Name: Yazar Spotlight: Mikrobiyota-Konak İlişkisi Çalışmaları için Mikropsuz Zebra Balığı Oluşturma
Uploaded: 2024-04-12T13:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Establishing Germ-Free Zebrafish for Microbiota-Host Relationship Studies at JoVE.com

Chongqing Tıp Üniversitesi Yetenek Projesi (No. R4014'ten DSP'ye ve R4020'den PPJ'ye), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (NSFC, No.32200386'dan PPJ'ye), Chongqing Doktora Sonrası İnovasyon Mentor Stüdyosu'ndan (X7928 DSP) ve Çin Bilimler Akademisi (CAS) / Çin-Sri Lanka Ortak CAS Eğitim ve Araştırma Merkezi tarafından Çin-Sri Lanka Ortak Su Teknolojisi Araştırma ve Gösteri Merkezi Programı.

Balık deneyleri, Chongqing Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Çin'deki Chongqing Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerinin yanı sıra Devlet Kalite ve Teknik Denetim Bürosu tarafından yayınlanan deney hayvanları standartlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir (Onay Kimliği: GB14922-2001 - GBT14927-2001). Zebra balığı (Danio rerio, yabani tip, AB suşu) Çin Bilimler Akademisi Hidrobiyoloji Enstitüsü'nden temin edildi ve daha önce bildirilen...

GF Zebra Balığı Modellerinin Optimize Edilmesi: Üretim, Bakım ve Mikrobiyal Çalışmalar

GF balık ve GF yem hazırlama protokolleri dahilindeki kritik adımlar GF balık modellerinin oluşturulması sırasında, steril materyallerin hazırlanması, embriyoların sterilizasyonu, GZM'nin günlük olarak yenilenmesi, çeşitli numunelerin toplanması ve her numunenin birden fazla yöntem kullanılarak steril olarak incelenmesi dahil olmak üzere birkaç kritik adım dahil edildi. Bu adımlar arasında, embriyoların ilk tedavisi, GF modellerinin başarısı için temel ve belirleyicidir. Ko...

