacionadas à obesidade humana, distúrbios do sono, depressão, doença inflamatória intestinal (DII), doenças neurodegenerativas (Parkinson, Alzheimer), envelhecimento e vários tipos de câncer 7,8,9. Além disso, as vias interativas entre a microbiota intestinal e os hospedeiros envolvem fatores inflamatórios, neurotransmissores, metabólitos, barreira intestinal e estresse oxidativo, conforme observado em pesquisas anteriores usando modelos de camundongos e peixes10,11.
Recentemente, várias abordagens ou terapias relacionadas a bactérias, incluindo potenciais probióticos e transplante de microbiota fecal (FMT), foram exploradas para esses distúrbios em modelos clínicos e animais. Essas explorações são baseadas em descobertas relacionadas ao eixo microbiota-intestino-cérebro/fígado/rim, produtos derivados da microbiota e atividade alterada do receptor12,13. No entanto, o desenvolvimento, várias funções e mecanismos do sistema microbiota-hospedeiro ainda são incompletamente compreendidos e identificados devido à complexidade da comunidade microbiana e ao desafio de gerar poderosos modelos de doenças semelhantes às humanas.
Para resolver essas questões, modelos animais livres de germes (GF) foram propostos com urgência em meados doséculo 19 e desenvolvidos principalmente duranteo século 20. Refinamentos subsequentes, incluindo modelos tratados com antibióticos e gnotobióticos, juntamente com avanços nas tecnologias de detecção e observação microbiana, aperfeiçoaram ainda mais esses modelos 14,15,16. Os animais GF, criados apagando seu próprio fundo e evitando micróbios ambientais, oferecem uma excelente estratégia para explorar as interações entre microrganismos e seus hospedeiros17. Por meio da aplicação de modelos animais e protocolos refinados, os pesquisadores replicaram com sucesso composições microbianas semelhantes encontradas em pacientes em camundongos e peixes GF. Além disso, outros modelos animais de FG, como cães, galinhas e porcos, oferecem diversas opções como sujeitos de pesquisa 18,19,20,21. Essa abordagem permitiu investigações sobre os potenciais efeitos terapêuticos dos microbiomas comensais em várias doenças, incluindo a imunoterapia contra o câncer em humanos16,18. Os modelos GF oferecem informações mais precisas sobre as características e mecanismos de colonização, migração, multiplicação e interação bacteriana específica dentro dos hospedeiros. Isso fornece novos insights cruciais sobre a ocorrência e o desenvolvimento de doenças relacionadas à microbiota22,23. A história de estabelecimento e aplicação do peixe-zebra GF na pesquisa microbiana evoluiu dos relatórios de Rawls et al. em 2004 e Bates et al. em 2006 para o protocolo de Melancon et al. em 2017 16,24,25. No entanto, a viabilidade de modelos de FG adultos ou reprodutores ainda é um processo prolongado, acompanhado de longevidade variável, taxas de sucesso e desafios de saúde.
Dentre os vários modelos animais, o peixe-zebra (Danio rerio) destaca-se como uma ferramenta crítica para a pesquisa básica e biomédica devido à sua semelhança vantajosa com órgãos humanos e genômica, ciclo de desenvolvimento curto, alta fecundidade e embriões transparentes19,26. O peixe-zebra, servindo como modelos confiáveis de doenças humanas, oferece uma representação visual de processos fisiológicos e patológicos in vivo, fornecendo informações sobre as características atraentes das interações hospedeiro-micróbio. Notavelmente, o peixe-zebra exibe linhagens celulares distintas, permitindo imagens da fisiologia intestinal, dinâmica microbiana, gônadas e desenvolvimento reprodutivo, maturação do sistema imunológico do hospedeiro, comportamento e metabolismo27. Os embriões de peixe-zebra se desenvolvem dentro de córions protetores até a eclosão, tornando-se larvas 3 dias após a fertilização (dpf). Eles caçam ativamente por comida a 5 dpf e atingem a maturidade sexual por volta de 3 meses após a fertilização (mpf)28. O primeiro peixe-zebra livre de germes (GF) bem-sucedido, relatado por Rawls et al.24, mostrou que larvas alimentadas com ração autoclavada após a absorção da gema exibiram necrose tecidual de 8 dpf e morte total a 20 dpf. Isso indicou os efeitos da dieta ou a importância de considerar o suprimento de nutrientes exógenos em experimentos envolvendo peixes GF de longo prazo (>7 dpf)29. Estudos subsequentes aprimoraram o protocolo de geração de peixes GF, empregando alimentos estéreis e métodos aperfeiçoados em diferentes modelos de peixes16.
