Name: Författare i fokus: Etablering av bakteriefria zebrafiskar för studier av förhållandet mellan mikrobiota och värd
Uploaded: 2024-04-12T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Establishing Germ-Free Zebrafish for Microbiota-Host Relationship Studies at JoVE.com

Vi tackar uppriktigt stödet från Chongqing Medical University Talent Project (nr R4014 till DSP och R4020 till PPJ), National Natural Science Foundation of China (NSFC, nr 32200386 till PPJ), Chongqing Postdoctoral Innovation Mentor Studio (X7928 DSP) och programmet för Kina-Sri Lanka Joint Center for Water Technology Research and Demonstration av Chinese Academy of Sciences (CAS)/China-Sri Lanka Joint Center for Education and Research by CAS.

Fiskexperimenten utfördes i enlighet med riktlinjerna från Animal Care and Use Committee of Chongqing och Institutional Animal Care and Use Committee of Chongqing Medical University, Kina, samt de standarder för försöksdjur som utfärdats av State Bureau of Quality and Technical Supervision (Approval ID: GB14922-2001 to GBT14927-2001). Zebrafiskar (Danio rerio, vildtyp, AB-stam) hämtades från Institutet för hydrobiologi, Chinese Academy of Sciences, och hölls i laboratoriet enligt tidigare rapporterade ...

Optimering av GF Zebrafish-modeller: Generering, underhåll och mikrobiella studier

Kritiska steg inom protokollen för GF-fisk och GF-matlagning Under genereringen av GF-fiskmodeller var flera kritiska steg inblandade, inklusive beredning av sterila material, sterilisering av embryon, daglig förnyelse av GZM, insamling av olika prover och steril undersökning av varje prov med flera metoder. Bland dessa steg är den initiala behandlingen av embryon grundläggande och avgörande för framgången för GF-modeller. Kontrollmedel, deras koncentrationer och behandlingstider är avgöran...

