Name: Auteur in de schijnwerpers: onderzoek naar hitteschokeiwitten bij malaria- en tuberculose-infecties
Uploaded: 2024-03-08T14:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Exploring Heat Shock Proteins in Malaria and Tuberculosis Infections at JoVE.com

Het werk werd ondersteund met subsidie verkregen van het International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB) subsidienummer, HDI/CRP/012, Research Directorate van de Universiteit van Venda, grant I595, Department of Science and Innovation (DSI) en de National Research Foundation (NRF) van Zuid-Afrika (subsidienummers, 75464 en 92598) toegekend aan AS.

1. Transformatie
NOTITIE: Gebruik steriel glaswerk voor kweek, pipetpunten en vers bereide en geautoclaveerde media. Bereid culturen van de E. coli-cellen in 2x gisttrypton (YT) [1,6% trypton (w/v), 1% gistextract (w/v), 0,5% NaCl (w/v), 1,5% agar (w/v)] agar. Algemene reagentia die in het protocol worden gebruikt en hun bronnen zijn te vinden in de materiaaltabel.
<ol><li>Label 2,0 ml microcentrifugebuisjes en aliquot 50 μL competente E. coli ...

Beoordeling van Hsp70-chaperonne-activiteit met behulp van Escherichia coli dnaK756-cellen

<ol>
	<li>Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+newly+synthesized+proteins+into+shape.">Getting newly synthesized proteins into shape.</a> Cell. 101 (2), 119-122 (2000).</li><li>Shonhai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodial+heat+shock+proteins:+targets+for+chemotherapy.">Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy.</a> FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).</li><li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins:+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB.">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li><li>Edkins, A. L., Boshoff, A., Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+structural+and+functional+features+of+molecular+chaperones.+Heat+shock+proteins+of+malaria.">General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria.</a> Adv Exp Med Biol. , (2021).</li><li>Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+conformation+of+wild-type+E.+coli.+Hsp70+(DnaK)+chaperone+complexed+with+ADP+and+substrate.">Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate.</a> PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).</li><li>Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+heat+shock+protein+70+is+able+to+suppress+the+thermosensitivity+of+an+Escherichia+coli+DnaK+mutant+strain.">Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain.</a> Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).</li><li>Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+study+of+a+Plasmodium+falciparum+Hsp70+using+three-dimensional+modelling+and+in+vitro+analyses.">Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses.</a> Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).</li><li>Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -. R., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+modulation+of+plasmodial+Hsp70s+by+small+molecules+with+antimalarial+activity.">Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity.</a> Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).</li><li>Makhoba, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+chimeric+Hsp70+to+enhance+the+quality+of+recombinant+Plasmodium+falciparum+s-adenosylmethionine+decarboxylase+protein+produced+in+Escherichia+coli.">Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli.</a> PLoS One. 11 (3), 0152626 (2016).</li><li>Bukau, B., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+defects+caused+by+deletion+of+the+Escherichia+coli+dnaK+gene+indicate+roles+for+heat+shock+protein+in+normal+metabolism.">Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism.</a> J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).</li><li>Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaK+protein+alleviates+toxicity+induced+by+citrate-coated+gold+nanoparticles+in+Escherichia+coli.">DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli.</a> PLoS One. 10 (4), 0121243 (2015).</li><li>Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Escherichia+coli+heat+shock+proteins+DnaK+and+HtpG+(C62.+5)+in+response+to+nutritional+deprivation.">Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation.</a> J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).</li><li>Mayer, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistep+mechanism+of+substrate+binding+determines+chaperone+activity+of+Hsp70.">Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70.</a> Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).</li><li>Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+bacterial+gene+(groP+C)+which+affects+&#955;+DNA+replication.">A new bacterial gene (groP C) which affects &#955; DNA replication.</a> Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).</li><li>Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dnaK+protein+modulates+the+heat-shock+response+of+Escherichia+coli.">The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli.</a> Cell. 34 (2), 641-646 (1983).</li><li>Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+defects+of+the+DnaK756+mutant+chaperone+of+Escherichia+coli+indicate+distinct+roles+for+amino-and+carboxyl-terminal+residues+in+substrate+and+co-chaperone+interaction+and+interdomain+communication.">Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication.</a> J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).</li><li>Taj, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+as+a+model+organism.">Escherichia coli as a model organism.</a> Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).</li><li>Sato, S., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+cochaperonins+in+apicomplexan+parasites.">Organelle-specific cochaperonins in apicomplexan parasites.</a> Mol Biochem Parasitol. 141 (2), 133-143 (2005).</li><li>Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University Available from: <a target="_blank" href="https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University">https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University</a> (2007)</li><li>Makumire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+GGMP+repeat+segments+of+Plasmodium+falciparum+Hsp70-1+compromises+chaperone+function+and+Hop+co-chaperone+binding.">Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding.</a> Int J Mol Sci. 22 (4), 2226 (2021).</li><li>Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+Hsp70+family+proteins:+Expanding+the+chaperone+code.">Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code.</a> J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).</li><li>Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+functionality+of+non-native+Hsp70+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Bio Protoc. 9 (19), e3389 (2019).</li></ol>

