Name: Autor destacado: Establecimiento de peces cebra libres de gérmenes para estudios de relaciones entre la microbiota y el huésped
Uploaded: 2024-04-12T13:50:00
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Agradecemos sinceramente el apoyo del Proyecto de Talento de la Universidad Médica de Chongqing (No. R4014 para DSP y R4020 para PPJ), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC, No.32200386 para PPJ), el Estudio Mentor de Innovación Postdoctoral de Chongqing (X7928 DSP) y el Programa del Centro Conjunto China-Sri Lanka para la Investigación y Demostración de Tecnología del Agua de la Academia China de Ciencias (CAS) / Centro Conjunto China-Sri Lanka para la Educación y la Investigación de CAS.

Los experimentos con peces se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado y Uso de Animales de Chongqing y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Chongqing, China, así como con las normas para animales de experimentación emitidas por la Oficina Estatal de Calidad y Supervisión Técnica (ID de aprobación: GB14922-2001 a GBT14927-2001). El pez cebra (Danio rerio, tipo salvaje, cepa AB) se obtuvo del Instituto de Hidrobiología de la Academia...

Optimización de modelos de pez cebra GF: generación, mantenimiento y estudios microbianos

Pasos críticos dentro de los protocolos de preparación de pescado y alimentos sin gluten Durante la generación de los modelos de peces GF, se involucraron varios pasos críticos, incluida la preparación de materiales estériles, la esterilización de embriones, la renovación diaria de GZM, la recolección de varias muestras y el examen estéril de cada muestra utilizando múltiples métodos. Entre estos pasos, el tratamiento inicial de los embriones es fundamental y decisivo para el éxito de los...