No entanto, a maioria das pesquisas em modelos de peixe-zebra GF tem se concentrado nos estágios iniciais da vida, envolvendo infecção bacteriana a 5 dpf por 24 h a 48 h, com amostras coletadas antes de 7 dpf na conclusão dos experimentos 25,30,31. É amplamente reconhecido que a microbiota em organismos, incluindo humanos e peixes-zebra, é colonizada no início da vida e moldada durante o crescimento e desenvolvimento. A composição permanece estável na fase adulta, sendo os papéis da microbiota no hospedeiro cruciais ao longo da vida, especialmente nos aspectos do envelhecimento, neurodegenerativos, obesidade metabólica e doenças intestinais3. Assim, as perspectivas de animais GF com maior sobrevida podem fornecer insights sobre os mecanismos dos papéis microbianos no desenvolvimento e funções dos órgãos do hospedeiro, considerando os sistemas imunológico e reprodutivo imaturos das larvas de peixes no início da vida. Embora cepas bacterianas no intestino do peixe-zebra tenham sido isoladas e identificadas em estudos anteriores, oferecendo o potencial de infectar modelos animais de GF para selecionar probióticos ou pesquisar funções bacterianas no hospedeiro19,25, a geração e aplicação de modelos de peixes GF foram restritas principalmente aos estágios iniciais da vida. Essa limitação, atribuída ao complexo processo de produção, altos custos de manutenção e problemas associados com alimentos e imunidade, dificulta os esforços de pesquisa destinados a investigar os efeitos crônicos e de desenvolvimento da microbiota no hospedeiro.
A taxa de sobrevivência, comportamento, crescimento, maturação e saúde geral dos peixes, especialmente em modelos livres de germes (GF), são significativamente influenciados pelas práticas alimentares, abrangendo a ingestão e absorção de nutrientes durante o período de boca aberta, desde as primeiras larvas até os juvenis32,33. No entanto, um dos desafios na piscicultura GF é a escassez de dietas estéreis adequadas, limitando a eficácia do suporte nutricional para sustentar o crescimento e a sobrevivência das larvas. Resolver esse problema é crucial para restaurar a vida dos peixes GF, considerando seus mecanismos de defesa de desenvolvimento e fracas habilidades de digestão devido à ausência de um microbioma intestinal. Em termos de alimentação, o artêmia vivo (Artemia sp.) surge como a dieta mais adequada para larvas de peixes juvenis. Observou-se que peixes alimentados com artêmia viva apresentam maiores taxas de crescimento e sobrevivência em comparação com aqueles alimentados com gema de ovo cozida ou outras iscas naturais e sintéticas34. Embora os modelos de início de vida de peixes GF possam sobreviver com suporte vitelino e os modelos de larvas GF possam ser mantidos com alimentação estéril, gerar modelos de longo prazo de larvas a juvenis e atingir a maturidade sexual continua sendo um desafio. Além disso, alimentos em flocos ou em pó são limitados pela composição nutricional desigual e podem afetar a qualidade da água. Em contraste, a Artemia viva tem vantagens como sobrevivência em água salgada e doce, tamanho pequeno adequado para larvas de adultos, facilidade de dosagem e maior qualidade de eclosão35. Com base em métodos anteriores 16,24,30, simplificamos o complexo processo de tratamento e abordamos o desafio da dieta, estabelecendo Artemia sp. viva GF facilmente incubada como alimento estéril por períodos mais longos do que os peixes GF no início da vida.
Este estudo apresenta um protocolo otimizado que abrange (1) geração, (2) manutenção, (3) identificação da taxa de esterilidade e (4) manutenção e alimentação para garantir o crescimento de peixes-zebra livres de germes (GF) de embriões para larvas e estágios juvenis. Os resultados oferecem evidências preliminares sobre a eclosão, sobrevivência, crescimento e esterilidade do peixe-zebra GF, juntamente com índices essenciais para GF Artemia sp. como alimento estéril. As etapas detalhadas na geração de modelos e preparação de alimentos vivos estéreis fornecem suporte técnico crucial para a construção e aplicação de modelos de peixes GF de longo prazo, bem como GF Artemia sp. na pesquisa de interação microbiota-hospedeiro. O protocolo aborda o isolamento, identificação e infecção bacteriana em modelos de peixes GF, delineando métodos para marcação de fluorescência bacteriana e observando sua colonização no intestino de peixes ao microscópio. Peixes GF, peixes gnotobióticos com infecção bacteriana ou modelos de microbiota humana transferidos serão submetidos a várias detecções para elucidar suas funções e efeitos na imunidade do hospedeiro, digestão, comportamento, regulação transcriptômica e aspectos metabólicos. A longo prazo, este protocolo pode ser estendido a diferentes espécies de peixes selvagens, como o medaka marinho, e potencialmente a outras linhagens de peixe-zebra transgênico selecionadas correlacionadas a tecidos ou doenças específicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AB-GZM</td>
			<td>Amphotericin:Solarbio;&#160; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.</td>