Mikrobiotan (dvs. arkéer, bakterier, eukarya och virus) spelar avgörande roller för att upprätthålla värdens hälsa och bidra till utvecklingen av olika sjukdomar genom att påverka fysiologiska och patologiska processer genom symbiotiska interaktioner inom tarmbarriären, epitelytan och mucinfunktioner hos individer 1,2,3. Sammansättningen av mikrobiotan i olika livsstadier, från spädbarn till ungdom, vuxen ålder och åldrande, såväl som dess närvaro på olika platser som näsa, orala, hud- och tarmplatser, formas dynamiskt av olika livsmiljöer och miljöer4. Tarmmikrobiotan i organismer är involverad i näringsupptag, immunsvar, patogeninvasion, metabolisk reglering, etc 5,6. Studier på patienter har visat att störningar i tarmmikrobiotan är relaterade till mänsklig fetma, sömnstörningar, depression, inflammatorisk tarmsjukdom (IBD), neurodegenerativa sjukdomar (Parkinsons, Alzheimers), åldrande och olika cancerformer 7,8,9. Dessutom involverar interaktiva vägar mellan tarmmikrobiota och värdar inflammatoriska faktorer, neurotransmittorer, metaboliter, tarmbarriär och oxidativ stress, som observerats i tidigare forskning med hjälp av möss- och fiskmodeller 10,11.
Nyligen har flera bakterierelaterade tillvägagångssätt eller terapier, inklusive potentiell probiotika och transplantation av fekal mikrobiota (FMT), utforskats för dessa störningar i kliniska modeller och djurmodeller. Dessa utforskningar är baserade på upptäckter relaterade till mikrobiota-tarm-hjärna/lever/njur-axeln, mikrobiota-härledda produkter och förändrad receptoraktivitet12,13. Utvecklingen, de olika funktionerna och mekanismerna för mikrobiota-värdsystemet är dock fortfarande ofullständigt förstådda och identifierade på grund av komplexiteten i det mikrobiella samhället och utmaningen att generera kraftfulla människoliknande sjukdomsmodeller.
För att ta itu med dessa problem föreslogs bakteriefria (GF) djurmodeller i mitten av 1800-talet och utvecklades främst under1900-talet. Efterföljande förbättringar, inklusive antibiotikabehandlade och gnotobiotiska modeller, tillsammans med framsteg inom mikrobiell detektion och observationsteknik, fulländade dessa modeller ytterligare 14,15,16. GF-djur, som skapats genom att radera sin egen bakgrund och undvika miljömikrober, erbjuder en utmärkt strategi för att utforska interaktionerna mellan mikroorganismer och deras värdar17. Genom tillämpning av djurmodeller och förfinade protokoll har forskare framgångsrikt replikerat liknande mikrobiella sammansättningar som finns hos patienter hos GF-möss och fiskar. Dessutom ger andra GF-djurmodeller, såsom hundar, kycklingar och grisar, olika alternativ som försökspersoner 18,19,20,21. Detta tillvägagångssätt har möjliggjort undersökningar av de potentiella terapeutiska effekterna av kommensala mikrobiom på olika sjukdomar, inklusive cancerimmunterapi hos människor16,18. GF-modeller ger mer exakta insikter om egenskaperna och mekanismerna för specifik bakteriell kolonisering, migration, multiplikation och interaktion inom värdar. Detta ger viktiga nya insikter om förekomst och utveckling av mikrobiotarelaterade sjukdomar22,23. Historien om att etablera och tillämpa GF-zebrafisk i mikrobiell forskning har utvecklats från rapporterna från Rawls et al. 2004 och Bates et al. 2006 till Melancon et al.:s protokoll 2017 16,24,25. Genomförbarheten av GF-modeller för vuxna eller avel är dock fortfarande en långvarig process, åtföljd av varierande livslängd, framgångsfrekvenser och hälsoutmaningar.
Bland olika djurmodeller sticker zebrafisk (Danio rerio) ut som ett kritiskt verktyg för både grundforskning och biomedicinsk forskning på grund av dess fördelaktiga likhet med mänskliga organ och genomik, kort utvecklingscykel, hög fruktsamhet och transparenta embryon19,26. Zebrafiskar, som fungerar som tillförlitliga mänskliga sjukdomsmodeller, erbjuder en visuell representation av fysiologiska och patologiska processer in vivo, vilket ger insikter om de attraktiva egenskaperna hos värd-mikrobinteraktioner. Noterbart är att zebrafiskar uppvisar distinkta cellinjer, vilket möjliggör avbildning av tarmfysiologi, mikrobiell dynamik, könskörtlar och reproduktiv utveckling, mognad av värdens immunsystem, beteende och ämnesomsättning27. Zebrafiskembryon utvecklas inom skyddande korioner tills de kläcks och blir larver 3 dagar efter befruktning (dpf). De jagar aktivt efter mat vid 5 dpf och blir könsmogna cirka 3 månader efter befruktning (mpf)28. Den första framgångsrika bakteriefria zebrafisken, rapporterad av Rawls et al.24, visade att larver som matades med autoklaverat foder efter att gulan absorberats uppvisade vävnadsnekros från 8 dpf och total död vid 20 dpf. Detta indikerade effekterna av kosten eller vikten av att ta hänsyn till exogen näringstillförsel i experiment med långtidsbehandling (>7 dpf) GF-fisk29. Efterföljande studier förbättrade genereringsprotokollet för GF-fisk genom att använda steril mat och metoder som fulländats i olika fiskmodeller16.