La microbiota (es decir, arqueas, bacterias, eucariotas y virus) desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la salud del huésped y contribuye al desarrollo de diversas enfermedades al influir en los procesos fisiológicos y patológicos a través de interacciones simbióticas dentro de la barrera intestinal, la superficie epitelial y las funciones de la mucina en los individuos 1,2,3. La composición de la microbiota en las diferentes etapas de la vida, desde la infancia hasta la juventud, la adultez y el envejecimiento, así como su presencia en diversos lugares, como las narinas, la boca, la piel y los intestinos, está moldeada dinámicamente por diversos hábitats y entornos4. La microbiota intestinal de los organismos está implicada en la absorción de nutrientes, la respuesta inmunitaria, la invasión de patógenos, la regulación metabólica, etcétera 5,6. Los estudios en pacientes han demostrado que las alteraciones de la microbiota intestinal están relacionadas con la obesidad humana, los trastornos del sueño, la depresión, la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), las enfermedades neurodegenerativas (Parkinson, Alzheimer), el envejecimiento y diversos tipos de cáncer 7,8,9. Además, las vías interactivas entre la microbiota intestinal y los huéspedes involucran factores inflamatorios, neurotransmisores, metabolitos, barrera intestinal y estrés oxidativo, como se observó en investigaciones anteriores con modelos de ratones y peces10,11.
Recientemente, se han explorado múltiples enfoques o terapias relacionados con las bacterias, incluidos los posibles probióticos y el trasplante de microbiota fecal (TMF), para estos trastornos en modelos clínicos y animales. Estas exploraciones se basan en descubrimientos relacionados con el eje microbiota-intestino-cerebro/hígado/riñón, los productos derivados de la microbiota y la alteración de la actividad de los receptores12,13. Sin embargo, el desarrollo, las diversas funciones y los mecanismos del sistema microbiota-huésped aún no se comprenden e identifican completamente debido a la complejidad de la comunidad microbiana y al desafío de generar modelos potentes de enfermedades similares a los humanos.
Para abordar estos problemas, a mediadosdel siglo XIX se propusieron urgentemente modelos animales libres de gérmenes (GF) y se desarrollaron principalmente durante el sigloXX. Los refinamientos posteriores, incluidos los modelos tratados con antibióticos y gnotobióticos, junto con los avances en las tecnologías de detección y observación microbiana, perfeccionaron aún más estos modelos 14,15,16. Los animales GF, creados borrando su propio fondo y evitando los microbios ambientales, ofrecen una excelente estrategia para explorar las interacciones entre los microorganismos y sus huéspedes17. A través de la aplicación de modelos animales y protocolos refinados, los investigadores han replicado con éxito composiciones microbianas similares encontradas en pacientes con ratones y peces GF. Además, otros modelos animales de GF, como perros, pollos y cerdos, ofrecen diversas opciones como sujetos de investigación 18,19,20,21. Este enfoque ha permitido investigar los posibles efectos terapéuticos de los microbiomas comensales en diversas enfermedades, incluida la inmunoterapia contra el cáncer en humanos16,18. Los modelos GF ofrecen información más precisa sobre las características y los mecanismos de la colonización, migración, multiplicación e interacción bacteriana específica dentro de los huéspedes. Esto proporciona nuevos conocimientos cruciales sobre la aparición y el desarrollo de enfermedades relacionadas con la microbiota22,23. La historia del establecimiento y la aplicación del pez cebra GF en la investigación microbiana ha evolucionado desde los informes de Rawls et al. en 2004 y Bates et al. en 2006 hasta el protocolo de Melancon et al. en 2017 16,24,25. Sin embargo, la viabilidad de los modelos de GF adultos o reproductivos sigue siendo un proceso prolongado, acompañado de longevidad, tasas de éxito y desafíos de salud variables.
Entre varios modelos animales, el pez cebra (Danio rerio) se destaca como una herramienta crítica para la investigación básica y biomédica debido a su ventajosa similitud con los órganos humanos y la genómica, su corto ciclo de desarrollo, su alta fecundidad y sus embriones transparentes19,26. El pez cebra, que sirve como modelo fiable de enfermedades humanas, ofrece una representación visual de los procesos fisiológicos y patológicos in vivo, proporcionando información sobre las atractivas características de las interacciones huésped-microbio. En particular, el pez cebra exhibe linajes celulares distintos, lo que permite obtener imágenes de la fisiología intestinal, la dinámica microbiana, las gónadas y el desarrollo reproductivo, la maduración del sistema inmunológico del huésped, el comportamiento y el metabolismo. Los embriones de pez cebra se desarrollan dentro de coriones protectores hasta la eclosión, convirtiéndose en larvas a los 3 días después de la fertilización (dpf). Cazan activamente alimento a los 5 dpf y alcanzan la madurez sexual alrededor de los 3 meses después de la fertilización (mpf)28. El primer pez cebra libre de gérmenes (GF) exitoso, reportado por Rawls et al.24, mostró que las larvas alimentadas con alimento esterilizado en autoclave después de la absorción de la yema exhibieron necrosis tisular a partir de 8 dpf y muerte total a 20 dpf. Esto indicó los efectos de la dieta o la importancia de considerar el suministro de nutrientes exógenos en experimentos con peces GF a largo plazo (>7 dpf)29. Estudios posteriores mejoraron el protocolo de generación de peces GF, empleando alimentos estériles y métodos perfeccionados en diferentes modelos de peces16.