Mikrobiyota (yani Arkeler, Bakteriler, Ökarya ve virüsler), bireylerde bağırsak bariyeri, epitel yüzeyi ve müsin fonksiyonları içindeki simbiyotik etkileşimler yoluyla fizyolojik ve patolojik süreçleri etkileyerek konak sağlığının korunmasında ve çeşitli hastalıkların gelişimine katkıda bulunmada çok önemli roller oynar 1,2,3. Mikrobiyotanın bebeklikten gençliğe, yetişkinliğe ve yaşlanmaya kadar farklı yaşam evrelerindeki bileşimi ve ayrıca burun, ağız, cilt ve bağırsak bölgeleri gibi çeşitli yerlerdeki varlığı, çeşitli habitatlar ve ortamlar tarafından dinamik olarak şekillendirilir4. Organizmalardaki bağırsak mikrobiyotası, besin emilimi, bağışıklık tepkisi, patojen istilası, metabolik düzenleme vb.ile ilgilidir 5,6. Hastalar üzerinde yapılan çalışmalar, bağırsak mikrobiyotasındaki bozulmaların insan obezitesi, uyku bozuklukları, depresyon, inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD), nörodejeneratif hastalıklar (Parkinson, Alzheimer), yaşlanma ve çeşitli kanserlerle ilişkili olduğunu göstermiştir 7,8,9. Ayrıca, bağırsak mikrobiyotası ve konakçılar arasındaki etkileşimli yollar, fareler ve balık modelleri kullanılarak yapılan önceki araştırmalarda gözlemlendiği gibi, inflamatuar faktörleri, nörotransmiterleri, metabolitleri, bağırsak bariyerini ve oksidatif stresi içerir10,11.
Son zamanlarda, potansiyel probiyotikler ve fekal mikrobiyota transplantasyonu (FMT) dahil olmak üzere çoklu bakteri ile ilgili yaklaşımlar veya tedaviler, klinik ve hayvan modellerinde bu bozukluklar için araştırılmıştır. Bu keşifler, mikrobiyota-bağırsak-beyin/karaciğer/böbrek ekseni, mikrobiyota türevi ürünler ve değiştirilmiş reseptör aktivitesi12,13 ile ilgili keşiflere dayanmaktadır. Bununla birlikte, mikrobiyota konak sisteminin gelişimi, çeşitli işlevleri ve mekanizmaları, mikrobiyal topluluğun karmaşıklığı ve güçlü insan benzeri hastalık modelleri üretmenin zorluğu nedeniyle hala tam olarak anlaşılmamış ve tanımlanmamıştır.
Bu sorunları ele almak için, mikropsuz (GF) hayvan modelleri 19. yüzyılın ortalarında acilen önerildi ve öncelikle 20. yüzyılda geliştirildi. Mikrobiyal tespit ve gözlem teknolojilerindeki gelişmelerin yanı sıra antibiyotikle tedavi edilmiş ve gnotobiyotik modeller de dahil olmak üzere müteakip iyileştirmeler, bu modelleri daha da mükemmelleştirdi 14,15,16. Kendi geçmişlerini silerek ve çevresel mikroplardan kaçınarak yaratılan GF hayvanları, mikroorganizmalar ve konakçıları arasındaki etkileşimleri keşfetmek için mükemmel bir strateji sunar17. Hayvan modellerinin ve rafine protokollerin uygulanmasıyla, araştırmacılar GF farelerinde ve balıklarda hastalarda bulunan benzer mikrobiyal bileşimleri başarıyla kopyaladılar. Ek olarak, köpekler, tavuklar ve domuzlar gibi diğer GF hayvan modelleri, araştırma konuları olarak çeşitli seçenekler sunar 18,19,20,21. Bu yaklaşım, kommensal mikrobiyomların insanlarda kanser immünoterapisi de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar üzerindeki potansiyel terapötik etkilerinin araştırılmasını sağlamıştır 16,18. GF modelleri, konakçılar içindeki spesifik bakteri kolonizasyonu, göçü, çoğalması ve etkileşiminin özellikleri ve mekanizmaları hakkında daha doğru bilgiler sunar. Bu, mikrobiyota ile ilgili hastalıkların ortaya çıkışı ve gelişimi hakkında çok önemli yeni bilgiler sağlar22,23. Mikrobiyal araştırmalarda GF zebra balığının kurulması ve uygulanmasının tarihi, 2004'te Rawls ve ark. ve 2006'da Bates ve ark.'nın raporlarından 2017'deMelancon ve ark.'nın protokolüne kadar gelişmiştir 16,24,25. Bununla birlikte, yetişkin veya üreyen GF modellerinin fizibilitesi, değişken uzun ömür, başarı oranları ve sağlık sorunlarının eşlik ettiği uzun bir süreçtir.
