Name: تسليط الضوء على المؤلف: استكشاف بروتينات الصدمة الحرارية في عدوى الملاريا والسل
Uploaded: 2024-03-08T14:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Exploring Heat Shock Proteins in Malaria and Tuberculosis Infections at JoVE.com

تم دعم العمل بتمويل منحة تم الحصول عليها من رقم منحة المركز الدولي للهندسة الوراثية والتكنولوجيا الحيوية (ICGEB) ، HDI / CRP / 012 ، مديرية البحوث بجامعة فيندا ، المنحة I595 ، قسم العلوم والابتكار (DSI) والمؤسسة الوطنية للبحوث (NRF) في جنوب إفريقيا (أرقام المنح ، 75464 و 92598) الممنوحة ل AS.

1. التحول
ملاحظة: استخدم الأواني الزجاجية المعقمة للثقافة ، وأطراف الماصة ، والوسائط الطازجة والتعقيم المعقم. تحضير ثقافات خلايا الإشريكية القولونية في 2x خميرة التربتون (YT) [1.6٪ تريبتون (وزن / حجم) ، 1٪ مستخلص الخميرة (وزن / حجم) ، 0.5٪ كلوريد الصوديوم (وزن / حجم) ، 1.5٪ ?...

تقييم نشاط مرافق Hsp70 باستخدام خلايا الإشريكية القولونية dnaK756

<ol>
	<li>Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+newly+synthesized+proteins+into+shape.">Getting newly synthesized proteins into shape.</a> Cell. 101 (2), 119-122 (2000).</li><li>Shonhai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodial+heat+shock+proteins:+targets+for+chemotherapy.">Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy.</a> FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).</li><li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins:+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB.">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li><li>Edkins, A. L., Boshoff, A., Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+structural+and+functional+features+of+molecular+chaperones.+Heat+shock+proteins+of+malaria.">General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria.</a> Adv Exp Med Biol. , (2021).</li><li>Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+conformation+of+wild-type+E.+coli.+Hsp70+(DnaK)+chaperone+complexed+with+ADP+and+substrate.">Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate.</a> PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).</li><li>Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+heat+shock+protein+70+is+able+to+suppress+the+thermosensitivity+of+an+Escherichia+coli+DnaK+mutant+strain.">Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain.</a> Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).</li><li>Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+study+of+a+Plasmodium+falciparum+Hsp70+using+three-dimensional+modelling+and+in+vitro+analyses.">Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses.</a> Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).</li><li>Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -. R., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+modulation+of+plasmodial+Hsp70s+by+small+molecules+with+antimalarial+activity.">Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity.</a> Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).</li><li>Makhoba, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+chimeric+Hsp70+to+enhance+the+quality+of+recombinant+Plasmodium+falciparum+s-adenosylmethionine+decarboxylase+protein+produced+in+Escherichia+coli.">Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli.</a> PLoS One. 11 (3), 0152626 (2016).</li><li>Bukau, B., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+defects+caused+by+deletion+of+the+Escherichia+coli+dnaK+gene+indicate+roles+for+heat+shock+protein+in+normal+metabolism.">Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism.</a> J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).</li><li>Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaK+protein+alleviates+toxicity+induced+by+citrate-coated+gold+nanoparticles+in+Escherichia+coli.">DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli.</a> PLoS One. 10 (4), 0121243 (2015).</li><li>Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Escherichia+coli+heat+shock+proteins+DnaK+and+HtpG+(C62.+5)+in+response+to+nutritional+deprivation.">Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation.</a> J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).</li><li>Mayer, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistep+mechanism+of+substrate+binding+determines+chaperone+activity+of+Hsp70.">Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70.</a> Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).</li><li>Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+bacterial+gene+(groP+C)+which+affects+&#955;+DNA+replication.">A new bacterial gene (groP C) which affects &#955; DNA replication.</a> Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).</li><li>Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dnaK+protein+modulates+the+heat-shock+response+of+Escherichia+coli.">The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli.</a> Cell. 34 (2), 641-646 (1983).</li><li>Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+defects+of+the+DnaK756+mutant+chaperone+of+Escherichia+coli+indicate+distinct+roles+for+amino-and+carboxyl-terminal+residues+in+substrate+and+co-chaperone+interaction+and+interdomain+communication.">Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication.</a> J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).</li><li>Taj, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+as+a+model+organism.">Escherichia coli as a model organism.</a> Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).</li><li>Sato, S., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+cochaperonins+in+apicomplexan+parasites.">Organelle-specific cochaperonins in apicomplexan parasites.</a> Mol Biochem Parasitol. 141 (2), 133-143 (2005).</li><li>Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University Available from: <a target="_blank" href="https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University">https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University</a> (2007)</li><li>Makumire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+GGMP+repeat+segments+of+Plasmodium+falciparum+Hsp70-1+compromises+chaperone+function+and+Hop+co-chaperone+binding.">Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding.</a> Int J Mol Sci. 22 (4), 2226 (2021).</li><li>Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+Hsp70+family+proteins:+Expanding+the+chaperone+code.">Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code.</a> J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).</li><li>Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+functionality+of+non-native+Hsp70+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Bio Protoc. 9 (19), e3389 (2019).</li></ol>

