Name: מחבר זרקור: חקר חלבוני הלם חום בזיהומים במלריה ושחפת
Uploaded: 2024-03-08T14:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Exploring Heat Shock Proteins in Malaria and Tuberculosis Infections at JoVE.com

העבודה נתמכה באמצעות מענק שהתקבל מהמרכז הבינלאומי להנדסה גנטית וביוטכנולוגיה (ICGEB), HDI/CRP/012, מנהל המחקר של אוניברסיטת ונדה, מענק I595, המחלקה למדע וחדשנות (DSI) וקרן המחקר הלאומית (NRF) של דרום אפריקה (מספרי מענקים, 75464 ו-92598) שהוענקו ל-AS.

1. טרנספורמציה
הערה: השתמש בכלי זכוכית סטריליים לתרבית, קצוות פיפטה ומדיה טרייה ואוטומטית. הכינו תרביות של תאי E. coli ב-2x שמרים טריפטון (YT) [1.6% טריפטון (w/v), 1% תמצית שמרים (w/v), 0.5% NaCl (w/v), 1.5% אגר (w/v)] אגר. ריאגנטים כלליים המשמשים בפרוטוקול ומקורותיהם מובאים בטבלת החומ...

הערכת פעילות מלווה Hsp70 באמצעות תאי Escherichia coli dnaK756

<ol>
	<li>Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+newly+synthesized+proteins+into+shape.">Getting newly synthesized proteins into shape.</a> Cell. 101 (2), 119-122 (2000).</li><li>Shonhai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodial+heat+shock+proteins:+targets+for+chemotherapy.">Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy.</a> FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).</li><li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins:+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB.">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li><li>Edkins, A. L., Boshoff, A., Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+structural+and+functional+features+of+molecular+chaperones.+Heat+shock+proteins+of+malaria.">General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria.</a> Adv Exp Med Biol. , (2021).</li><li>Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+conformation+of+wild-type+E.+coli.+Hsp70+(DnaK)+chaperone+complexed+with+ADP+and+substrate.">Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate.</a> PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).</li><li>Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+heat+shock+protein+70+is+able+to+suppress+the+thermosensitivity+of+an+Escherichia+coli+DnaK+mutant+strain.">Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain.</a> Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).</li><li>Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+study+of+a+Plasmodium+falciparum+Hsp70+using+three-dimensional+modelling+and+in+vitro+analyses.">Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses.</a> Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).</li><li>Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -. R., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+modulation+of+plasmodial+Hsp70s+by+small+molecules+with+antimalarial+activity.">Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity.</a> Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).</li><li>Makhoba, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+chimeric+Hsp70+to+enhance+the+quality+of+recombinant+Plasmodium+falciparum+s-adenosylmethionine+decarboxylase+protein+produced+in+Escherichia+coli.">Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli.</a> PLoS One. 11 (3), 0152626 (2016).</li><li>Bukau, B., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+defects+caused+by+deletion+of+the+Escherichia+coli+dnaK+gene+indicate+roles+for+heat+shock+protein+in+normal+metabolism.">Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism.</a> J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).</li><li>Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaK+protein+alleviates+toxicity+induced+by+citrate-coated+gold+nanoparticles+in+Escherichia+coli.">DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli.</a> PLoS One. 10 (4), 0121243 (2015).</li><li>Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Escherichia+coli+heat+shock+proteins+DnaK+and+HtpG+(C62.+5)+in+response+to+nutritional+deprivation.">Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation.</a> J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).</li><li>Mayer, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistep+mechanism+of+substrate+binding+determines+chaperone+activity+of+Hsp70.">Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70.</a> Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).</li><li>Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+bacterial+gene+(groP+C)+which+affects+&#955;+DNA+replication.">A new bacterial gene (groP C) which affects &#955; DNA replication.</a> Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).</li><li>Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dnaK+protein+modulates+the+heat-shock+response+of+Escherichia+coli.">The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli.</a> Cell. 34 (2), 641-646 (1983).</li><li>Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+defects+of+the+DnaK756+mutant+chaperone+of+Escherichia+coli+indicate+distinct+roles+for+amino-and+carboxyl-terminal+residues+in+substrate+and+co-chaperone+interaction+and+interdomain+communication.">Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication.</a> J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).</li><li>Taj, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+as+a+model+organism.">Escherichia coli as a model organism.</a> Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).</li><li>Sato, S., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+cochaperonins+in+apicomplexan+parasites.">Organelle-specific cochaperonins in apicomplexan parasites.</a> Mol Biochem Parasitol. 141 (2), 133-143 (2005).</li><li>Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University Available from: <a target="_blank" href="https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University">https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University</a> (2007)</li><li>Makumire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+GGMP+repeat+segments+of+Plasmodium+falciparum+Hsp70-1+compromises+chaperone+function+and+Hop+co-chaperone+binding.">Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding.</a> Int J Mol Sci. 22 (4), 2226 (2021).</li><li>Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+Hsp70+family+proteins:+Expanding+the+chaperone+code.">Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code.</a> J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).</li><li>Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+functionality+of+non-native+Hsp70+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Bio Protoc. 9 (19), e3389 (2019).</li></ol>