Çeşitli hayvan modelleri arasında zebra balığı (Danio rerio), insan organlarına ve genomiklere avantajlı benzerliği, kısa gelişim döngüsü, yüksek doğurganlığı ve şeffaf embriyoları nedeniyle hem temel hem de biyomedikal araştırmalar için kritik bir araç olarak öne çıkmaktadır19,26. Güvenilir insan hastalığı modelleri olarak hizmet veren zebra balığı, in vivo fizyolojik ve patolojik süreçlerin görsel bir temsilini sunarak, konakçı-mikrop etkileşimlerinin çekici özellikleri hakkında fikir verir. Özellikle, zebra balığı, bağırsak fizyolojisi, mikrobiyal dinamikler, gonadlar ve üreme gelişimi, konakçı bağışıklık sisteminin olgunlaşması, davranış ve metabolizmanın görüntülenmesine izin veren farklı hücre soyları sergiler27. Zebra balığı embriyoları, yumurtadan çıkana kadar koruyucu koryonlar içinde gelişir ve döllenmeden 3 gün sonra (dpf) larva haline gelir. Aktif olarak 5 dpf'de yiyecek avlarlar ve döllenmeden yaklaşık 3 ay sonra (mpf) cinsel olgunluğa ulaşırlar28. Rawls ve ark.24 tarafından bildirilen ilk başarılı mikropsuz (GF) zebra balığı, yumurta sarısı emiliminden sonra otoklavlanmış yemle beslenen larvaların 8 dpf'den doku nekrozu ve 20 dpf'de toplam ölüm sergilediğini gösterdi. Bu, diyetin etkilerini veya uzun süreli (>7 dpf) GF balıklarını içeren deneylerde dışsal besin tedarikini dikkate almanın önemini gösterdi29. Daha sonraki çalışmalar, steril gıda ve farklı balık modellerinde mükemmelleştirilen yöntemler kullanarak GF balıklarının üretim protokolünü geliştirdi16.
Bununla birlikte, GF zebra balığı modelleri üzerine yapılan araştırmaların çoğu, deneylerin sonunda 24 ila 48 saat boyunca 5 dpf'de bakteriyel enfeksiyonu içeren erken yaşam evrelerine odaklanmıştırve deneylerin sonunda 7 dpf'den önce toplanan örnekler 25,30,31. İnsanlar ve zebra balıkları da dahil olmak üzere organizmalardaki mikrobiyotanın yaşamın başlangıcında kolonize olduğu ve büyüme ve gelişme sırasında şekillendiği yaygın olarak kabul edilmektedir. Bileşim yetişkin aşamalarında stabil kalır, konakçıdaki mikrobiyotanın rolleri, özellikle yaşlanma, nörodejeneratif, metabolik ilişkili obezite ve bağırsak hastalığı yönlerinde yaşam boyunca çok önemlidir3. Bu nedenle, daha uzun sağkalıma sahip GF hayvanlarından elde edilen bakış açıları, balık larvalarının erken yaşamdaki olgunlaşmamış bağışıklık ve üreme sistemlerini göz önünde bulundurarak, konakçı organ gelişimi ve işlevlerindeki mikrobiyal rollerin mekanizmaları hakkında fikir verebilir. Zebra balığı bağırsaklarındaki bakteri suşları önceki çalışmalarda izole edilmiş ve tanımlanmış olsa da, GF hayvan modellerini probiyotikleri seçmek veya konakçıdaki bakteri fonksiyonlarını araştırmak için enfekte etme potansiyeli sunarken19,25, GF balık modellerinin üretimi ve uygulanması öncelikle erken yaşam evreleriyle sınırlandırılmıştır. Karmaşık üretim sürecine, yüksek bakım maliyetlerine ve gıda ve bağışıklıkla ilgili sorunlara atfedilen bu sınırlama, konakçıdaki mikrobiyotanın gelişimsel ve kronik etkilerini araştırmayı amaçlayan araştırma çabalarını engellemektedir.
Balıkların hayatta kalma oranı, davranışı, büyümesi, olgunlaşması ve genel sağlığı, özellikle mikropsuz (GF) modellerde, erken larvalardan yavrulara kadar ağız açık döneminde besin alımını ve emilimini kapsayan beslenme uygulamalarından önemli ölçüde etkilenir32,33. Bununla birlikte, GF balık yetiştiriciliğindeki zorluklardan biri, larvaların büyümesini ve hayatta kalmasını sürdürmek için beslenme desteğinin etkinliğini sınırlayan uygun steril diyetlerin kıtlığıdır. Bu sorunu çözmek, gelişimsel savunma mekanizmaları ve bağırsak mikrobiyomunun olmaması nedeniyle zayıf sindirim yetenekleri göz önüne alındığında, GF balıklarının yaşamını eski haline getirmek için çok önemlidir. Gıda açısından