يوضح البروتوكول فائدة خلايا E. coli dnaK756في استكشاف وظيفة chaperone ل Hsp70 المعبر عنه بشكل غير متجانس. يمكن اعتماد هذا الفحص لفحص مثبطات استهداف وظيفة Hsp70 في السليلو. ومع ذلك ، فإن أحد قيود هذه الطريقة هو أن Hsp70s غير قادر على استبدال DnaK في الإشريكية القولونية غير متوافق مع هذا الفحص. قد ي?...

تلعب بروتينات الصدمة الحرارية دورا مهما كمرافقين جزيئيين من خلال تسهيل طي البروتين ، ومنع تراكم البروتين ، وعكس اختلال البروتين 1,2. بروتين الصدمة الحرارية 70 (Hsp70) هو واحد من أبرز المرافقين الجزيئيين ، ويلعب دورا مركزيا في توازن البروتين 3,4. DnaK هو نظير E. coli Hsp705.
تم تطوير العديد من المقايسات الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية والخلوية لاستكشاف نشاط المرافق ل Hsp70 وفحص مثبطات تستهدف هذا المرافق6،7،8. Hsp70 هو بروتين محفوظ للغاية. لهذا السبب ، تم الإبلاغ عن العديد من Hsp70s من الكائنات حقيقية النواة ، مثل Plasmodium falciparum (العامل الرئيسي للملاريا) ، لتحل محل وظيفة DnaK في E. coli 6,9. وبهذه الطريقة ، تم تطوير مقايسة تكميلية قائمة على الإشريكية القولونية تتضمن التعبير غير المتجانس ل Hsp70s في الإشريكية القولونية لاستكشاف وظيفتها الواقية للخلايا. عادة ، يتضمن هذا الفحص استخدام خلايا الإشريكية القولونية التي تعاني من نقص في DnaK أو التي تعبر عن DnaK الأصلي الذي تم اختراقه وظيفيا. في حين أن DnaK ليس ضروريا لنمو الإشريكية القولونية في ظل الظروف العادية ، إلا أنه يصبح ضروريا عندما تنمو الخلايا في ظل ظروف مرهقة مثل درجات الحرارة المرتفعة أو أشكال أخرى من الإجهاد10,11.
تشمل سلالات الإشريكية القولونية التي تم تطويرها لدراسة وظيفة Hsp70 باستخدام مقايسة تكميلية E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103 (Am) thr::Tn10]) و E. coli dnaK756. تنتج خلايا E. coli dnaK103 DNA مقطوعا غير وظيفي ، وعلى هذا النحو ، تنمو الخلايا بشكل كاف عند 30 درجة مئوية ، في حين أن السلالة حساسة للبرودة والإجهاد الحراري12,13. وبالمثل ، فإن سلالة E. coli dnaK756 / BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) لا تنمو فوق 40 درجة مئوية14,15. تعبر سلالة E. coli dnaK756 عن DnaK الأصلي الطافر (DnaK756) الذي يتميز بثلاثة بدائل من الجلايسين إلى الأسبارتات في المواضع 32 و 455 و 468 ، مما يؤدي إلى نتائج بروتينية معرضة للخطر. وبالتالي ، فإن هذه السلالة مقاومة للبكتيريا λ DNA14. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر E. coli dnaK756 نشاطا مرتفعا ل ATPase ، بينما يتم تقليل تقاربها لعامل تبادل النوكليوتيدات ، GrpE ،16. الإشريكية القولونية تعمل سلالات DnaK الطافرة كنماذج مثالية للتحقيق في نشاط مرافقة Hsp70 من خلال نهج التكامل. نظرا لأن DnaK ضروري فقط في ظل الظروف العصيبة ، يتم إجراء اختبار التكملة عادة في درجات حرارة مرتفعة (الشكل 1). تشمل بعض مزايا استخدام الإشريكية القولونية في هذه الدراسة الجينوم المميز جيدا والنمو السريع والتكلفة المنخفضة للزراعة والصيانة17.
في هذه المقالة ، وصفنا بالتفصيل بروتوكولا يتضمن استخدام خلايا E. coli dnaK756 لدراسة وظيفة Hsp70. Hsp70s التي استخدمناها في الفحص هي DnaK من النوع البري ومشتقه الخيمري ، KPf (يتكون من مجال ATPase ل DnaK المنصهر في مجال ربط الركيزة C-terminal من Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18). تم التعبير عن KPf-V436F بشكل غير متجانس كعنصر تحكم سلبي لأن الطفرة تمنعه بشكل أساسي من ربط الركائز ، وبالتالي إلغاء نشاط مرافقه9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8,05,740</td>
			<td>Constituent for sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Labchem</td>
			<td>101005125</td>
			<td>Constituent of destainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8008300100</td>
			<td>Component of SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HG000BX1.500</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Clever Scientific</td>
			<td>14131031</td>
			<td>Certified molecular biology agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>101875295</td>
			<td>Constituent for SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>0339&#8212;EU&#8212;25G</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>1015460100</td>
			<td>Component of SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>0449-25G</td>
			<td>Constituent for sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>For competent cells preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>443293X</td>
			<td>SDS-PAGE dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RB10368</td>
			<td>Constituent of PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>32109</td>
			<td>Western blot detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>17898</td>
			<td>DNA intercalating dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR2676520L</td>
			<td>Constituent for sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10119CU</td>
			<td>Component of SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Glentham life sciences</td>
			<td>162IL</td>
			<td>inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Melford</td>
			<td>K0126</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR4123000EM</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Labchem</td>
			<td>113140129</td>
			<td>Constituent of destainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,04,87,30,250</td>
			<td>Constituent of PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HG000BX4.250</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR5042020EM</td>
			<td>Constituent of PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Thermofischer scientific</td>
			<td>PB7320</td>
			<td>Western blot membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR5822320EM</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>108073</td>
			<td>To resolve expressed proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax iD3</td>
			<td>Separations</td>
			<td>373705019</td>
			<td>Automated plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>ACRO420580500</td>
			<td>Component of SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Duchefa Biochemies</td>
			<td>T0150.0025</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>19A094101</td>
			<td>Component of SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR3164500XF</td>
			<td>Constituent for Western wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western transfer chamber</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>PB0112</td>
			<td>Transfer of protein to nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HG000BX6.500</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-DnaK antibody</td>
			<td>Inqaba</td>
			<td>BK CAC09317</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-rabbit antibody</td>
			<td>Thermofischer scientific</td>
			<td>31460</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