			<td>Amphotericin:CAS:1397-89-3; 
			kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.</td>
			<td>49.6 mL GZM, 50 &#181;L amphotericin stock solution (250 &#181;g/mL), 25 &#181;L kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 &#181;L ampicillin stock solution (20 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-15-M</td>
			<td>To collect samples, and hold agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates, 24-, 48- well plates</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>11112</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aeronomas</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178499</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic work station</td>
			<td>GENE SCIENCE</td>
			<td>E200G</td>
			<td>Bacterial isolation, sterile testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis</td>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>v6.07</td>
			<td>To analysis the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API 20 E kits</td>
			<td>&#160;BioMerieux SA, France</td>
			<td>No.1005915090</td>
			<td>Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia (Brine shrimp)</td>
			<td>Shangjia Aquarium Co., Ltd.</td>
			<td>Aquamaster brand</td>
			<td>Artemia cysts, and brine shrimp eggs&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto cycle system for fish culture</td>
			<td>Ningbo Hairui Technology Co., Ltd</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Maintain the fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Zeal Way</td>
			<td>G154DWS</td>
			<td>Prepare the materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Aerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Anaerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>LongYue Co., Ltd</td>
			<td>SPX</td>
			<td>For fish and plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Haier</td>
			<td>HR40-IIA2</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood plates</td>
			<td>sheep blood:Solarbio</td>
			<td>Cat. NO. TX0030</td>
			<td>Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-Dil dyes</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Cat#C7000&#160;&#160;</td>
			<td>To label the bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature shaking incubator</td>
			<td>Peiving Co., Ltd</td>
			<td>HZQ-X100</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>Bacteria and Archaea database</td>
			<td>Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ 
			Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pasteur pipette</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>bs-xh-03l</td>
			<td>Used to change water, and transfer eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dish</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-90-D</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA kits</td>
			<td>Solaribio</td>
			<td>Cat#D1600</td>
			<td>Bacterial genomic DNA extraction kits&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric pipette</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>Levo me</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exiguobacterium</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178504</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZM</td>
			<td>Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd.</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory pure water system</td>
			<td>Hitech Co., Ltd</td>
			<td>Prima-S15</td>
			<td>Prepare the agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td>With fluorescent light to observe fish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR kits</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>Cat#ET101</td>
			<td>Taq DNA Polymerase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>sp-013-10</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine (PVP-I)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>Lot#H1217005</td>
			<td>Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timing converter</td>
			<td>PinYi Co., Ltd</td>
			<td>AL-06</td>
			<td>To regulate the light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Aerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Anaerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clean workbench</td>
			<td>Airtech</td>
			<td>SW-CJ-2FD</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure flow system for fish culture</td>
			<td>Marine Biological Equipment company</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Produce water for fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178501</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, maintenance, and identification of germ-free zebrafish models from larvae to juvenile stages