canlı salamura karides (Artemia sp.) ağzı açık larvalar ve yavru balıklar için en uygun diyet olarak karşımıza çıkmaktadır. Canlı salamura karides ile beslenen balıkların, pişmiş yumurta sarısı veya diğer doğal ve sentetik yemlerle beslenenlere göre daha yüksek büyüme ve hayatta kalma oranları sergilediği görülmüştür34. GF balıklarının erken yaşam modelleri yumurta sarısı desteği ile hayatta kalabilirken ve GF larva modelleri steril besleme ile korunabilirken, larvalardan yavrulara kadar uzun vadeli modeller oluşturmak ve cinsel olgunluğa ulaşmak zor olmaya devam etmektedir. Ek olarak, pul veya toz gıdalar eşit olmayan besin bileşimi ile sınırlıdır ve su kalitesini etkileyebilir. Buna karşılık, canlı Artemia'nın hem tuzlu hem de tatlı suda hayatta kalması, larvalar için yetişkinlere uygun küçük boyut, harmanlama kolaylığı ve daha yüksek kuluçka kalitesi gibi avantajları vardır35. Önceki yöntemlere (16,24,30) dayanarak, karmaşık tedavi sürecini basitleştirdik ve erken yaştaki GF balıklarından daha uzun süre steril bir yem olarak kolayca kuluçkaya yatırılan GF live Artemia sp. oluşturarak diyet zorluğunu ele aldık.
Bu çalışma, mikropsuz (GF) zebra balıklarının embriyolardan larvalara ve gençlik aşamalarına kadar büyümesini sağlamak için (1) nesil, (2) bakım, (3) steril oranın belirlenmesi ve (4) bakım ve beslemeyi kapsayan optimize edilmiş bir protokol sunmaktadır. Sonuçlar, GF zebra balığının yumurtadan çıkması, hayatta kalması, büyümesi ve kısırlığı hakkında ön kanıtların yanı sıra GF Artemia sp. steril gıda olarak. Model oluşturma ve steril canlı mamaların hazırlanmasındaki ayrıntılı adımlar, mikrobiyota-konak etkileşimi araştırmalarında GF Artemia sp.'nin yanı sıra uzun vadeli GF balık modellerinin oluşturulması ve uygulanması için çok önemli teknik destek sağlar. Protokol, GF balık modellerinde bakteriyel izolasyon, tanımlama ve enfeksiyonu ele alarak, bakteriyel floresan etiketleme yöntemlerini ana hatlarıyla belirtir ve mikroskop altında balık bağırsaklarında kolonizasyonlarını gözlemler. GF balıkları, bakteriyel enfeksiyonu olan gnotobiyotik balıklar veya transfer edilen insan mikrobiyota modelleri, işlevlerini ve konakçı bağışıklığı, sindirim, davranış, transkriptomik düzenleme ve metabolik yönler üzerindeki etkilerini aydınlatmak için çeşitli tespitlere tabi tutulacaktır. Uzun vadede, bu protokol deniz medaka gibi farklı vahşi tip balık türlerine ve potansiyel olarak belirli dokular veya hastalıklarla ilişkili diğer seçilmiş transgenik zebra balığı hatlarına genişletilebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AB-GZM</td>
			<td>Amphotericin:Solarbio;&#160; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.</td>
			<td>Amphotericin:CAS:1397-89-3; 
			kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.</td>
			<td>49.6 mL GZM, 50 &#181;L amphotericin stock solution (250 &#181;g/mL), 25 &#181;L kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 &#181;L ampicillin stock solution (20 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-15-M</td>
			<td>To collect samples, and hold agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates, 24-, 48- well plates</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>11112</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aeronomas</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178499</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic work station</td>
			<td>GENE SCIENCE</td>
			<td>E200G</td>
			<td>Bacterial isolation, sterile testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis</td>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>v6.07</td>
			<td>To analysis the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API 20 E kits</td>