escherichia coli -based complementation assay to study the chaperone function of heat shock protein 70

بروتين الصدمة الحرارية 70 (Hsp70) هو بروتين محفوظ يسهل طي البروتينات الأخرى داخل الخلية ، مما يجعله مرافقا جزيئيا. في حين أن Hsp70 ليس ضروريا لخلايا الإشريكية القولونية التي تنمو في ظل الظروف العادية ، يصبح هذا المرافق لا غنى عنه للنمو في درجات حرارة مرتفعة. نظرا لأن Hsp70 محفوظ بشكل كبير ، فإن إحدى طرق دراسة وظيفة المرافقة لجينات Hsp70 من الأنواع المختلفة هي التعبير عنها بشكل غير متجانس في سلالات E. coli التي إما ناقصة في Hsp70 أو تعبر عن Hsp70 الأصلي الذي تم اختراقه وظيفيا. خلايا E. coli dnaK756 غير قادرة على دعم الحمض النووي للبكتيريا. علاوة على ذلك ، يظهر Hsp70 (DnaK) الأصلي نشاط ATPase مرتفعا مع إظهار تقارب منخفض ل GrpE (عامل تبادل النوكليوتيدات Hsp70). نتيجة لذلك ، تنمو خلايا E. coli dnaK756 بشكل كاف في درجات حرارة تتراوح من 30 درجة مئوية إلى 37 درجة مئوية ، لكنها تموت في درجات حرارة مرتفعة (>40 درجة مئوية). لهذا السبب ، تعمل هذه الخلايا كنموذج لدراسة نشاط مرافقة Hsp70. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لتطبيق هذه الخلايا لإجراء فحص مكمل ، مما يتيح دراسة وظيفة مرافقة السليلو في Hsp70.