הפרוטוקול מדגים את התועלת של תאי E. coli dnaK756בחקר תפקוד המלווה של Hsp70 מבוטא באופן הטרולוגי. בדיקה זו יכולה להיות מאומצת כדי לסנן מעכבים המכוונים לתפקוד Hsp70 בצלולו. עם זאת, מגבלה אחת של שיטה זו היא כי Hsp70s שאינם מסוגלים להחליף DnaK ב E. coli אינם תואמים לבדיקה זו. חוסר שינוי לאחר תרגום<sup c...

חלבוני הלם חום ממלאים תפקיד חשוב כמלווים מולקולריים בכך שהם מסייעים לקיפול חלבונים, מונעים צבירת חלבונים והופכים קיפול שגוישל חלבונים 1,2. חלבון הלם חום 70 (Hsp70) הוא אחד המלווים המולקולריים הבולטים ביותר, הממלא תפקיד מרכזי בהומאוסטזיס של חלבון 3,4. DnaK הוא E. coli Hsp70 homologue5.
בדיקות ביופיזיקליות, ביוכימיות ומבוססות תאים שונות פותחו כדי לחקור את פעילות המלווה של Hsp70 ולסנן מעכבים המכוונים למלווה זה 6,7,8. Hsp70 הוא חלבון שמור מאוד. מסיבה זו, מספר Hsp70s של אורגניזמים אאוקריוטים, כגון פלסמודיום falciparum (הסוכן העיקרי של מלריה), דווחו כתחליף לתפקוד DnaK ב- E. coli 6,9. בדרך זו, פותחה בדיקת השלמה מבוססת E. coli הכוללת את הביטוי ההטרולוגי של Hsp70s ב- E. coli כדי לחקור את הפונקציה cytoprotective שלהם. בדרך כלל, בדיקה זו כוללת ניצול של תאי E. coli אשר חסרים עבור DnaK או המבטאים DnaK מקורי כי הוא בסכנה תפקודית. בעוד DnaK אינו חיוני לצמיחת E. coli בתנאים רגילים, הוא הופך להיות חיוני כאשר התאים גדלים בתנאים מלחיצים כגון טמפרטורות גבוהות או צורות אחרות של מתח10,11.
זני E. coli שפותחו כדי לחקור את תפקוד Hsp70 באמצעות בדיקת השלמה כוללים E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) ו- E. coli dnaK756. תאי E. coli dnaK103 מייצרים DnaK קטוע שאינו מתפקד, וככזה, התאים גדלים כראוי ב 30 ° C, בעוד הזן רגיש לקור ומתח חום12,13. באופן דומה, זן E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) אינו גדל מעל 40°C14,15. זן E. coli dnaK756 מבטא DnaK טבעי מוטנטי (DnaK756) המאופיין בשלושה תחליפי גליצין לאספרטט במיקומים 32, 455 ו-468, מה שגורם לתוצאות פרוטאוסטטיות בסיכון. כתוצאה מכך, זן זה עמיד בפני בקטריופאג' λ DNA14. בנוסף, E. coli dnaK756 מציג פעילות ATPase מוגברת, בעוד זיקתו לגורם חילופי הנוקלאוטידים, GrpE, מופחתת16. אי קולי זנים מוטנטיים של DnaK משמשים כמודלים אידיאליים לחקר פעילות המלווה של Hsp70 באמצעות גישת השלמה. מאחר ש-DnaK חיוני רק בתנאי לחץ, בדיקת ההשלמה מתבצעת בדרך כלל בטמפרטורות גבוהות (איור 1). כמה יתרונות של שימוש E. coli עבור מחקר זה כוללים גנום מאופיין היטב, צמיחה מהירה, ואת העלות הנמוכה של גידול ותחזוקה17.
במאמר זה, אנו מתארים בפירוט פרוטוקול הכולל שימוש בתאי E. coli dnaK756 כדי לחקור את הפונקציה של Hsp70. ה-Hsp70s בהם השתמשנו בבדיקה הם מסוג פרא DnaK והנגזרת הכימרית שלו, KPf (המורכבת מתחום ATPase של DnaK המאוחה לתחום קשירת המצע C-terminal של Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18). KPf-V436F התבטא באופן הטרולוגי כבקרה שלילית, שכן המוטציה למעשה חוסמת אותו ממצע קשירה, ובכך מבטלת את פעילות המלווה שלו9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8,05,740</td>
			<td>Constituent for sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Labchem</td>
			<td>101005125</td>
			<td>Constituent of destainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8008300100</td>
			<td>Component of SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HG000BX1.500</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Clever Scientific</td>
			<td>14131031</td>
			<td>Certified molecular biology agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>101875295</td>
			<td>Constituent for SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>0339&#8212;EU&#8212;25G</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>1015460100</td>
			<td>Component of SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>0449-25G</td>
			<td>Constituent for sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>For competent cells preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>443293X</td>
			<td>SDS-PAGE dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RB10368</td>
			<td>Constituent of PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>32109</td>
			<td>Western blot detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>17898</td>
			<td>DNA intercalating dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR2676520L</td>
			<td>Constituent for sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10119CU</td>
			<td>Component of SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Glentham life sciences</td>
			<td>162IL</td>
			<td>inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Melford</td>
			<td>K0126</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR4123000EM</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Labchem</td>
			<td>113140129</td>
			<td>Constituent of destainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,04,87,30,250</td>
			<td>Constituent of PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HG000BX4.250</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR5042020EM</td>
			<td>Constituent of PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Thermofischer scientific</td>
			<td>PB7320</td>
			<td>Western blot membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR5822320EM</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>108073</td>
			<td>To resolve expressed proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax iD3</td>
			<td>Separations</td>
			<td>373705019</td>
			<td>Automated plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>ACRO420580500</td>
			<td>Component of SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Duchefa Biochemies</td>
			<td>T0150.0025</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>19A094101</td>
			<td>Component of SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR3164500XF</td>
			<td>Constituent for Western wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western transfer chamber</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>PB0112</td>
			<td>Transfer of protein to nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HG000BX6.500</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-DnaK antibody</td>
			<td>Inqaba</td>
			<td>BK CAC09317</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-rabbit antibody</td>
			<td>Thermofischer scientific</td>
			<td>31460</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