Sin embargo, la mayoría de las investigaciones sobre modelos de pez cebra GF se han centrado en las primeras etapas de la vida, involucrando infección bacteriana a 5 dpf durante 24 h a 48 h, con muestras recolectadas antes de 7 dpf al final de los experimentos 25,30,31. Es ampliamente reconocido que la microbiota de los organismos, incluidos los humanos y el pez cebra, se coloniza al comienzo de la vida y se moldea durante el crecimiento y el desarrollo. La composición se mantiene estable en las etapas adultas, y el papel de la microbiota en el huésped es crucial a lo largo de la vida, especialmente en los aspectos relacionados con el envejecimiento, la obesidad neurodegenerativa, la obesidad metabólica y las enfermedades intestinales3. Por lo tanto, las perspectivas de los animales GF con una supervivencia más larga pueden proporcionar información sobre los mecanismos de los roles microbianos en el desarrollo y las funciones de los órganos del huésped, considerando los sistemas inmunológico y reproductivo inmaduros de las larvas de peces en los primeros años de vida. Si bien las cepas bacterianas en los intestinos del pez cebra se han aislado e identificado en estudios previos, lo que ofrece el potencial de infectar modelos animales GF para seleccionar probióticos o investigar las funciones bacterianas en el huésped19,25, la generación y aplicación de modelos de peces GF se ha restringido principalmente a las primeras etapas de la vida. Esta limitación, atribuida al complejo proceso de producción, a los elevados costes de mantenimiento y a los problemas asociados con la alimentación y la inmunidad, dificulta los esfuerzos de investigación destinados a investigar los efectos crónicos y del desarrollo de la microbiota en el huésped.
La tasa de supervivencia, el comportamiento, el crecimiento, la maduración y la salud general de los peces, especialmente en modelos libres de gérmenes (GF), están significativamente influenciados por las prácticas de alimentación, que abarcan la ingesta y absorción de nutrientes durante el período de apertura de la boca desde las larvas tempranas hasta los juveniles32,33. Sin embargo, uno de los desafíos en la cría de peces transgénicos es la escasez de dietas estériles adecuadas, lo que limita la efectividad del apoyo nutricional para mantener el crecimiento y la supervivencia de las larvas. Resolver este problema es crucial para restaurar la vida de los peces GF, teniendo en cuenta sus mecanismos de defensa del desarrollo y su débil capacidad de digestión debido a la ausencia de un microbioma intestinal. En términos de alimentación, el camarón de salmuera vivo (Artemia sp.) emerge como la dieta más adecuada para las larvas con la boca abierta a los peces juveniles. Se ha observado que los peces alimentados con camarones vivos exhiben mayores tasas de crecimiento y supervivencia en comparación con los alimentados con yema de huevo cocida u otros cebos naturales y sintéticos34. Si bien los modelos de vida temprana de los peces GF pueden sobrevivir con el apoyo de la yema y los modelos de larvas GF pueden mantenerse con alimentación estéril, la generación de modelos a largo plazo desde larvas hasta juveniles y alcanzar la madurez sexual sigue siendo un desafío. Además, los alimentos en escamas o en polvo están limitados por una composición nutricional desigual y pueden afectar la calidad del agua. Por el contrario, la Artemia viva tiene ventajas como la supervivencia tanto en agua salada como dulce, tamaño pequeño adecuado para larvas y adultos, facilidad de procesamiento por lotes y mayor calidad de eclosión35. Sobre la base de los métodos anteriores 16,24,30, hemos simplificado el complejo proceso de tratamiento y abordado el desafío de la dieta al establecer Artemia sp. viva GF fácilmente incubable como alimento estéril durante períodos más largos que los peces GF tempranos.
Este estudio presenta un protocolo optimizado que cubre (1) la generación, (2) el mantenimiento, (3) la identificación de la tasa de esterilidad y (4) el mantenimiento y la alimentación para garantizar el crecimiento del pez cebra libre de gérmenes (GF) desde los embriones hasta las larvas y las etapas juveniles. Los resultados ofrecen evidencia preliminar sobre la eclosión, supervivencia, crecimiento y esterilidad del pez cebra GF, junto con índices esenciales para GF Artemia sp. como alimento estéril. Los pasos detallados en la generación de modelos y la preparación de alimentos vivos estériles proporcionan un apoyo técnico crucial para la construcción y aplicación de modelos a largo plazo de peces GF, así como de GF Artemia sp. en la investigación de la interacción entre la microbiota y el huésped. El protocolo aborda el aislamiento, la identificación y la infección bacteriana en modelos de peces GF, describiendo métodos para el etiquetado de fluorescencia bacteriana y observando su colonización en los intestinos de los peces bajo un microscopio. Los peces GF, los peces gnotobióticos con infección bacteriana o los modelos de microbiota humana transferidos se someterán a diversas detecciones para dilucidar sus funciones y efectos sobre la inmunidad del huésped, la digestión, el comportamiento, la regulación transcriptómica y los aspectos metabólicos. A largo plazo, este protocolo puede extenderse a diferentes especies de peces de tipo salvaje, como la medaka marina, y potencialmente a otras líneas de pez cebra transgénicas seleccionadas correlacionadas con tejidos o enfermedades específicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AB-GZM</td>