Den mesta forskningen på GF-zebrafiskmodeller har dock fokuserat på tidiga livsstadier, som involverar bakteriell infektion vid 5 dpf i 24 timmar till 48 timmar, med prover tagna före 7 dpf i slutet av experimenten 25,30,31. Det är allmänt erkänt att mikrobiotan i organismer, inklusive människor och zebrafiskar, koloniseras i början av livet och formas under tillväxt och utveckling. Sammansättningen förblir stabil i vuxenstadier, där mikrobiotans roll i värden är avgörande under hela livet, särskilt vid åldrande, neurodegenerativ, metaboliskt relaterad fetma och tarmsjukdomsaspekter3. Således kan perspektiv från GF-djur med längre överlevnad ge insikter i mekanismerna för mikrobiella roller i värdorganens utveckling och funktioner, med tanke på de omogna immun- och reproduktionssystemen hos fisklarver tidigt i livet. Medan bakteriestammar i zebrafisktarmar har isolerats och identifierats i tidigare studier, vilket ger möjlighet att infektera GF-djurmodeller för att välja probiotika eller forska om bakteriella funktioner i värden19,25, har generering och tillämpning av GF-fiskmodeller främst begränsats till tidiga livsstadier. Denna begränsning, som tillskrivs den komplexa produktionsprocessen, höga underhållskostnader och tillhörande problem med mat och immunitet, hindrar forskningsinsatser som syftar till att undersöka de utvecklingsmässiga och kroniska effekterna av mikrobiota i värden.
Överlevnadsgraden, beteendet, tillväxten, mognaden och den allmänna hälsan hos fiskar, särskilt i bakteriefria (GF) modeller, påverkas i hög grad av utfodringsmetoder, vilket omfattar näringsintag och absorption under den öppna munnen från tidiga larver till unga exemplar32,33. En av utmaningarna inom GF:s fiskodling är dock bristen på lämpliga sterila dieter, vilket begränsar effektiviteten av näringsstöd för att upprätthålla tillväxt och överlevnad av larver. Att lösa detta problem är avgörande för att återställa livet på GF-fiskar, med tanke på deras utvecklingsförsvarsmekanismer och svaga matsmältningsförmåga på grund av frånvaron av ett tarmmikrobiom. När det gäller föda framstår levande artemiaräkor (Artemia sp.) som den lämpligaste födan för larver som är öppna i munnen till unga fiskar. Det har observerats att fiskar som utfodras med levande artemiaräkor uppvisar högre tillväxt och överlevnad jämfört med de som utfodras med kokt äggula eller andra naturliga och syntetiska beten34. Även om tidiga livsmodeller av GF-fiskar kan överleva med stöd av gulor och GF-larvmodeller kan upprätthållas med steril utfodring, är det fortfarande en utmaning att generera långsiktiga modeller från larver till yngel och nå könsmognad. Dessutom begränsas fling- eller pulverfoder av ojämn näringssammansättning och kan påverka vattenkvaliteten. Däremot har levande Artemia fördelar som överlevnad i både salt- och sötvatten, liten storlek som lämpar sig för larver till vuxna, enkel batchning och högre kläckningskvalitet35. Genom att bygga vidare på tidigare metoder 16,24,30 har vi förenklat den komplexa behandlingsprocessen och tagit itu med kostutmaningen genom att etablera lätt inkuberad GF levande Artemia sp. som steril mat under längre tid än GF-fisk tidigt i livet.
Denna studie presenterar ett optimerat protokoll som täcker (1) generering, (2) underhåll, (3) identifiering av steril hastighet och (4) underhåll och utfodring för att säkerställa tillväxten av bakteriefria (GF) zebrafiskar från embryon till larver och juvenila stadier. Resultaten ger preliminära bevis på kläckning, överlevnad, tillväxt och sterilitet hos GF-zebrafisk, tillsammans med viktiga index för GF Artemia sp. som steril mat. De detaljerade stegen i modellgenerering och beredning av sterila levande livsmedel ger avgörande tekniskt stöd för att konstruera och tillämpa långsiktiga GF-fiskmodeller, såväl som GF Artemia sp. i forskning om mikrobiota-värdinteraktion. Protokollet behandlar bakteriell isolering, identifiering och infektion på GF-fiskmodeller, och beskriver metoder för märkning av bakteriell fluorescens och observation av deras kolonisering i fisktarmar under ett mikroskop. GF-fisk, gnotobiotisk fisk med bakteriell infektion eller överförda mänskliga mikrobiotamodeller kommer att genomgå olika detektioner för att belysa deras funktioner och effekter på värdens immunitet, matsmältning, beteende, transkriptomisk reglering och metaboliska aspekter. På lång sikt kan detta protokoll utvidgas till olika arter av vildtyp, såsom marin medaka, och eventuellt till andra utvalda transgena zebrafisklinjer som är korrelerade till specifika vävnader eller sjukdomar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AB-GZM</td>