O peixe-zebra serve como modelos valiosos para pesquisas sobre crescimento, imunidade e microbiota intestinal devido às suas semelhanças genômicas com mamíferos, embriões transparentes desenvolvidos em um ambiente córion relativamente limpo e desenvolvimento extremamente rápido de larvas em comparação com modelos de roedores. O peixe-zebra livre de germes (GF) (Danio rerio) é crucial para avaliar a toxicidade de poluentes e estabelecer modelos de doenças semelhantes às humanas relacionadas às funções microbianas. Em comparação com os modelos criados convencionalmente (CR) (peixes em criação comum), o peixe-zebra GF permite uma manipulação mais precisa da microbiota do hospedeiro, auxiliando na determinação da relação causal entre microrganismos e hospedeiros. Consequentemente, eles desempenham um papel crítico no avanço de nossa compreensão dessas relações. No entanto, os modelos de peixe-zebra GF são normalmente gerados e pesquisados durante os estágios iniciais da vida (de embriões a larvas) devido a limitações na função imunológica e absorção de nutrientes. Este estudo otimiza a geração, manutenção e identificação de modelos iniciais de peixe-zebra GF sem alimentação e com alimentação de longo prazo usando alimentos GF (como Artemia sp., artêmia). Ao longo do processo, amostragem e cultura diárias foram realizadas e identificadas por meio de múltiplas detecções, incluindo placas e sequenciamento de rRNA 16S. A taxa asséptica, a sobrevivência e os índices de desenvolvimento do peixe-zebra GF foram registrados para garantir a qualidade e a quantidade dos modelos gerados. É importante ressaltar que este estudo fornece detalhes sobre técnicas de isolamento bacteriano e infecção para peixes GF, permitindo a criação eficiente de modelos de peixes GF desde larvas até estágios juvenis com suporte alimentar GF. Ao aplicar esses procedimentos em pesquisas biomédicas, os cientistas podem entender melhor as relações entre as funções bacterianas intestinais e a saúde do hospedeiro.