Het protocol demonstreert het nut van E. coli dnaK756-cellenbij het onderzoeken van de chaperonnefunctie van heterologisch tot expressie gebracht Hsp70. Deze test zou kunnen worden gebruikt om remmers te screenen die gericht zijn op de Hsp70-functie in cellulo. Een beperking van deze methode is echter dat Hsp70's die niet in staat zijn om DnaK in E. coli te vervangen, niet compatibel zijn met deze test. Gebrek aan posttranslationele modificatie21 van sommige niet-inheems...

Heat shock-eiwitten spelen een belangrijke rol als moleculaire chaperonnes door het vouwen van eiwitten te vergemakkelijken, eiwitaggregatie te voorkomen en hetverkeerd vouwen van eiwitten om te keren1,2. Heat shock proteïne 70 (Hsp70) is een van de meest prominente moleculaire chaperonnes en speelt een centrale rol in eiwithomeostase 3,4. DnaK is de E. coli Hsp70 homoloog5.
Er zijn verschillende biofysische, biochemische en celgebaseerde testen ontwikkeld om de chaperonne-activiteit van Hsp70 te onderzoeken en te screenen op remmers die gericht zijn op deze chaperonne 6,7,8. Hsp70 is een sterk geconserveerd eiwit. Om deze reden zijn verschillende Hsp70's van eukaryote organismen, zoals Plasmodium falciparum (de belangrijkste verwekker van malaria), gemeld om de DnaK-functie in E. coli 6,9 te vervangen. Op deze manier is een op E. coli gebaseerde complementatietest ontwikkeld met betrekking tot de heterologe expressie van Hsp70's in E. coli om hun cytoprotectieve functie te onderzoeken. Meestal omvat deze test het gebruik van E. coli-cellen die ofwel een tekort hebben aan DnaK of die een native DnaK tot expressie brengen die functioneel gecompromitteerd is. Hoewel DnaK onder normale omstandigheden niet essentieel is voor de groei van E. coli, wordt het essentieel wanneer de cellen worden gekweekt onder stressvolle omstandigheden zoals verhoogde temperaturen of andere vormen vanstress10,11.
E. coli-stammen die zijn ontwikkeld om de functie van Hsp70 te bestuderen met behulp van een complementatietest zijn onder meer E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) en E. coli dnaK756. E. coli dnaK103-cellen produceren een afgeknotte DnaK die niet functioneel is, en als zodanig groeien de cellen voldoende bij 30 °C, terwijl de stam gevoelig is voor koude- en hittestress 12,13. Ook de E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) stam wordt niet hoger dan 40 °C14,15. De E. coli dnaK756-stam brengt een gemuteerd native DnaK (DnaK756) tot expressie dat wordt gekenmerkt door drie glycine-naar-aspartaatsubstituties op posities 32, 455 en 468, wat aanleiding geeft tot gecompromitteerde proteostatische uitkomsten. Bijgevolg is deze stam resistent tegen bacteriofaag λ DNA14. Bovendien vertoont E. coli dnaK756 een verhoogde ATPase-activiteit, terwijl de affiniteit voor de nucleotide-uitwisselingsfactor, GrpE, verminderd is16. E. coli DnaK-mutante stammen dienen als ideale modellen voor het onderzoeken van de chaperonne-activiteit van Hsp70 door middel van een complementatiebenadering. Aangezien DnaK alleen essentieel is onder stressvolle omstandigheden, wordt de complementatietest meestal uitgevoerd bij verhoogde temperaturen (Figuur 1). Enkele voordelen van het gebruik van E. coli voor dit onderzoek zijn het goed gekarakteriseerde genoom, de snelle groei en de lage kosten van kweek enonderhoud17.
In dit artikel beschrijven we in detail een protocol waarbij E. coli dnaK756-cellen worden gebruikt om de functie van Hsp70 te bestuderen. De Hsp70's die we in de test hebben gebruikt, zijn wild-type DnaK en zijn chimere derivaat, KPf (bestaande uit het ATPase-domein van DnaK dat is gefuseerd met het C-terminale substraatbindende domein van Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18). KPf-V436F werd heteroloog uitgedrukt als een negatieve controle, aangezien de mutatie in wezen blokkeert om substraten te binden, waardoor de chaperonne-activiteit wordt opgeheven9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8,05,740</td>
			<td>Constituent for sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Labchem</td>
			<td>101005125</td>
			<td>Constituent of destainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8008300100</td>
			<td>Component of SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HG000BX1.500</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Clever Scientific</td>
			<td>14131031</td>
			<td>Certified molecular biology agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>101875295</td>
			<td>Constituent for SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>0339&#8212;EU&#8212;25G</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>1015460100</td>
			<td>Component of SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>0449-25G</td>
			<td>Constituent for sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>For competent cells preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>443293X</td>
			<td>SDS-PAGE dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RB10368</td>
			<td>Constituent of PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>32109</td>
			<td>Western blot detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>17898</td>
			<td>DNA intercalating dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR2676520L</td>
			<td>Constituent for sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10119CU</td>
			<td>Component of SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Glentham life sciences</td>
			<td>162IL</td>
			<td>inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Melford</td>
			<td>K0126</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR4123000EM</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Labchem</td>
			<td>113140129</td>
			<td>Constituent of destainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,04,87,30,250</td>
			<td>Constituent of PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HG000BX4.250</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR5042020EM</td>
			<td>Constituent of PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Thermofischer scientific</td>
			<td>PB7320</td>
			<td>Western blot membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR5822320EM</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>108073</td>
			<td>To resolve expressed proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax iD3</td>
			<td>Separations</td>
			<td>373705019</td>
			<td>Automated plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>ACRO420580500</td>
			<td>Component of SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Duchefa Biochemies</td>
			<td>T0150.0025</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>19A094101</td>
			<td>Component of SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR3164500XF</td>
			<td>Constituent for Western wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western transfer chamber</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>PB0112</td>
			<td>Transfer of protein to nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HG000BX6.500</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-DnaK antibody</td>
			<td>Inqaba</td>
			<td>BK CAC09317</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-rabbit antibody</td>
			<td>Thermofischer scientific</td>
			<td>31460</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