			<td>Amphotericin:Solarbio;&#160; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.</td>
			<td>Amphotericin:CAS:1397-89-3; 
			kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.</td>
			<td>49.6 mL GZM, 50 &#181;L amphotericin stock solution (250 &#181;g/mL), 25 &#181;L kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 &#181;L ampicillin stock solution (20 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-15-M</td>
			<td>To collect samples, and hold agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates, 24-, 48- well plates</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>11112</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aeronomas</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178499</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic work station</td>
			<td>GENE SCIENCE</td>
			<td>E200G</td>
			<td>Bacterial isolation, sterile testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis</td>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>v6.07</td>
			<td>To analysis the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API 20 E kits</td>
			<td>&#160;BioMerieux SA, France</td>
			<td>No.1005915090</td>
			<td>Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia (Brine shrimp)</td>
			<td>Shangjia Aquarium Co., Ltd.</td>
			<td>Aquamaster brand</td>
			<td>Artemia cysts, and brine shrimp eggs&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto cycle system for fish culture</td>
			<td>Ningbo Hairui Technology Co., Ltd</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Maintain the fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Zeal Way</td>
			<td>G154DWS</td>
			<td>Prepare the materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Aerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Anaerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>LongYue Co., Ltd</td>
			<td>SPX</td>
			<td>For fish and plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Haier</td>
			<td>HR40-IIA2</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood plates</td>
			<td>sheep blood:Solarbio</td>
			<td>Cat. NO. TX0030</td>
			<td>Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-Dil dyes</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Cat#C7000&#160;&#160;</td>
			<td>To label the bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature shaking incubator</td>
			<td>Peiving Co., Ltd</td>
			<td>HZQ-X100</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>Bacteria and Archaea database</td>
			<td>Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ 
			Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pasteur pipette</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>bs-xh-03l</td>
			<td>Used to change water, and transfer eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dish</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-90-D</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA kits</td>
			<td>Solaribio</td>
			<td>Cat#D1600</td>
			<td>Bacterial genomic DNA extraction kits&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric pipette</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>Levo me</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exiguobacterium</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178504</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZM</td>
			<td>Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd.</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory pure water system</td>
			<td>Hitech Co., Ltd</td>
			<td>Prima-S15</td>
			<td>Prepare the agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td>With fluorescent light to observe fish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR kits</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>Cat#ET101</td>
			<td>Taq DNA Polymerase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>sp-013-10</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine (PVP-I)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>Lot#H1217005</td>
			<td>Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timing converter</td>
			<td>PinYi Co., Ltd</td>
			<td>AL-06</td>
			<td>To regulate the light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Aerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Anaerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clean workbench</td>
			<td>Airtech</td>
			<td>SW-CJ-2FD</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure flow system for fish culture</td>
			<td>Marine Biological Equipment company</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Produce water for fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178501</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, maintenance, and identification of germ-free zebrafish models from larvae to juvenile stages