The microbiota (i.e., Archaea, Bacteria, Eukarya, and viruses) play crucial roles in maintaining host health and contributing to the development of various diseases by influencing physiological and pathological processes through symbiotic interactions within the intestinal barrier, epithelial surface, and mucin functions in individuals1,2,3. The composition of the microbiota across different life stages, from infancy to juvenility, adulthood, and aging, as well as its presence in various locations such as nares, oral, skin, and gut sites, is dynamically shaped by diverse habitats and environments4. The intestinal microbiota in organisms is involved in nutrient absorption, immune response, pathogen invasion, metabolic regulation, etc5,6. Studies on patients have demonstrated that disruptions in gut microbiota are related to human obesity, sleep disorders, depression, inflammatory bowel disease (IBD), neurodegenerative diseases (Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s), aging, and various cancers7,8,9. Furthermore, interactive pathways between gut microbiota and hosts involve inflammatory factors, neurotransmitters, metabolites, intestinal barrier, and oxidative stress, as observed in previous research using mice and fish models10,11.
Recently, multiple bacteria-related approaches or therapies, including potential probiotics and fecal microbiota transplantation (FMT), have been explored for these disorders in clinical and animal models. These explorations are based on discoveries related to the microbiota-gut-brain/liver/kidney axis, microbiota-derived products, and altered receptor activity12,13. However, the development, various functions, and mechanisms of the microbiota-host system are still incompletely understood and identified due to the complexity of the microbial community and the challenge of generating powerful human-like disease models.
To address these issues, germ-free (GF) animal models were urgently proposed in the mid-19th century and primarily developed during the 20th century. Subsequent refinements, including antibiotic-treated and gnotobiotic models, along with advancements in microbial detection and observation technologies, further perfected these models14,15,16. GF animals, created by erasing their own background and avoiding environmental microbes, offer an excellent strategy for exploring the interactions between microorganisms and their hosts17. Through the application of animal models and refined protocols, researchers have successfully replicated similar microbial compositions found in patients in GF mice and fish. Additionally, other GF animal models, such as dogs, chickens, and pigs, provide diverse options as research subjects18,19,20,21. This approach has enabled investigations into the potential therapeutic effects of commensal microbiomes on various diseases, including cancer immunotherapy in humans16,18. GF models offer more accurate insights into the characteristics and mechanisms of specific bacterial colonization, migration, multiplication, and interaction within hosts. This provides crucial novel insights into the occurrence and development of microbiota-related diseases22,23. The history of establishing and applying GF zebrafish in microbial research has evolved from the reports of Rawls et al. in 2004 and Bates et al. in 2006 to Melancon et al.&#39;s protocol in 201716,24,25. However, the feasibility of adult or breeding GF models is still a prolonged process, accompanied by variable longevity, success rates, and health challenges.
Among various animal models, zebrafish (Danio rerio) stands out as a critical tool for both basic and biomedical research due to its advantageous similarity to human organs and genomics, short developmental cycle, high fecundity, and transparent embryos19,26. Zebrafish, serving as reliable human disease models, offer a visual representation of physiological and pathological processes in vivo, providing insights into the attractive features of host-microbe interactions. Notably, zebrafish exhibit distinct cell lineages, allowing imaging of intestinal physiology, microbial dynamics, gonads and reproductive development, maturation of the host immune system, behavior, and metabolism27. Zebrafish embryos develop within protective chorions until hatching, becoming larvae at 3 days post-fertilization (dpf). They actively hunt for food at 5 dpf and reach sexual maturity around 3 months post-fertilization (mpf)28. The first successful germ-free (GF) zebrafish, reported by Rawls et al.24, showed that larvae fed with autoclaved feed after yolk absorption exhibited tissue necrosis from 8 dpf and total death at 20 dpf. This indicated the effects of diet or the importance of considering exogenous nutrient supply in experiments involving long-term (&#62;7 dpf) GF fish29. Subsequent studies improved the generation protocol of GF fish, employing sterile food and methods perfected in different fish models16.
However, most research on GF zebrafish models has focused on early life stages, involving bacterial infection at 5 dpf for 24 h to 48 h, with samples collected before 7 dpf at the conclusion of the experiments25,30,31. It&#39;s widely acknowledged that the microbiota in organisms, including humans and zebrafish, is colonized at the beginning of life and shaped during growth and development. The composition remains stable at adult stages, with the roles of microbiota in the host being crucial throughout life, especially in aging, neurodegenerative, metabolic-related obesity, and intestinal disease aspects3. Thus, perspectives from GF animals with longer survival can provide insights into the mechanisms of microbial roles in host organ development and functions, considering the immature immune and reproductive systems of fish larvae in early life. While bacterial strains in zebrafish intestines have been isolated and identified in previous studies, offering the potential for infecting GF animal models to select probiotics or research bacterial functions in the host19,25, the generation and application of GF fish models have primarily been restricted to early life stages. This limitation, attributed to the complex production process, high maintenance costs, and associated issues with food and immunity, hinders research efforts aimed at investigating the developmental and chronic effects of microbiota in the host.
The survival rate, behavior, growth, maturation, and overall health of fish, especially in germ-free (GF) models, are significantly influenced by feeding practices, encompassing nutrition intake and absorption during the mouth-open period from early larvae to juveniles32,33. However, one of the challenges in GF fish husbandry is the scarcity of suitable sterile diets, limiting the effectiveness of nutritional support for sustaining the growth and survival of larvae. Resolving this issue is crucial to restoring the life of GF fish, considering their developmental defense mechanisms and weak digestion abilities due to the absence of an intestinal microbiome. In terms of food, live brine shrimp (Artemia sp.) emerges as the most suitable diet for mouth-open larvae to juvenile fish. It has been observed that fish fed with live brine shrimp exhibit higher growth and survival rates compared to those fed with cooked egg yolk or other natural and synthetic baits34. While early life models of GF fish can survive with yolk support and GF larvae models can be maintained with sterile feeding, generating long-term models from larvae to juveniles and reaching sexual maturity remains challenging. Additionally, flake or powder food is limited by unequal nutritional composition and can impact water quality. In contrast, live Artemia has advantages such as survival in both salt and freshwater, small size suitable for larvae to adults, ease of batching, and higher hatching quality35. Building upon previous methods16,24,30, we have simplified the complex treatment process and addressed the diet challenge by establishing easily incubated GF live Artemia sp. as sterile food for longer durations than early-life GF fish.
This study presents an optimized protocol covering (1) generation, (2) maintenance, (3) identification of sterile rate, and (4) maintenance and feeding to ensure the growth of germ-free (GF) zebrafish from embryos to larvae and juvenile stages. The results offer preliminary evidence on the hatching, survival, growth, and sterility of GF zebrafish, along with essential indices for GF Artemia sp. as sterile food. The detailed steps in model generation and preparation of sterile live foods provide crucial technical support for constructing and applying long-term GF fish models, as well as GF Artemia sp. in microbiota-host interaction research. The protocol addresses bacterial isolation, identification, and infection on GF fish models, outlining methods for bacterial fluorescence labeling and observing their colonization in fish intestines under a microscope. GF fish, gnotobiotic fish with bacterial infection, or transferred human microbiota models will undergo various detections to elucidate their functions and effects on host immunity, digestion, behavior, transcriptomic regulation, and metabolic aspects. In the long term, this protocol can be extended to different wild-type fish species, such as marine medaka, and potentially to other selected transgenic zebrafish lines correlated to specific tissues or diseases.