			<td>Amphotericin:Solarbio;&#160; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.</td>
			<td>Amphotericin:CAS:1397-89-3; 
			kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.</td>
			<td>49.6 mL GZM, 50 &#181;L amphotericin stock solution (250 &#181;g/mL), 25 &#181;L kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 &#181;L ampicillin stock solution (20 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-15-M</td>
			<td>To collect samples, and hold agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates, 24-, 48- well plates</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>11112</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aeronomas</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178499</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic work station</td>
			<td>GENE SCIENCE</td>
			<td>E200G</td>
			<td>Bacterial isolation, sterile testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis</td>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>v6.07</td>
			<td>To analysis the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API 20 E kits</td>
			<td>&#160;BioMerieux SA, France</td>
			<td>No.1005915090</td>
			<td>Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia (Brine shrimp)</td>
			<td>Shangjia Aquarium Co., Ltd.</td>
			<td>Aquamaster brand</td>
			<td>Artemia cysts, and brine shrimp eggs&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto cycle system for fish culture</td>
			<td>Ningbo Hairui Technology Co., Ltd</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Maintain the fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Zeal Way</td>
			<td>G154DWS</td>
			<td>Prepare the materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Aerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Anaerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>LongYue Co., Ltd</td>
			<td>SPX</td>
			<td>For fish and plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Haier</td>
			<td>HR40-IIA2</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood plates</td>
			<td>sheep blood:Solarbio</td>
			<td>Cat. NO. TX0030</td>
			<td>Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-Dil dyes</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Cat#C7000&#160;&#160;</td>
			<td>To label the bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature shaking incubator</td>
			<td>Peiving Co., Ltd</td>
			<td>HZQ-X100</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>Bacteria and Archaea database</td>
			<td>Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ 
			Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pasteur pipette</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>bs-xh-03l</td>
			<td>Used to change water, and transfer eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dish</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-90-D</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA kits</td>
			<td>Solaribio</td>
			<td>Cat#D1600</td>
			<td>Bacterial genomic DNA extraction kits&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric pipette</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>Levo me</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exiguobacterium</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178504</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZM</td>
			<td>Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd.</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory pure water system</td>
			<td>Hitech Co., Ltd</td>
			<td>Prima-S15</td>
			<td>Prepare the agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td>With fluorescent light to observe fish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR kits</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>Cat#ET101</td>
			<td>Taq DNA Polymerase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>sp-013-10</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine (PVP-I)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>Lot#H1217005</td>
			<td>Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timing converter</td>
			<td>PinYi Co., Ltd</td>
			<td>AL-06</td>
			<td>To regulate the light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Aerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Anaerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clean workbench</td>
			<td>Airtech</td>
			<td>SW-CJ-2FD</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure flow system for fish culture</td>
			<td>Marine Biological Equipment company</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Produce water for fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178501</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, maintenance, and identification of germ-free zebrafish models from larvae to juvenile stages