Heat shock proteins play an important role as molecular chaperones by facilitating protein folding, preventing protein aggregation, and reversing protein misfolding1,2. Heat shock protein 70 (Hsp70) is one of the most prominent molecular chaperones, playing a central role in protein homeostasis3,4. DnaK is the E. coli Hsp70 homologue5.
Various biophysical, biochemical, and cell-based assays have been developed to explore the chaperone activity of Hsp70 and to screen for inhibitors targeting this chaperone6,7,8. Hsp70 is a highly conserved protein. For this reason, several Hsp70s of eukaryotic organisms, such as Plasmodium falciparum (the main agent of malaria), have been reported to substitute for DnaK function in E. coli6,9. In this way, an E. coli-based complementation assay has been developed involving the heterologous expression of Hsp70s in E. coli to explore their cytoprotective function. Typically, this assay involves the utilization of E. coli cells that are either deficient for DnaK or that express a native DnaK that is functionally compromised. While DnaK is not essential for E. coli growth under normal conditions, it becomes essential when the cells are grown under stressful conditions such as elevated temperatures or other forms of stress10,11.
E. coli strains that have been developed to study Hsp70 function using a complementation assay include E. coli dnaK103&#160;(BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) and E. coli dnaK756. E. coli dnaK103&#160;cells produce a truncated DnaK that is non-functional, and as such, the cells grow adequately at 30 &#176;C, while the strain is sensitive to cold and heat stress12,13. Similarly, the E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756&#160;recA::TcR Pdm1,1) strain does not grow above 40 &#176;C14,15. The E. coli dnaK756&#160;strain expresses a mutant native DnaK (DnaK756) characterized by three glycine-to-aspartate substitutions at positions 32, 455, and 468, giving rise to compromised proteostatic outcomes. Consequently, this strain is resistant to bacteriophage &#955; DNA14. Additionally, E. coli&#160;dnaK756 exhibits elevated ATPase activity, while its affinity for the nucleotide exchange factor, GrpE, is reduced16. E. coli DnaK mutant strains serve as ideal models for investigating the chaperone activity of Hsp70 through a complementation approach. Since DnaK is only essential under stressful conditions, the complementation assay is typically conducted at elevated temperatures (Figure 1). Some advantages of using E. coli for this study include its well-characterized genome, rapid growth, and the low cost of culturing and maintenance17.
In this article, we describe in detail a protocol involving the use of E. coli dnaK756&#160;cells to study the function of Hsp70. The Hsp70s we employed in the assay are wild-type DnaK and its chimeric derivative, KPf (made up of the ATPase domain of DnaK fused to the C-terminal substrate-binding domain of Plasmodium falciparum Hsp70-16,18). KPf-V436F was heterologously expressed as a negative control since the mutation essentially blocks it from binding substrates, thus abrogating its chaperone activity9.

تسليط الضوء على المؤلف: استكشاف بروتينات الصدمة الحرارية في عدوى الملاريا والسل

مقايسة تكميلية قائمة على الإشريكية القولونية لدراسة وظيفة المرافقة لبروتين الصدمة الحرارية 70

I study the role of heat shock proteins in conferring future static protection to antigens that cause human infections such as malaria and tuberculosis. My research essentially focuses on the structure and function features of the heat shock protein machinery of these pathogens that cause human infections. Heatstroke proteins are generally highly concept, however, they display some level of functional specialization.In addition, they are implicated in drug resistant. As such, there are ongoing efforts to target them towards reversing drug resistance in various disease models. They include biochemical, biophysical, bioinformatics, and cell biologic techniques.In other words, various areas of techniques are used to study the roles of these proteins. In our case, the study of proteins of Plasmodium was the main agent of malaria and that they are difficult to produce and this limits the capability to study these proteins. For example, it is difficult to generate sufficient levels to crystallize and image the proteins.We have established some of the functional networks of these proteins in the malaria parasite. We have also established assays to study the compounds targeting these proteins in agents causing malaria and TB.The current protocol is used to explore the chaperone protein folding role and then cytoprotective function of HSP 70 using equal as a model. The protocol could also be adopted for screening small molecule inhibitors targeting protein 70.