Zebrafiskar fungerar som värdefulla modeller för forskning om tillväxt, immunitet och tarmmikrobiota på grund av deras genomiska likheter med däggdjur, genomskinliga embryon utvecklade i en relativt ren korionmiljö och extremt snabb utveckling av larver jämfört med gnagarmodeller. Bakteriefria zebrafiskar (Danio rerio) är avgörande för att utvärdera toxicitet för föroreningar och etablera människoliknande sjukdomsmodeller relaterade till mikrobiella funktioner. I jämförelse med konventionellt uppfödda (CR) modeller (fiskar i vanlig uppfödning) möjliggör GF-zebrafisk mer exakt manipulation av värdmikrobiotan, vilket hjälper till att bestämma orsakssambandet mellan mikroorganismer och värdar. Följaktligen spelar de en avgörande roll för att främja vår förståelse av dessa relationer. GF-zebrafiskmodeller genereras och undersöks dock vanligtvis under de tidiga livsstadierna (från embryon till larver) på grund av begränsningar i immunfunktion och näringsupptag. Denna studie optimerar genereringen, underhållet och identifieringen av tidiga GF-zebrafiskmodeller utan utfodring och med långvarig utfodring med hjälp av GF-foder (t.ex. Artemia sp., saltvattenräkor). Under hela processen utfördes och identifierades daglig provtagning och odling genom flera detektioner, inklusive plattor och 16S rRNA-sekvensering. Den aseptiska hastigheten, överlevnaden och utvecklingsindexen för GF-zebrafiskar registrerades för att säkerställa kvaliteten och kvantiteten på de genererade modellerna. Det är viktigt att denna studie ger detaljer om bakteriell isolering och infektionstekniker för GF-fiskar, vilket gör det möjligt att effektivt skapa GF-fiskmodeller från larver till unga stadier med GF-foderstöd. Genom att tillämpa dessa procedurer i biomedicinsk forskning kan forskare bättre förstå sambanden mellan tarmbakteriernas funktioner och värdens hälsa.