escherichia coli -based complementation assay to study the chaperone function of heat shock protein 70

Heat shock protein 70 (Hsp70) is een geconserveerd eiwit dat het vouwen van andere eiwitten in de cel vergemakkelijkt, waardoor het een moleculaire chaperonne wordt. Hoewel Hsp70 niet essentieel is voor de groei van E. coli-cellen onder normale omstandigheden, wordt deze chaperonne onmisbaar voor de groei bij verhoogde temperaturen. Aangezien Hsp70 sterk geconserveerd is, is een manier om de chaperonnefunctie van Hsp70-genen van verschillende soorten te bestuderen, ze heterologisch tot expressie te brengen in E. coli-stammen die ofwel een tekort aan Hsp70 hebben of een native Hsp70 tot expressie brengen die functioneel gecompromitteerd is. E. coli dnaK756-cellen zijn niet in staat om λ bacteriofaag-DNA te ondersteunen. Bovendien vertoont hun oorspronkelijke Hsp70 (DnaK) verhoogde ATPase-activiteit, terwijl het een verminderde affiniteit voor GrpE (Hsp70-nucleotide-uitwisselingsfactor) vertoont. Als gevolg hiervan groeien E. coli dnaK756-cellen adequaat bij temperaturen van 30 °C tot 37 °C, maar sterven ze bij verhoogde temperaturen (>40 °C). Om deze reden dienen deze cellen als model voor het bestuderen van de chaperonne-activiteit van Hsp70. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de toepassing van deze cellen om een complementatietest uit te voeren, waardoor de studie van de in cellulo chaperonnefunctie van Hsp70 mogelijk wordt.