El pez cebra sirve como modelos valiosos para la investigación sobre el crecimiento, la inmunidad y la microbiota intestinal debido a sus similitudes genómicas con los mamíferos, embriones transparentes desarrollados en un entorno de corion relativamente limpio y un desarrollo extremadamente rápido de las larvas en comparación con los modelos de roedores. El pez cebra libre de gérmenes (Danio rerio) es crucial para evaluar la toxicidad de los contaminantes y establecer modelos de enfermedades similares a las humanas relacionadas con las funciones microbianas. En comparación con los modelos de cría convencional (CR) (peces en cría común), el pez cebra GF permite una manipulación más precisa de la microbiota del huésped, lo que ayuda a determinar la relación causal entre los microorganismos y los huéspedes. En consecuencia, desempeñan un papel fundamental en el avance de nuestra comprensión de estas relaciones. Sin embargo, los modelos de pez cebra GF generalmente se generan e investigan durante las primeras etapas de la vida (desde embriones hasta larvas) debido a limitaciones en la función inmune y la absorción de nutrientes. Este estudio optimiza la generación, el mantenimiento y la identificación de modelos tempranos de pez cebra GF sin alimentación y con alimentación a largo plazo utilizando alimentos GF (como Artemia sp., camarones en salmuera). A lo largo del proceso, se realizaron muestreos e identificados diariamente a través de múltiples detecciones, incluidas placas y secuenciación de ARNr 16S. Se registraron la tasa de aséptica, la supervivencia y los índices de desarrollo del pez cebra GF para garantizar la calidad y cantidad de los modelos generados. Es importante destacar que este estudio proporciona detalles sobre el aislamiento bacteriano y las técnicas de infección para peces GF, lo que permite la creación eficiente de modelos de peces GF desde las etapas larvales hasta juveniles con el apoyo alimenticio de GF. Al aplicar estos procedimientos en la investigación biomédica, los científicos pueden comprender mejor las relaciones entre las funciones bacterianas intestinales y la salud del huésped.