			<td>&#160;BioMerieux SA, France</td>
			<td>No.1005915090</td>
			<td>Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia (Brine shrimp)</td>
			<td>Shangjia Aquarium Co., Ltd.</td>
			<td>Aquamaster brand</td>
			<td>Artemia cysts, and brine shrimp eggs&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto cycle system for fish culture</td>
			<td>Ningbo Hairui Technology Co., Ltd</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Maintain the fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Zeal Way</td>
			<td>G154DWS</td>
			<td>Prepare the materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Aerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Anaerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>LongYue Co., Ltd</td>
			<td>SPX</td>
			<td>For fish and plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Haier</td>
			<td>HR40-IIA2</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood plates</td>
			<td>sheep blood:Solarbio</td>
			<td>Cat. NO. TX0030</td>
			<td>Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-Dil dyes</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Cat#C7000&#160;&#160;</td>
			<td>To label the bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature shaking incubator</td>
			<td>Peiving Co., Ltd</td>
			<td>HZQ-X100</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>Bacteria and Archaea database</td>
			<td>Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ 
			Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pasteur pipette</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>bs-xh-03l</td>
			<td>Used to change water, and transfer eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dish</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-90-D</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA kits</td>
			<td>Solaribio</td>
			<td>Cat#D1600</td>
			<td>Bacterial genomic DNA extraction kits&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric pipette</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>Levo me</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exiguobacterium</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178504</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZM</td>
			<td>Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd.</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory pure water system</td>
			<td>Hitech Co., Ltd</td>
			<td>Prima-S15</td>
			<td>Prepare the agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td>With fluorescent light to observe fish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR kits</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>Cat#ET101</td>
			<td>Taq DNA Polymerase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>sp-013-10</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine (PVP-I)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>Lot#H1217005</td>
			<td>Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timing converter</td>
			<td>PinYi Co., Ltd</td>
			<td>AL-06</td>
			<td>To regulate the light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Aerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Anaerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clean workbench</td>
			<td>Airtech</td>
			<td>SW-CJ-2FD</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure flow system for fish culture</td>
			<td>Marine Biological Equipment company</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Produce water for fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178501</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, maintenance, and identification of germ-free zebrafish models from larvae to juvenile stages