escherichia coli -based complementation assay to study the chaperone function of heat shock protein 70

חלבון הלם חום 70 (Hsp70) הוא חלבון שמור המאפשר קיפול של חלבונים אחרים בתוך התא, מה שהופך אותו למלווה מולקולרי. בעוד Hsp70 אינו חיוני עבור תאי E. coli הגדלים בתנאים רגילים, מלווה זה הופך להיות חיוני לצמיחה בטמפרטורות גבוהות. מאחר ש-Hsp70 שמור מאוד, אחת הדרכים לחקור את תפקוד המלווה של גנים מסוג Hsp70 ממינים שונים היא לבטא אותם באופן הטרולוגי בזני E. coli שחסרים ב-Hsp70 או לבטא Hsp70 מקורי שנפגע מבחינה תפקודית. תאי E. coli dnaK756 אינם מסוגלים לתמוך בדנ"א של λ בקטריופאג'. יתר על כן, Hsp70 (DnaK) המקומי שלהם מציג פעילות ATPase מוגברת תוך הפגנת זיקה מופחתת ל- GrpE (גורם חילופי נוקלאוטידים Hsp70). כתוצאה מכך, תאי E. coli dnaK756 גדלים כראוי בטמפרטורות הנעות בין 30 °C (75 °F) ל 37 °C (75 °F), אך הם מתים בטמפרטורות גבוהות (>40 °C). מסיבה זו, תאים אלה משמשים מודל לחקר פעילות המלווה של Hsp70. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול מפורט ליישום תאים אלה לביצוע בדיקת השלמה, המאפשרת לחקור את פונקציית מלווה הצלולו של Hsp70.