The microbiota (i.e., Archaea, Bacteria, Eukarya, and viruses) play crucial roles in maintaining host health and contributing to the development of various diseases by influencing physiological and pathological processes through symbiotic interactions within the intestinal barrier, epithelial surface, and mucin functions in individuals1,2,3. The composition of the microbiota across different life stages, from infancy to juvenility, adulthood, and aging, as well as its presence in various locations such as nares, oral, skin, and gut sites, is dynamically shaped by diverse habitats and environments4. The intestinal microbiota in organisms is involved in nutrient absorption, immune response, pathogen invasion, metabolic regulation, etc5,6. Studies on patients have demonstrated that disruptions in gut microbiota are related to human obesity, sleep disorders, depression, inflammatory bowel disease (IBD), neurodegenerative diseases (Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s), aging, and various cancers7,8,9. Furthermore, interactive pathways between gut microbiota and hosts involve inflammatory factors, neurotransmitters, metabolites, intestinal barrier, and oxidative stress, as observed in previous research using mice and fish models10,11.
Recently, multiple bacteria-related approaches or therapies, including potential probiotics and fecal microbiota transplantation (FMT), have been explored for these disorders in clinical and animal models. These explorations are based on discoveries related to the microbiota-gut-brain/liver/kidney axis, microbiota-derived products, and altered receptor activity12,13. However, the development, various functions, and mechanisms of the microbiota-host system are still incompletely understood and identified due to the complexity of the microbial community and the challenge of generating powerful human-like disease models.
To address these issues, germ-free (GF) animal models were urgently proposed in the mid-19th century and primarily developed during the 20th century. Subsequent refinements, including antibiotic-treated and gnotobiotic models, along with advancements in microbial detection and observation technologies, further perfected these models14,15,16. GF animals, created by erasing their own background and avoiding environmental microbes, offer an excellent strategy for exploring the interactions between microorganisms and their hosts17. Through the application of animal models and refined protocols, researchers have successfully replicated similar microbial compositions found in patients in GF mice and fish. Additionally, other GF animal models, such as dogs, chickens, and pigs, provide diverse options as research subjects18,19,20,21. This approach has enabled investigations into the potential therapeutic effects of commensal microbiomes on various diseases, including cancer immunotherapy in humans16,18. GF models offer more accurate insights into the characteristics and mechanisms of specific bacterial colonization, migration, multiplication, and interaction within hosts. This provides crucial novel insights into the occurrence and development of microbiota-related diseases22,23. The history of establishing and applying GF zebrafish in microbial research has evolved from the reports of Rawls et al. in 2004 and Bates et al. in 2006 to Melancon et al.&#39;s protocol in 201716,24,25. However, the feasibility of adult or breeding GF models is still a prolonged process, accompanied by variable longevity, success rates, and health challenges.
Among various animal models, zebrafish (Danio rerio) stands out as a critical tool for both basic and biomedical research due to its advantageous similarity to human organs and genomics, short developmental cycle, high fecundity, and transparent embryos19,26. Zebrafish, serving as reliable human disease models, offer a visual representation of physiological and pathological processes in vivo, providing insights into the attractive features of host-microbe interactions. Notably, zebrafish exhibit distinct cell lineages, allowing imaging of intestinal physiology, microbial dynamics, gonads and reproductive development, maturation of the host immune system, behavior, and metabolism27. Zebrafish embryos develop within protective chorions until hatching, becoming larvae at 3 days post-fertilization (dpf). They actively hunt for food at 5 dpf and reach sexual maturity around 3 months post-fertilization (mpf)28. The first successful germ-free (GF) zebrafish, reported by Rawls et al.24, showed that larvae fed with autoclaved feed after yolk absorption exhibited tissue necrosis from 8 dpf and total death at 20 dpf. This indicated the effects of diet or the importance of considering exogenous nutrient supply in experiments involving long-term (&#62;7 dpf) GF fish29. Subsequent studies improved the generation protocol of GF fish, employing sterile food and methods perfected in different fish models16.
However, most research on GF zebrafish models has focused on early life stages, involving bacterial infection at 5 dpf for 24 h to 48 h, with samples collected before 7 dpf at the conclusion of the experiments25,30,31. It&#39;s widely acknowledged that the microbiota in organisms, including humans and zebrafish, is colonized at the beginning of life and shaped during growth and development. The composition remains stable at adult stages, with the roles of microbiota in the host being crucial throughout life, especially in aging, neurodegenerative, metabolic-related obesity, and intestinal disease aspects3. Thus, perspectives from GF animals with longer survival can provide insights into the mechanisms of microbial roles in host organ development and functions, considering the immature immune and reproductive systems of fish larvae in early life. While bacterial strains in zebrafish intestines have been isolated and identified in previous studies, offering the potential for infecting GF animal models to select probiotics or research bacterial functions in the host19,25, the generation and application of GF fish models have primarily been restricted to early life stages. This limitation, attributed to the complex production process, high maintenance costs, and associated issues with food and immunity, hinders research efforts aimed at investigating the developmental and chronic effects of microbiota in the host.
The survival rate, behavior, growth, maturation, and overall health of fish, especially in germ-free (GF) models, are significantly influenced by feeding practices, encompassing nutrition intake and absorption during the mouth-open period from early larvae to juveniles32,33. However, one of the challenges in GF fish husbandry is the scarcity of suitable sterile diets, limiting the effectiveness of nutritional support for sustaining the growth and survival of larvae. Resolving this issue is crucial to restoring the life of GF fish, considering their developmental defense mechanisms and weak digestion abilities due to the absence of an intestinal microbiome. In terms of food, live brine shrimp (Artemia sp.) emerges as the most suitable diet for mouth-open larvae to juvenile fish. It has been observed that fish fed with live brine shrimp exhibit higher growth and survival rates compared to those fed with cooked egg yolk or other natural and synthetic baits34. While early life models of GF fish can survive with yolk support and GF larvae models can be maintained with sterile feeding, generating long-term models from larvae to juveniles and reaching sexual maturity remains challenging. Additionally, flake or powder food is limited by unequal nutritional composition and can impact water quality. In contrast, live Artemia has advantages such as survival in both salt and freshwater, small size suitable for larvae to adults, ease of batching, and higher hatching quality35. Building upon previous methods16,24,30, we have simplified the complex treatment process and addressed the diet challenge by establishing easily incubated GF live Artemia sp. as sterile food for longer durations than early-life GF fish.
This study presents an optimized protocol covering (1) generation, (2) maintenance, (3) identification of sterile rate, and (4) maintenance and feeding to ensure the growth of germ-free (GF) zebrafish from embryos to larvae and juvenile stages. The results offer preliminary evidence on the hatching, survival, growth, and sterility of GF zebrafish, along with essential indices for GF Artemia sp. as sterile food. The detailed steps in model generation and preparation of sterile live foods provide crucial technical support for constructing and applying long-term GF fish models, as well as GF Artemia sp. in microbiota-host interaction research. The protocol addresses bacterial isolation, identification, and infection on GF fish models, outlining methods for bacterial fluorescence labeling and observing their colonization in fish intestines under a microscope. GF fish, gnotobiotic fish with bacterial infection, or transferred human microbiota models will undergo various detections to elucidate their functions and effects on host immunity, digestion, behavior, transcriptomic regulation, and metabolic aspects. In the long term, this protocol can be extended to different wild-type fish species, such as marine medaka, and potentially to other selected transgenic zebrafish lines correlated to specific tissues or diseases.