Autor em destaque: Estabelecendo o peixe-zebra livre de germes para estudos de relacionamento entre microbiota e hospedeiro

Geração, manutenção e identificação de modelos de peixe-zebra livres de germes de larvas a estágios juvenis

The scope of this research is generation of novel, germ-free animal models, which will be helpful and powerful tools in investigation of various microbiome functions. In this field, the early germ-free fish models have been used recently, but the long-term models are still limited due to various culture conditions and the staff developmental defense. The current GF fish models are normally early life ones.Thus, the technologies including the sterile scale, the sample detection methods, and providing sterile food are very important challenges to overcome. The germ-free zebrafish model is crucial for studying host-microbiota interaction and their impacts on development and the immunity and disease. This model allows researchers to precisely manipulate the single gut bacteria and observe its effect on the transparent zebrafish embryos.It provides valuable insights into the roles of gut microbes inheriting the disease. In the future, our research will mainly focused on establishing a germ-free zebrafish model for entire life cycle to better understanding the function of the gut microbiome.

Os modelos de peixe-zebra GF podem ser produzidos de forma eficiente utilizando os ovos abundantes gerados por pares de peixes-zebra, com o protocolo otimizado com base em modelos anteriores de peixes GF35. Uma única placa de 6 poços pode cultivar aproximadamente 30-48 embriões/larvas, permitindo ampla coleta de dados e análise estatística. Após o tratamento estéril, os embriões GF são cultivados em uma incubadora limpa até a eclosão das larvas em 48-72 h, e trocados GZM diariamente com...

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Este protocolo descreve as etapas primárias para obter embriões de peixes livres de germes (GF) e mantê-los desde as larvas até o estágio juvenil, incluindo amostragem e detecção de seu status estéril. O uso de modelos de GF com infecção é importante para entender o papel dos micróbios na saúde do hospedeiro.

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

O escopo desta pesquisa é a geração de novos modelos animais livres de germes, que serão ferramentas úteis e poderosas na investigação de várias funções do microbioma. Neste campo, os primeiros modelos de peixes livres de germes foram usados recentemente, mas os modelos de longo prazo ainda são limitados devido a várias condições de cultura e à defesa do desenvolvimento da equipe. Os modelos atuais de peixes GF são normalmente os primeiros da vida.Assim, as tecnologias, incluindo a balança estéril, os métodos de detecção de amostras e o fornecimento de alimentos estéreis, são desafios muito importantes a serem superados. O modelo de peixe-zebra livre de germes é crucial para estudar a interação hospedeiro-microbiota e seus impactos no desenvolvimento e na imunidade e na doença. Este modelo permite que os pesquisadores manipulem com precisão as bactérias intestinais únicas e observem seu efeito nos embriões transparentes de peixe-zebra.Ele fornece informações valiosas sobre os papéis dos micróbios intestinais que herdam a doença. No futuro, nossa pesquisa se concentrará principalmente em estabelecer um modelo de peixe-zebra livre de germes para todo o ciclo de vida para entender melhor a função do microbioma intestinal.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

Biologia do Desenvolvimento

Generation of Germ-Free Zebrafish Models from Embryos

Geração de modelos de peixe-zebra livres de germes a partir de embriões

GF Artemia nauplii Preparation for Chronic GF Zebrafish Nutrition

To begin, obtain 0.25 grams of Artemia cysts and rinse them with 2.4 grams per liter sodium hypochlorite for five minutes. Filter the rinsed cysts with a sterilized ultra dense filter and wash with sterilized ultrapure water for one to two minutes. After three washes, transfer them to 100 milliliters of 2.5%sterile saline and mix well.Pack 50 milliliters of treated Artemia cyst mix into a sterile 100-milliliter bottle. Using a film, seal the bottle thoroughly and place it in a shaking incubator with light. Next, using a Pasteur pipette, extract 30 milliliters of hatching Artemia nauplii from the middle and lower layers.After filtering, wash the Artemia three times with sterile ultrapure water for about one minute, and add four milliliters of sterile ultrapure water. Finally, using a disposable Pasteur pipette, retrieve actively swimming Artemia from the upper layer, wash, and prepare the solution for feeding. Microscopic observation confirmed efficient hatching of Artemia cysts after the treatment.