Heat shock proteins play an important role as molecular chaperones by facilitating protein folding, preventing protein aggregation, and reversing protein misfolding1,2. Heat shock protein 70 (Hsp70) is one of the most prominent molecular chaperones, playing a central role in protein homeostasis3,4. DnaK is the E. coli Hsp70 homologue5.
Various biophysical, biochemical, and cell-based assays have been developed to explore the chaperone activity of Hsp70 and to screen for inhibitors targeting this chaperone6,7,8. Hsp70 is a highly conserved protein. For this reason, several Hsp70s of eukaryotic organisms, such as Plasmodium falciparum (the main agent of malaria), have been reported to substitute for DnaK function in E. coli6,9. In this way, an E. coli-based complementation assay has been developed involving the heterologous expression of Hsp70s in E. coli to explore their cytoprotective function. Typically, this assay involves the utilization of E. coli cells that are either deficient for DnaK or that express a native DnaK that is functionally compromised. While DnaK is not essential for E. coli growth under normal conditions, it becomes essential when the cells are grown under stressful conditions such as elevated temperatures or other forms of stress10,11.
E. coli strains that have been developed to study Hsp70 function using a complementation assay include E. coli dnaK103&#160;(BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) and E. coli dnaK756. E. coli dnaK103&#160;cells produce a truncated DnaK that is non-functional, and as such, the cells grow adequately at 30 &#176;C, while the strain is sensitive to cold and heat stress12,13. Similarly, the E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756&#160;recA::TcR Pdm1,1) strain does not grow above 40 &#176;C14,15. The E. coli dnaK756&#160;strain expresses a mutant native DnaK (DnaK756) characterized by three glycine-to-aspartate substitutions at positions 32, 455, and 468, giving rise to compromised proteostatic outcomes. Consequently, this strain is resistant to bacteriophage &#955; DNA14. Additionally, E. coli&#160;dnaK756 exhibits elevated ATPase activity, while its affinity for the nucleotide exchange factor, GrpE, is reduced16. E. coli DnaK mutant strains serve as ideal models for investigating the chaperone activity of Hsp70 through a complementation approach. Since DnaK is only essential under stressful conditions, the complementation assay is typically conducted at elevated temperatures (Figure 1). Some advantages of using E. coli for this study include its well-characterized genome, rapid growth, and the low cost of culturing and maintenance17.
In this article, we describe in detail a protocol involving the use of E. coli dnaK756&#160;cells to study the function of Hsp70. The Hsp70s we employed in the assay are wild-type DnaK and its chimeric derivative, KPf (made up of the ATPase domain of DnaK fused to the C-terminal substrate-binding domain of Plasmodium falciparum Hsp70-16,18). KPf-V436F was heterologously expressed as a negative control since the mutation essentially blocks it from binding substrates, thus abrogating its chaperone activity9.

Auteur in de schijnwerpers: onderzoek naar hitteschokeiwitten bij malaria- en tuberculose-infecties

Op Escherichia coli gebaseerde complementatietest om de chaperonnefunctie van heat shock-eiwit te bestuderen 70

I study the role of heat shock proteins in conferring future static protection to antigens that cause human infections such as malaria and tuberculosis. My research essentially focuses on the structure and function features of the heat shock protein machinery of these pathogens that cause human infections. Heatstroke proteins are generally highly concept, however, they display some level of functional specialization.In addition, they are implicated in drug resistant. As such, there are ongoing efforts to target them towards reversing drug resistance in various disease models. They include biochemical, biophysical, bioinformatics, and cell biologic techniques.In other words, various areas of techniques are used to study the roles of these proteins. In our case, the study of proteins of Plasmodium was the main agent of malaria and that they are difficult to produce and this limits the capability to study these proteins. For example, it is difficult to generate sufficient levels to crystallize and image the proteins.We have established some of the functional networks of these proteins in the malaria parasite. We have also established assays to study the compounds targeting these proteins in agents causing malaria and TB.The current protocol is used to explore the chaperone protein folding role and then cytoprotective function of HSP 70 using equal as a model. The protocol could also be adopted for screening small molecule inhibitors targeting protein 70.