Heat shock proteins play an important role as molecular chaperones by facilitating protein folding, preventing protein aggregation, and reversing protein misfolding1,2. Heat shock protein 70 (Hsp70) is one of the most prominent molecular chaperones, playing a central role in protein homeostasis3,4. DnaK is the E. coli Hsp70 homologue5.
Various biophysical, biochemical, and cell-based assays have been developed to explore the chaperone activity of Hsp70 and to screen for inhibitors targeting this chaperone6,7,8. Hsp70 is a highly conserved protein. For this reason, several Hsp70s of eukaryotic organisms, such as Plasmodium falciparum (the main agent of malaria), have been reported to substitute for DnaK function in E. coli6,9. In this way, an E. coli-based complementation assay has been developed involving the heterologous expression of Hsp70s in E. coli to explore their cytoprotective function. Typically, this assay involves the utilization of E. coli cells that are either deficient for DnaK or that express a native DnaK that is functionally compromised. While DnaK is not essential for E. coli growth under normal conditions, it becomes essential when the cells are grown under stressful conditions such as elevated temperatures or other forms of stress10,11.
E. coli strains that have been developed to study Hsp70 function using a complementation assay include E. coli dnaK103&#160;(BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) and E. coli dnaK756. E. coli dnaK103&#160;cells produce a truncated DnaK that is non-functional, and as such, the cells grow adequately at 30 &#176;C, while the strain is sensitive to cold and heat stress12,13. Similarly, the E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756&#160;recA::TcR Pdm1,1) strain does not grow above 40 &#176;C14,15. The E. coli dnaK756&#160;strain expresses a mutant native DnaK (DnaK756) characterized by three glycine-to-aspartate substitutions at positions 32, 455, and 468, giving rise to compromised proteostatic outcomes. Consequently, this strain is resistant to bacteriophage &#955; DNA14. Additionally, E. coli&#160;dnaK756 exhibits elevated ATPase activity, while its affinity for the nucleotide exchange factor, GrpE, is reduced16. E. coli DnaK mutant strains serve as ideal models for investigating the chaperone activity of Hsp70 through a complementation approach. Since DnaK is only essential under stressful conditions, the complementation assay is typically conducted at elevated temperatures (Figure 1). Some advantages of using E. coli for this study include its well-characterized genome, rapid growth, and the low cost of culturing and maintenance17.
In this article, we describe in detail a protocol involving the use of E. coli dnaK756&#160;cells to study the function of Hsp70. The Hsp70s we employed in the assay are wild-type DnaK and its chimeric derivative, KPf (made up of the ATPase domain of DnaK fused to the C-terminal substrate-binding domain of Plasmodium falciparum Hsp70-16,18). KPf-V436F was heterologously expressed as a negative control since the mutation essentially blocks it from binding substrates, thus abrogating its chaperone activity9.

מחבר זרקור: חקר חלבוני הלם חום בזיהומים במלריה ושחפת

Escherichia coli -מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70

I study the role of heat shock proteins in conferring future static protection to antigens that cause human infections such as malaria and tuberculosis. My research essentially focuses on the structure and function features of the heat shock protein machinery of these pathogens that cause human infections. Heatstroke proteins are generally highly concept, however, they display some level of functional specialization.In addition, they are implicated in drug resistant. As such, there are ongoing efforts to target them towards reversing drug resistance in various disease models. They include biochemical, biophysical, bioinformatics, and cell biologic techniques.In other words, various areas of techniques are used to study the roles of these proteins. In our case, the study of proteins of Plasmodium was the main agent of malaria and that they are difficult to produce and this limits the capability to study these proteins. For example, it is difficult to generate sufficient levels to crystallize and image the proteins.We have established some of the functional networks of these proteins in the malaria parasite. We have also established assays to study the compounds targeting these proteins in agents causing malaria and TB.The current protocol is used to explore the chaperone protein folding role and then cytoprotective function of HSP 70 using equal as a model. The protocol could also be adopted for screening small molecule inhibitors targeting protein 70.