Zebra balıkları, memelilerle genomik benzerlikleri, nispeten temiz bir koryon ortamında gelişen şeffaf embriyoları ve kemirgen modellerine kıyasla son derece hızlı larva gelişimi nedeniyle büyüme, bağışıklık ve bağırsak mikrobiyotası araştırmaları için değerli modeller olarak hizmet eder. Mikropsuz (GF) zebra balığı (Danio rerio), kirletici toksisitesini değerlendirmek ve mikrobiyal işlevlerle ilgili insan benzeri hastalık modelleri oluşturmak için çok önemlidir. Geleneksel olarak yetiştirilen (CR) modellerle (ortak hayvancılıkta balıklar) karşılaştırıldığında, GF zebra balığı, konakçı mikrobiyotasının daha doğru bir şekilde manipüle edilmesine izin vererek mikroorganizmalar ve konakçılar arasındaki nedensel ilişkinin belirlenmesine yardımcı olur. Sonuç olarak, bu ilişkiler hakkındaki anlayışımızı ilerletmede kritik bir rol oynarlar. Bununla birlikte, GF zebra balığı modelleri, bağışıklık fonksiyonu ve besin emilimindeki sınırlamalar nedeniyle tipik olarak erken yaşam evrelerinde (embriyolardan larvalara kadar) üretilir ve araştırılır. Bu çalışma, erken GF zebra balığı modellerinin beslenmeden ve GF yemi ( Artemia sp., salamura karides gibi) kullanılarak uzun süreli beslenmeyle üretilmesini, bakımını ve tanımlanmasını optimize eder. Süreç boyunca, günlük örnekleme ve kültür gerçekleştirildi ve plakalar ve 16S rRNA dizilimi dahil olmak üzere çoklu tespitler yoluyla tanımlandı. GF zebra balığının aseptik hızı, hayatta kalma ve gelişim indeksleri, oluşturulan modellerin kalitesini ve miktarını sağlamak için kaydedildi. Daha da önemlisi, bu çalışma, GF balıkları için bakteri izolasyonu ve enfeksiyon teknikleri hakkında ayrıntılar sağlayarak, GF gıda desteği ile larvalardan gençlik aşamalarına kadar GF balık modellerinin verimli bir şekilde oluşturulmasını sağlar. Bilim adamları, bu prosedürleri biyomedikal araştırmalarda uygulayarak, bağırsak bakteri fonksiyonları ve konak sağlığı arasındaki ilişkileri daha iyi anlayabilirler.