Figuur 2 toont een afbeelding van de gescande agar met cellen die werden gespot en gekweekt bij de permissieve groeitemperatuur van respectievelijk 37 °C en 43,5 °C. Aan de rechterkant van figuur 2 geven uitgesneden western blot-componenten de expressie weer van DnaK, KPf en KPf-V436F in E. coli dnaK756-cellen. Zoals verwacht slaagden alle E. coli dnaK756-cellen die werden gekweekt bij de permissieve groeitemperatuur van 37 °C erin om te gro...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Exploring Heat Shock Proteins in Malaria and Tuberculosis Infections at JoVE.com

Dit protocol demonstreert de chaperonne-activiteit van heat shock protein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756-cellen dienen als model voor de test omdat ze een inheemse, functioneel gehandicapte Hsp70 herbergen, waardoor ze vatbaar zijn voor hittestress. De heterologe introductie van functioneel Hsp70 redt de groeideficiëntie van de cellen.

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. ...

Ik bestudeer de rol van heat shock eiwitten in het verlenen van toekomstige statische bescherming aan antigenen die menselijke infecties zoals malaria en tuberculose veroorzaken. Mijn onderzoek richt zich voornamelijk op de structuur- en functiekenmerken van de hitteschok-eiwitmachinerie van deze ziekteverwekkers die menselijke infecties veroorzaken. Hitteberoerte-eiwitten zijn over het algemeen zeer conceptueel, maar ze vertonen een zekere mate van functionele specialisatie.Bovendien zijn ze betrokken bij resistente geneesmiddelen. Als zodanig zijn er voortdurende inspanningen om ze te richten op het omkeren van resistentie tegen geneesmiddelen in verschillende ziektemodellen. Ze omvatten biochemische, biofysische, bio-informatica en celbiologische technieken.Met andere woorden, er worden verschillende technieken gebruikt om de rol van deze eiwitten te bestuderen. In ons geval was de studie van eiwitten van Plasmodium de belangrijkste veroorzaker van malaria en dat ze moeilijk te produceren zijn en dit beperkt het vermogen om deze eiwitten te bestuderen. Het is bijvoorbeeld moeilijk om voldoende niveaus te genereren om de eiwitten te kristalliseren en in beeld te brengen.We hebben een aantal van de functionele netwerken van deze eiwitten in de malariaparasiet aangelegd. We hebben ook tests opgezet om de verbindingen te bestuderen die zich richten op deze eiwitten in middelen die malaria en tuberculose veroorzaken. Het huidige protocol wordt gebruikt om de rol van het vouwen van chaperonne-eiwitten en vervolgens de cytoprotectieve functie van HSP 70 te onderzoeken met behulp van equal als model. Het protocol zou ook kunnen worden gebruikt voor het screenen van remmers van kleine moleculen die gericht zijn op eiwit 70.

escherichia-coli-based-complementation-assay-to-study-chaperone

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Escherichia coli -Based Complementation Assay to Study the Chaperone Function of Heat Shock Protein 70

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. While Hsp70 is not essential for E. coli cells growing under normal conditions, this chaperone becomes indispensable for growth at elevated temperatures. Since Hsp70 is highly conserved, one way to study the chaperone function of Hsp70&#160;genes from various species is to heterologously express them in E. coli strains that are either deficient in Hsp70 or express a native Hsp70 that is functionally compromised. E. coli dnaK756&#160;cells are unable to support &#955; bacteriophage DNA. Furthermore, their native Hsp70 (DnaK) exhibits elevated ATPase activity while demonstrating reduced affinity for GrpE (Hsp70 nucleotide exchange factor). As a result, E. coli dnaK756&#160;cells grow adequately at temperatures ranging from 30 &#176;C to 37 &#176;C, but they die at elevated temperatures (&#62;40 &#176;C). For this reason, these cells serve as a model for studying the chaperone activity of Hsp70. Here, we describe a detailed protocol for the application of these cells to conduct a complementation assay, enabling the study of the in cellulo chaperone function of Hsp70.

This protocol demonstrates the chaperone activity of heat shock protein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756 cells serve as a model for the assay as they harbor a native, functionally impaired Hsp70, making them susceptible to heat stress. The heterologous introduction of functional Hsp70 rescues the growth deficiency of the cells.