איור 2 מציג תמונה של האגר הסרוק המכיל תאים שנצפו וגודלו בתרבית בטמפרטורת גידול מתירנית של 37°C ו-43.5°C, בהתאמה. בצד ימין של איור 2, רכיבי הכתם המערבי שנכרתו מייצגים את הביטוי של DnaK, KPf ו-KPf-V436F בתאי E. coli dnaK756. כצפוי, כל תאי E. coli dnaK756 בתרבית בטמפרטורת גידול מת...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Exploring Heat Shock Proteins in Malaria and Tuberculosis Infections at JoVE.com

פרוטוקול זה מדגים את פעילות המלווה של חלבון הלם חום 70 (Hsp70). תאי E. coli dnaK756 משמשים כמודל לבדיקה מכיוון שהם מכילים Hsp70 ילידי ולקוי תפקודית, מה שהופך אותם רגישים ללחץ חום. המבוא ההטרולוגי של Hsp70 פונקציונלי מציל את חוסר הצמיחה של התאים.

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. ...

אני חוקר את תפקידם של חלבוני הלם חום בהענקת הגנה סטטית עתידית לאנטיגנים הגורמים לזיהומים אנושיים כמו מלריה ושחפת. המחקר שלי מתמקד בעיקר במבנה ובתכונות התפקוד של מנגנון חלבון הלם החום של הפתוגנים האלה שגורמים לזיהומים בבני אדם. חלבוני מכת חום הם בדרך כלל קונספטואליים מאוד, עם זאת, הם מציגים רמה מסוימת של התמחות פונקציונלית.בנוסף, הם מעורבים עמידים לסמים. ככאלה, ישנם מאמצים מתמשכים לכוון אותם לקראת היפוך עמידות לתרופות במודלים שונים של מחלות. הם כוללים ביוכימיה, ביופיזיקה, ביואינפורמטיקה וטכניקות ביולוגיות של התא.במילים אחרות, תחומים שונים של טכניקות משמשים כדי ללמוד את התפקידים של חלבונים אלה. במקרה שלנו, המחקר של חלבונים של פלסמודיום היה הסוכן העיקרי של מלריה וכי הם קשים לייצר וזה מגביל את היכולת ללמוד חלבונים אלה. לדוגמה, קשה לייצר רמות מספיקות כדי לגבש ולדמיין את החלבונים.הקמנו חלק מהרשתות הפונקציונליות של חלבונים אלה בטפיל המלריה. הקמנו גם בדיקות כדי לחקור את התרכובות המכוונות לחלבונים אלה בגורמים הגורמים למלריה ולשחפת. הפרוטוקול הנוכחי משמש כדי לחקור את תפקיד קיפול חלבון המלווה ולאחר מכן את הפונקציה cytoprotective של HSP 70 באמצעות שווה כמודל. ניתן לאמץ את הפרוטוקול גם לסינון מעכבי מולקולות קטנות המכוונות לחלבון 70.

escherichia-coli-based-complementation-assay-to-study-chaperone

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Escherichia coli -Based Complementation Assay to Study the Chaperone Function of Heat Shock Protein 70

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. While Hsp70 is not essential for E. coli cells growing under normal conditions, this chaperone becomes indispensable for growth at elevated temperatures. Since Hsp70 is highly conserved, one way to study the chaperone function of Hsp70&#160;genes from various species is to heterologously express them in E. coli strains that are either deficient in Hsp70 or express a native Hsp70 that is functionally compromised. E. coli dnaK756&#160;cells are unable to support &#955; bacteriophage DNA. Furthermore, their native Hsp70 (DnaK) exhibits elevated ATPase activity while demonstrating reduced affinity for GrpE (Hsp70 nucleotide exchange factor). As a result, E. coli dnaK756&#160;cells grow adequately at temperatures ranging from 30 &#176;C to 37 &#176;C, but they die at elevated temperatures (&#62;40 &#176;C). For this reason, these cells serve as a model for studying the chaperone activity of Hsp70. Here, we describe a detailed protocol for the application of these cells to conduct a complementation assay, enabling the study of the in cellulo chaperone function of Hsp70.

This protocol demonstrates the chaperone activity of heat shock protein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756 cells serve as a model for the assay as they harbor a native, functionally impaired Hsp70, making them susceptible to heat stress. The heterologous introduction of functional Hsp70 rescues the growth deficiency of the cells.