The microbiota (i.e., Archaea, Bacteria, Eukarya, and viruses) play crucial roles in maintaining host health and contributing to the development of various diseases by influencing physiological and pathological processes through symbiotic interactions within the intestinal barrier, epithelial surface, and mucin functions in individuals1,2,3. The composition of the microbiota across different life stages, from infancy to juvenility, adulthood, and aging, as well as its presence in various locations such as nares, oral, skin, and gut sites, is dynamically shaped by diverse habitats and environments4. The intestinal microbiota in organisms is involved in nutrient absorption, immune response, pathogen invasion, metabolic regulation, etc5,6. Studies on patients have demonstrated that disruptions in gut microbiota are related to human obesity, sleep disorders, depression, inflammatory bowel disease (IBD), neurodegenerative diseases (Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s), aging, and various cancers7,8,9. Furthermore, interactive pathways between gut microbiota and hosts involve inflammatory factors, neurotransmitters, metabolites, intestinal barrier, and oxidative stress, as observed in previous research using mice and fish models10,11.
Recently, multiple bacteria-related approaches or therapies, including potential probiotics and fecal microbiota transplantation (FMT), have been explored for these disorders in clinical and animal models. These explorations are based on discoveries related to the microbiota-gut-brain/liver/kidney axis, microbiota-derived products, and altered receptor activity12,13. However, the development, various functions, and mechanisms of the microbiota-host system are still incompletely understood and identified due to the complexity of the microbial community and the challenge of generating powerful human-like disease models.
To address these issues, germ-free (GF) animal models were urgently proposed in the mid-19th century and primarily developed during the 20th century. Subsequent refinements, including antibiotic-treated and gnotobiotic models, along with advancements in microbial detection and observation technologies, further perfected these models14,15,16. GF animals, created by erasing their own background and avoiding environmental microbes, offer an excellent strategy for exploring the interactions between microorganisms and their hosts17. Through the application of animal models and refined protocols, researchers have successfully replicated similar microbial compositions found in patients in GF mice and fish. Additionally, other GF animal models, such as dogs, chickens, and pigs, provide diverse options as research subjects18,19,20,21. This approach has enabled investigations into the potential therapeutic effects of commensal microbiomes on various diseases, including cancer immunotherapy in humans16,18. GF models offer more accurate insights into the characteristics and mechanisms of specific bacterial colonization, migration, multiplication, and interaction within hosts. This provides crucial novel insights into the occurrence and development of microbiota-related diseases22,23. The history of establishing and applying GF zebrafish in microbial research has evolved from the reports of Rawls et al. in 2004 and Bates et al. in 2006 to Melancon et al.&#39;s protocol in 201716,24,25. However, the feasibility of adult or breeding GF models is still a prolonged process, accompanied by variable longevity, success rates, and health challenges.
Among various animal models, zebrafish (Danio rerio) stands out as a critical tool for both basic and biomedical research due to its advantageous similarity to human organs and genomics, short developmental cycle, high fecundity, and transparent embryos19,26. Zebrafish, serving as reliable human disease models, offer a visual representation of physiological and pathological processes in vivo, providing insights into the attractive features of host-microbe interactions. Notably, zebrafish exhibit distinct cell lineages, allowing imaging of intestinal physiology, microbial dynamics, gonads and reproductive development, maturation of the host immune system, behavior, and metabolism27. Zebrafish embryos develop within protective chorions until hatching, becoming larvae at 3 days post-fertilization (dpf). They actively hunt for food at 5 dpf and reach sexual maturity around 3 months post-fertilization (mpf)28. The first successful germ-free (GF) zebrafish, reported by Rawls et al.24, showed that larvae fed with autoclaved feed after yolk absorption exhibited tissue necrosis from 8 dpf and total death at 20 dpf. This indicated the effects of diet or the importance of considering exogenous nutrient supply in experiments involving long-term (&#62;7 dpf) GF fish29. Subsequent studies improved the generation protocol of GF fish, employing sterile food and methods perfected in different fish models16.
However, most research on GF zebrafish models has focused on early life stages, involving bacterial infection at 5 dpf for 24 h to 48 h, with samples collected before 7 dpf at the conclusion of the experiments25,30,31. It&#39;s widely acknowledged that the microbiota in organisms, including humans and zebrafish, is colonized at the beginning of life and shaped during growth and development. The composition remains stable at adult stages, with the roles of microbiota in the host being crucial throughout life, especially in aging, neurodegenerative, metabolic-related obesity, and intestinal disease aspects3. Thus, perspectives from GF animals with longer survival can provide insights into the mechanisms of microbial roles in host organ development and functions, considering the immature immune and reproductive systems of fish larvae in early life. While bacterial strains in zebrafish intestines have been isolated and identified in previous studies, offering the potential for infecting GF animal models to select probiotics or research bacterial functions in the host19,25, the generation and application of GF fish models have primarily been restricted to early life stages. This limitation, attributed to the complex production process, high maintenance costs, and associated issues with food and immunity, hinders research efforts aimed at investigating the developmental and chronic effects of microbiota in the host.
The survival rate, behavior, growth, maturation, and overall health of fish, especially in germ-free (GF) models, are significantly influenced by feeding practices, encompassing nutrition intake and absorption during the mouth-open period from early larvae to juveniles32,33. However, one of the challenges in GF fish husbandry is the scarcity of suitable sterile diets, limiting the effectiveness of nutritional support for sustaining the growth and survival of larvae. Resolving this issue is crucial to restoring the life of GF fish, considering their developmental defense mechanisms and weak digestion abilities due to the absence of an intestinal microbiome. In terms of food, live brine shrimp (Artemia sp.) emerges as the most suitable diet for mouth-open larvae to juvenile fish. It has been observed that fish fed with live brine shrimp exhibit higher growth and survival rates compared to those fed with cooked egg yolk or other natural and synthetic baits34. While early life models of GF fish can survive with yolk support and GF larvae models can be maintained with sterile feeding, generating long-term models from larvae to juveniles and reaching sexual maturity remains challenging. Additionally, flake or powder food is limited by unequal nutritional composition and can impact water quality. In contrast, live Artemia has advantages such as survival in both salt and freshwater, small size suitable for larvae to adults, ease of batching, and higher hatching quality35. Building upon previous methods16,24,30, we have simplified the complex treatment process and addressed the diet challenge by establishing easily incubated GF live Artemia sp. as sterile food for longer durations than early-life GF fish.
This study presents an optimized protocol covering (1) generation, (2) maintenance, (3) identification of sterile rate, and (4) maintenance and feeding to ensure the growth of germ-free (GF) zebrafish from embryos to larvae and juvenile stages. The results offer preliminary evidence on the hatching, survival, growth, and sterility of GF zebrafish, along with essential indices for GF Artemia sp. as sterile food. The detailed steps in model generation and preparation of sterile live foods provide crucial technical support for constructing and applying long-term GF fish models, as well as GF Artemia sp. in microbiota-host interaction research. The protocol addresses bacterial isolation, identification, and infection on GF fish models, outlining methods for bacterial fluorescence labeling and observing their colonization in fish intestines under a microscope. GF fish, gnotobiotic fish with bacterial infection, or transferred human microbiota models will undergo various detections to elucidate their functions and effects on host immunity, digestion, behavior, transcriptomic regulation, and metabolic aspects. In the long term, this protocol can be extended to different wild-type fish species, such as marine medaka, and potentially to other selected transgenic zebrafish lines correlated to specific tissues or diseases.