The microbiota (i.e., Archaea, Bacteria, Eukarya, and viruses) play crucial roles in maintaining host health and contributing to the development of various diseases by influencing physiological and pathological processes through symbiotic interactions within the intestinal barrier, epithelial surface, and mucin functions in individuals1,2,3. The composition of the microbiota across different life stages, from infancy to juvenility, adulthood, and aging, as well as its presence in various locations such as nares, oral, skin, and gut sites, is dynamically shaped by diverse habitats and environments4. The intestinal microbiota in organisms is involved in nutrient absorption, immune response, pathogen invasion, metabolic regulation, etc5,6. Studies on patients have demonstrated that disruptions in gut microbiota are related to human obesity, sleep disorders, depression, inflammatory bowel disease (IBD), neurodegenerative diseases (Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s), aging, and various cancers7,8,9. Furthermore, interactive pathways between gut microbiota and hosts involve inflammatory factors, neurotransmitters, metabolites, intestinal barrier, and oxidative stress, as observed in previous research using mice and fish models10,11.
Recently, multiple bacteria-related approaches or therapies, including potential probiotics and fecal microbiota transplantation (FMT), have been explored for these disorders in clinical and animal models. These explorations are based on discoveries related to the microbiota-gut-brain/liver/kidney axis, microbiota-derived products, and altered receptor activity12,13. However, the development, various functions, and mechanisms of the microbiota-host system are still incompletely understood and identified due to the complexity of the microbial community and the challenge of generating powerful human-like disease models.
To address these issues, germ-free (GF) animal models were urgently proposed in the mid-19th century and primarily developed during the 20th century. Subsequent refinements, including antibiotic-treated and gnotobiotic models, along with advancements in microbial detection and observation technologies, further perfected these models14,15,16. GF animals, created by erasing their own background and avoiding environmental microbes, offer an excellent strategy for exploring the interactions between microorganisms and their hosts17. Through the application of animal models and refined protocols, researchers have successfully replicated similar microbial compositions found in patients in GF mice and fish. Additionally, other GF animal models, such as dogs, chickens, and pigs, provide diverse options as research subjects18,19,20,21. This approach has enabled investigations into the potential therapeutic effects of commensal microbiomes on various diseases, including cancer immunotherapy in humans16,18. GF models offer more accurate insights into the characteristics and mechanisms of specific bacterial colonization, migration, multiplication, and interaction within hosts. This provides crucial novel insights into the occurrence and development of microbiota-related diseases22,23. The history of establishing and applying GF zebrafish in microbial research has evolved from the reports of Rawls et al. in 2004 and Bates et al. in 2006 to Melancon et al.&#39;s protocol in 201716,24,25. However, the feasibility of adult or breeding GF models is still a prolonged process, accompanied by variable longevity, success rates, and health challenges.
Among various animal models, zebrafish (Danio rerio) stands out as a critical tool for both basic and biomedical research due to its advantageous similarity to human organs and genomics, short developmental cycle, high fecundity, and transparent embryos19,26. Zebrafish, serving as reliable human disease models, offer a visual representation of physiological and pathological processes in vivo, providing insights into the attractive features of host-microbe interactions. Notably, zebrafish exhibit distinct cell lineages, allowing imaging of intestinal physiology, microbial dynamics, gonads and reproductive development, maturation of the host immune system, behavior, and metabolism27. Zebrafish embryos develop within protective chorions until hatching, becoming larvae at 3 days post-fertilization (dpf). They actively hunt for food at 5 dpf and reach sexual maturity around 3 months post-fertilization (mpf)28. The first successful germ-free (GF) zebrafish, reported by Rawls et al.24, showed that larvae fed with autoclaved feed after yolk absorption exhibited tissue necrosis from 8 dpf and total death at 20 dpf. This indicated the effects of diet or the importance of considering exogenous nutrient supply in experiments involving long-term (&#62;7 dpf) GF fish29. Subsequent studies improved the generation protocol of GF fish, employing sterile food and methods perfected in different fish models16.
However, most research on GF zebrafish models has focused on early life stages, involving bacterial infection at 5 dpf for 24 h to 48 h, with samples collected before 7 dpf at the conclusion of the experiments25,30,31. It&#39;s widely acknowledged that the microbiota in organisms, including humans and zebrafish, is colonized at the beginning of life and shaped during growth and development. The composition remains stable at adult stages, with the roles of microbiota in the host being crucial throughout life, especially in aging, neurodegenerative, metabolic-related obesity, and intestinal disease aspects3. Thus, perspectives from GF animals with longer survival can provide insights into the mechanisms of microbial roles in host organ development and functions, considering the immature immune and reproductive systems of fish larvae in early life. While bacterial strains in zebrafish intestines have been isolated and identified in previous studies, offering the potential for infecting GF animal models to select probiotics or research bacterial functions in the host19,25, the generation and application of GF fish models have primarily been restricted to early life stages. This limitation, attributed to the complex production process, high maintenance costs, and associated issues with food and immunity, hinders research efforts aimed at investigating the developmental and chronic effects of microbiota in the host.
The survival rate, behavior, growth, maturation, and overall health of fish, especially in germ-free (GF) models, are significantly influenced by feeding practices, encompassing nutrition intake and absorption during the mouth-open period from early larvae to juveniles32,33. However, one of the challenges in GF fish husbandry is the scarcity of suitable sterile diets, limiting the effectiveness of nutritional support for sustaining the growth and survival of larvae. Resolving this issue is crucial to restoring the life of GF fish, considering their developmental defense mechanisms and weak digestion abilities due to the absence of an intestinal microbiome. In terms of food, live brine shrimp (Artemia sp.) emerges as the most suitable diet for mouth-open larvae to juvenile fish. It has been observed that fish fed with live brine shrimp exhibit higher growth and survival rates compared to those fed with cooked egg yolk or other natural and synthetic baits34. While early life models of GF fish can survive with yolk support and GF larvae models can be maintained with sterile feeding, generating long-term models from larvae to juveniles and reaching sexual maturity remains challenging. Additionally, flake or powder food is limited by unequal nutritional composition and can impact water quality. In contrast, live Artemia has advantages such as survival in both salt and freshwater, small size suitable for larvae to adults, ease of batching, and higher hatching quality35. Building upon previous methods16,24,30, we have simplified the complex treatment process and addressed the diet challenge by establishing easily incubated GF live Artemia sp. as sterile food for longer durations than early-life GF fish.
This study presents an optimized protocol covering (1) generation, (2) maintenance, (3) identification of sterile rate, and (4) maintenance and feeding to ensure the growth of germ-free (GF) zebrafish from embryos to larvae and juvenile stages. The results offer preliminary evidence on the hatching, survival, growth, and sterility of GF zebrafish, along with essential indices for GF Artemia sp. as sterile food. The detailed steps in model generation and preparation of sterile live foods provide crucial technical support for constructing and applying long-term GF fish models, as well as GF Artemia sp. in microbiota-host interaction research. The protocol addresses bacterial isolation, identification, and infection on GF fish models, outlining methods for bacterial fluorescence labeling and observing their colonization in fish intestines under a microscope. GF fish, gnotobiotic fish with bacterial infection, or transferred human microbiota models will undergo various detections to elucidate their functions and effects on host immunity, digestion, behavior, transcriptomic regulation, and metabolic aspects. In the long term, this protocol can be extended to different wild-type fish species, such as marine medaka, and potentially to other selected transgenic zebrafish lines correlated to specific tissues or diseases.