Autor destacado: Establecimiento de peces cebra libres de gérmenes para estudios de relaciones entre la microbiota y el huésped

Generación, mantenimiento e identificación de modelos de pez cebra libres de gérmenes desde las larvas hasta las etapas juveniles

The scope of this research is generation of novel, germ-free animal models, which will be helpful and powerful tools in investigation of various microbiome functions. In this field, the early germ-free fish models have been used recently, but the long-term models are still limited due to various culture conditions and the staff developmental defense. The current GF fish models are normally early life ones.Thus, the technologies including the sterile scale, the sample detection methods, and providing sterile food are very important challenges to overcome. The germ-free zebrafish model is crucial for studying host-microbiota interaction and their impacts on development and the immunity and disease. This model allows researchers to precisely manipulate the single gut bacteria and observe its effect on the transparent zebrafish embryos.It provides valuable insights into the roles of gut microbes inheriting the disease. In the future, our research will mainly focused on establishing a germ-free zebrafish model for entire life cycle to better understanding the function of the gut microbiome.

Los modelos de pez cebra GF se pueden producir de manera eficiente utilizando los abundantes huevos desovados por parejas de peces cebra, con el protocolo optimizado sobre la base de modelos anteriores de peces GF35. Una sola placa de 6 pocillos puede cultivar aproximadamente de 30 a 48 embriones/larvas, lo que permite una amplia recopilación de datos y análisis estadísticos. Después del tratamiento estéril, los embriones GF se cultivan en una incubadora limpia hasta la eclosión de las larva...

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Este protocolo describe los pasos principales para obtener embriones de peces libres de gérmenes (GF) y mantenerlos desde las larvas hasta la etapa juvenil, incluido el muestreo y la detección de su estado estéril. El uso de modelos de GF con infección es importante para comprender el papel de los microbios en la salud del huésped.

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

El alcance de esta investigación es la generación de nuevos modelos animales libres de gérmenes, que serán herramientas útiles y poderosas en la investigación de diversas funciones del microbioma. En este campo, los primeros modelos de peces libres de gérmenes se han utilizado recientemente, pero los modelos a largo plazo aún son limitados debido a diversas condiciones de cultivo y la defensa del desarrollo del personal. Los modelos actuales de peces GF son normalmente los de los primeros años de vida.Por lo tanto, las tecnologías, incluida la escala estéril, los métodos de detección de muestras y el suministro de alimentos estériles, son desafíos muy importantes a superar. El modelo de pez cebra libre de gérmenes es crucial para estudiar la interacción entre el huésped y la microbiota y sus impactos en el desarrollo, la inmunidad y la enfermedad. Este modelo permite a los investigadores manipular con precisión las bacterias intestinales individuales y observar su efecto en los embriones transparentes de pez cebra.Proporciona información valiosa sobre el papel de los microbios intestinales en la herencia de la enfermedad. En el futuro, nuestra investigación se centrará principalmente en establecer un modelo de pez cebra libre de gérmenes durante todo el ciclo de vida para comprender mejor la función del microbioma intestinal.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

Investigación

Biología del Desarrollo

Generation of Germ-Free Zebrafish Models from Embryos

Generación de modelos de pez cebra libres de gérmenes a partir de embriones

GF Artemia nauplii Preparation for Chronic GF Zebrafish Nutrition

To begin, obtain 0.25 grams of Artemia cysts and rinse them with 2.4 grams per liter sodium hypochlorite for five minutes. Filter the rinsed cysts with a sterilized ultra dense filter and wash with sterilized ultrapure water for one to two minutes. After three washes, transfer them to 100 milliliters of 2.5%sterile saline and mix well.Pack 50 milliliters of treated Artemia cyst mix into a sterile 100-milliliter bottle. Using a film, seal the bottle thoroughly and place it in a shaking incubator with light. Next, using a Pasteur pipette, extract 30 milliliters of hatching Artemia nauplii from the middle and lower layers.After filtering, wash the Artemia three times with sterile ultrapure water for about one minute, and add four milliliters of sterile ultrapure water. Finally, using a disposable Pasteur pipette, retrieve actively swimming Artemia from the upper layer, wash, and prepare the solution for feeding. Microscopic observation confirmed efficient hatching of Artemia cysts after the treatment.