Yazar Spotlight: Mikrobiyota-Konak İlişkisi Çalışmaları için Mikropsuz Zebra Balığı Oluşturma

Larvalardan Gençlik Dönemlerine Kadar Mikropsuz Zebra Balığı Modellerinin Üretimi, Bakımı ve Tanımlanması

The scope of this research is generation of novel, germ-free animal models, which will be helpful and powerful tools in investigation of various microbiome functions. In this field, the early germ-free fish models have been used recently, but the long-term models are still limited due to various culture conditions and the staff developmental defense. The current GF fish models are normally early life ones.Thus, the technologies including the sterile scale, the sample detection methods, and providing sterile food are very important challenges to overcome. The germ-free zebrafish model is crucial for studying host-microbiota interaction and their impacts on development and the immunity and disease. This model allows researchers to precisely manipulate the single gut bacteria and observe its effect on the transparent zebrafish embryos.It provides valuable insights into the roles of gut microbes inheriting the disease. In the future, our research will mainly focused on establishing a germ-free zebrafish model for entire life cycle to better understanding the function of the gut microbiome.

GF zebra balığı modelleri, zebra balığı çiftlerinin yumurtladığı bol yumurtalar kullanılarak verimli bir şekilde üretilebilir ve protokol önceki GF balık modellerine göre optimize edilmiştir35. Tek bir 6 oyuklu plaka, yaklaşık 30-48 embriyo / larvayı kültürleyebilir ve bu da bol miktarda veri toplama ve istatistiksel analize izin verir. Steril tedaviden sonra, GF embriyoları 48-72 saatte larvalara yumurtadan çıkana kadar temiz bir inkübatörde kültürlenir ve toplanan ö...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Establishing Germ-Free Zebrafish for Microbiota-Host Relationship Studies at JoVE.com

Bu protokol, mikropsuz (GF) balık embriyoları elde etmek ve bunları larvalardan gençlik aşamasına kadar korumak için, örnekleme ve steril durumlarını tespit etme dahil olmak üzere birincil adımları özetlemektedir. Enfeksiyonlu GF modellerinin kullanılması, mikropların konak sağlığındaki rolünü anlamak için önemlidir.

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Bu araştırmanın kapsamı, çeşitli mikrobiyom fonksiyonlarının araştırılmasında yardımcı ve güçlü araçlar olacak yeni, mikropsuz hayvan modellerinin oluşturulmasıdır. Bu alanda, erken dönem mikropsuz balık modelleri son zamanlarda kullanılmaya başlanmıştır, ancak çeşitli kültür koşulları ve personelin gelişimsel savunması nedeniyle uzun vadeli modeller hala sınırlıdır. Mevcut GF balık modelleri normalde erken yaşam modelleridir.Bu nedenle, steril ölçek, numune tespit yöntemleri ve steril gıda sağlama gibi teknolojilerin üstesinden gelinmesi gereken çok önemli zorluklar vardır. Mikropsuz zebra balığı modeli, konakçı-mikrobiyota etkileşimini ve bunların gelişim, bağışıklık ve hastalık üzerindeki etkilerini incelemek için çok önemlidir. Bu model, araştırmacıların tek bağırsak bakterilerini hassas bir şekilde manipüle etmelerine ve şeffaf zebra balığı embriyoları üzerindeki etkisini gözlemlemelerine olanak tanır.Hastalığı miras alan bağırsak mikroplarının rolleri hakkında değerli bilgiler sağlar. Gelecekte, araştırmamız esas olarak bağırsak mikrobiyomunun işlevini daha iyi anlamak için tüm yaşam döngüsü için mikropsuz bir zebra balığı modeli oluşturmaya odaklanacaktır.

generation-maintenance-identification-germ-free-zebrafish-models-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

Gelişim Biyolojisi

Generation of Germ-Free Zebrafish Models from Embryos

Embriyolardan Mikropsuz Zebra Balığı Modellerinin Üretilmesi

GF Artemia nauplii Preparation for Chronic GF Zebrafish Nutrition

To begin, obtain 0.25 grams of Artemia cysts and rinse them with 2.4 grams per liter sodium hypochlorite for five minutes. Filter the rinsed cysts with a sterilized ultra dense filter and wash with sterilized ultrapure water for one to two minutes. After three washes, transfer them to 100 milliliters of 2.5%sterile saline and mix well.Pack 50 milliliters of treated Artemia cyst mix into a sterile 100-milliliter bottle. Using a film, seal the bottle thoroughly and place it in a shaking incubator with light. Next, using a Pasteur pipette, extract 30 milliliters of hatching Artemia nauplii from the middle and lower layers.After filtering, wash the Artemia three times with sterile ultrapure water for about one minute, and add four milliliters of sterile ultrapure water. Finally, using a disposable Pasteur pipette, retrieve actively swimming Artemia from the upper layer, wash, and prepare the solution for feeding. Microscopic observation confirmed efficient hatching of Artemia cysts after the treatment.