Författare i fokus: Etablering av bakteriefria zebrafiskar för studier av förhållandet mellan mikrobiota och värd

Generering, underhåll och identifiering av bakteriefria zebrafiskmodeller från larver till juvenila stadier

The scope of this research is generation of novel, germ-free animal models, which will be helpful and powerful tools in investigation of various microbiome functions. In this field, the early germ-free fish models have been used recently, but the long-term models are still limited due to various culture conditions and the staff developmental defense. The current GF fish models are normally early life ones.Thus, the technologies including the sterile scale, the sample detection methods, and providing sterile food are very important challenges to overcome. The germ-free zebrafish model is crucial for studying host-microbiota interaction and their impacts on development and the immunity and disease. This model allows researchers to precisely manipulate the single gut bacteria and observe its effect on the transparent zebrafish embryos.It provides valuable insights into the roles of gut microbes inheriting the disease. In the future, our research will mainly focused on establishing a germ-free zebrafish model for entire life cycle to better understanding the function of the gut microbiome.

GF-zebrafiskmodellerna kan produceras effektivt genom att använda de rikliga ägg som leks av par av zebrafiskar, med protokollet optimerat baserat på tidigare GF-fiskmodeller35. En enda platta med 6 brunnar kan odla cirka 30-48 embryon/larver, vilket möjliggör omfattande datainsamling och statistisk analys. Efter steril behandling odlas GF-embryona i en ren inkubator tills de kläcks till larver vid 48-72 timmar, och ändrar GZM dagligen med detektion av insamlade prover, vilket är avgörand...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Establishing Germ-Free Zebrafish for Microbiota-Host Relationship Studies at JoVE.com

Detta protokoll beskriver de primära stegen för att erhålla bakteriefria (GF) fiskembryon och bevara dem från larver till juvenilstadiet, inklusive provtagning och detektion av deras sterila status. Användningen av GF-modeller med infektion är viktig för att förstå mikrobernas roll i värdens hälsa.

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Omfattningen av denna forskning är generering av nya, bakteriefria djurmodeller, som kommer att vara användbara och kraftfulla verktyg vid undersökning av olika mikrobiomfunktioner. Inom detta område har de tidiga bakteriefria fiskmodellerna använts på senare tid, men de långsiktiga modellerna är fortfarande begränsade på grund av olika odlingsförhållanden och personalens utvecklingsförsvar. De nuvarande GF-fiskmodellerna är normalt tidiga fiskar.Således är teknikerna inklusive den sterila vågen, provdetektionsmetoderna och tillhandahållandet av steril mat mycket viktiga utmaningar att övervinna. Den bakteriefria zebrafiskmodellen är avgörande för att studera interaktion mellan värd och mikrobiota och deras inverkan på utveckling och immunitet och sjukdom. Denna modell gör det möjligt för forskare att exakt manipulera de enskilda tarmbakterierna och observera dess effekt på de genomskinliga zebrafiskembryona.Den ger värdefulla insikter om tarmmikrobernas roll när de ärver sjukdomen. I framtiden kommer vår forskning främst att fokusera på att etablera en bakteriefri zebrafiskmodell för hela livscykeln för att bättre förstå tarmmikrobiomets funktion.

generation-maintenance-identification-germ-free-zebrafish-models-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

Generation of Germ-Free Zebrafish Models from Embryos

Generering av bakteriefria zebrafiskmodeller från embryon

GF Artemia nauplii Preparation for Chronic GF Zebrafish Nutrition

To begin, obtain 0.25 grams of Artemia cysts and rinse them with 2.4 grams per liter sodium hypochlorite for five minutes. Filter the rinsed cysts with a sterilized ultra dense filter and wash with sterilized ultrapure water for one to two minutes. After three washes, transfer them to 100 milliliters of 2.5%sterile saline and mix well.Pack 50 milliliters of treated Artemia cyst mix into a sterile 100-milliliter bottle. Using a film, seal the bottle thoroughly and place it in a shaking incubator with light. Next, using a Pasteur pipette, extract 30 milliliters of hatching Artemia nauplii from the middle and lower layers.After filtering, wash the Artemia three times with sterile ultrapure water for about one minute, and add four milliliters of sterile ultrapure water. Finally, using a disposable Pasteur pipette, retrieve actively swimming Artemia from the upper layer, wash, and prepare the solution for feeding. Microscopic observation confirmed efficient hatching of Artemia cysts after the treatment.