يقدم الشكل 2 صورة للأجار الممسوح ضوئيا الذي يحتوي على خلايا تم رصدها واستزراعها عند درجة حرارة نمو متساهلة تبلغ 37 درجة مئوية و 43.5 درجة مئوية على التوالي. على الجانب الأيمن من الشكل 2 ، تمثل مكونات اللطخة الغربية المستأصلة تعبير DnaK و KPf و KPf-V436F في خلايا E. coli dn...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Exploring Heat Shock Proteins in Malaria and Tuberculosis Infections at JoVE.com

يوضح هذا البروتوكول نشاط المرافقة لبروتين الصدمة الحرارية 70 (Hsp70). تعمل خلايا E. coli dnaK756 كنموذج للفحص لأنها تؤوي Hsp70 الأصلي ، مما يجعلها عرضة للإجهاد الحراري. الإدخال غير المتجانس ل Hsp70 الوظيفي ينقذ نقص نمو الخلايا.

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. ...

أدرس دور بروتينات الصدمة الحرارية في منح الحماية الساكنة في المستقبل للمستضدات التي تسبب العدوى البشرية مثل الملاريا والسل. يركز بحثي بشكل أساسي على بنية وخصائص وظيفة آلية بروتين الصدمة الحرارية لهذه العوامل الممرضة التي تسبب العدوى البشرية. تعتبر بروتينات ضربة الشمس مفهومة بشكل عام ، ومع ذلك ، فإنها تعرض مستوى معينا من التخصص الوظيفي.بالإضافة إلى ذلك ، فهي متورطة في مقاومة المخدرات. وعلى هذا النحو، هناك جهود جارية لاستهدافها نحو عكس مقاومة الأدوية في مختلف نماذج الأمراض. وهي تشمل الكيمياء الحيوية والفيزيائية الحيوية والمعلوماتية الحيوية والتقنيات البيولوجية الخلوية.بمعنى آخر ، يتم استخدام مجالات مختلفة من التقنيات لدراسة أدوار هذه البروتينات. في حالتنا ، كانت دراسة بروتينات البلازموديوم هي العامل الرئيسي للملاريا وأنه من الصعب إنتاجها وهذا يحد من القدرة على دراسة هذه البروتينات. على سبيل المثال ، من الصعب توليد مستويات كافية لبلورة البروتينات وتصويرها.لقد أنشأنا بعض الشبكات الوظيفية لهذه البروتينات في طفيلي الملاريا. كما أنشأنا مقايسات لدراسة المركبات التي تستهدف هذه البروتينات في العوامل المسببة للملاريا والسل. يستخدم البروتوكول الحالي لاستكشاف دور طي البروتين chaperone ثم وظيفة الحماية الخلوية ل HSP 70 باستخدام المساواة كنموذج. يمكن أيضا اعتماد البروتوكول لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة التي تستهدف البروتين 70.

escherichia-coli-based-complementation-assay-to-study-chaperone

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Escherichia coli -Based Complementation Assay to Study the Chaperone Function of Heat Shock Protein 70

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. While Hsp70 is not essential for E. coli cells growing under normal conditions, this chaperone becomes indispensable for growth at elevated temperatures. Since Hsp70 is highly conserved, one way to study the chaperone function of Hsp70&#160;genes from various species is to heterologously express them in E. coli strains that are either deficient in Hsp70 or express a native Hsp70 that is functionally compromised. E. coli dnaK756&#160;cells are unable to support &#955; bacteriophage DNA. Furthermore, their native Hsp70 (DnaK) exhibits elevated ATPase activity while demonstrating reduced affinity for GrpE (Hsp70 nucleotide exchange factor). As a result, E. coli dnaK756&#160;cells grow adequately at temperatures ranging from 30 &#176;C to 37 &#176;C, but they die at elevated temperatures (&#62;40 &#176;C). For this reason, these cells serve as a model for studying the chaperone activity of Hsp70. Here, we describe a detailed protocol for the application of these cells to conduct a complementation assay, enabling the study of the in cellulo chaperone function of Hsp70.

This protocol demonstrates the chaperone activity of heat shock protein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756 cells serve as a model for the assay as they harbor a native, functionally impaired Hsp70, making them susceptible to heat stress. The heterologous introduction of functional Hsp70 rescues the growth deficiency of the cells.