Name: Autor em destaque: Explorando proteínas de choque térmico em infecções por malária e tuberculose
Uploaded: 2024-03-08T14:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Exploring Heat Shock Proteins in Malaria and Tuberculosis Infections at JoVE.com

O trabalho foi apoiado com financiamento obtido do International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB) grant number, HDI/CRP/012, Research Directorate of the University of Venda, grant I595, Department of Science and Innovation (DSI) e da National Research Foundation (NRF) da África do Sul (grant numbers, 75464 & 92598) concedido à AS.

1. Transformação
OBS: Utilize vidraria estéril para cultura, ponteiras de pipeta e meios recém-preparados e autoclavados. Preparar culturas das células de E. coli em ágar 2x triptona de levedura (YT) [1,6% triptona (p/v), 1% extrato de levedura (p/v), 0,5% NaCl (p/v), 1,5% ágar (p/v)]. Os reagentes gerais utilizados no protocolo e suas fontes são fornecidos na Tabela de Materiais.
<ol><li>Rotular tubos de microcentrífuga de 2,0 mL e alíquo...

Avaliação da atividade da chaperona Hsp70 usando células Escherichia coli dnaK756

<ol>
	<li>Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+newly+synthesized+proteins+into+shape.">Getting newly synthesized proteins into shape.</a> Cell. 101 (2), 119-122 (2000).</li><li>Shonhai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodial+heat+shock+proteins:+targets+for+chemotherapy.">Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy.</a> FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).</li><li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins:+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB.">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li><li>Edkins, A. L., Boshoff, A., Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+structural+and+functional+features+of+molecular+chaperones.+Heat+shock+proteins+of+malaria.">General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria.</a> Adv Exp Med Biol. , (2021).</li><li>Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+conformation+of+wild-type+E.+coli.+Hsp70+(DnaK)+chaperone+complexed+with+ADP+and+substrate.">Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate.</a> PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).</li><li>Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+heat+shock+protein+70+is+able+to+suppress+the+thermosensitivity+of+an+Escherichia+coli+DnaK+mutant+strain.">Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain.</a> Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).</li><li>Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+study+of+a+Plasmodium+falciparum+Hsp70+using+three-dimensional+modelling+and+in+vitro+analyses.">Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses.</a> Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).</li><li>Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -. R., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+modulation+of+plasmodial+Hsp70s+by+small+molecules+with+antimalarial+activity.">Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity.</a> Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).</li><li>Makhoba, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+chimeric+Hsp70+to+enhance+the+quality+of+recombinant+Plasmodium+falciparum+s-adenosylmethionine+decarboxylase+protein+produced+in+Escherichia+coli.">Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli.</a> PLoS One. 11 (3), 0152626 (2016).</li><li>Bukau, B., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+defects+caused+by+deletion+of+the+Escherichia+coli+dnaK+gene+indicate+roles+for+heat+shock+protein+in+normal+metabolism.">Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism.</a> J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).</li><li>Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaK+protein+alleviates+toxicity+induced+by+citrate-coated+gold+nanoparticles+in+Escherichia+coli.">DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli.</a> PLoS One. 10 (4), 0121243 (2015).</li><li>Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Escherichia+coli+heat+shock+proteins+DnaK+and+HtpG+(C62.+5)+in+response+to+nutritional+deprivation.">Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation.</a> J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).</li><li>Mayer, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistep+mechanism+of+substrate+binding+determines+chaperone+activity+of+Hsp70.">Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70.</a> Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).</li><li>Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+bacterial+gene+(groP+C)+which+affects+&#955;+DNA+replication.">A new bacterial gene (groP C) which affects &#955; DNA replication.</a> Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).</li><li>Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dnaK+protein+modulates+the+heat-shock+response+of+Escherichia+coli.">The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli.</a> Cell. 34 (2), 641-646 (1983).</li><li>Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+defects+of+the+DnaK756+mutant+chaperone+of+Escherichia+coli+indicate+distinct+roles+for+amino-and+carboxyl-terminal+residues+in+substrate+and+co-chaperone+interaction+and+interdomain+communication.">Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication.</a> J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).</li><li>Taj, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+as+a+model+organism.">Escherichia coli as a model organism.</a> Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).</li><li>Sato, S., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+cochaperonins+in+apicomplexan+parasites.">Organelle-specific cochaperonins in apicomplexan parasites.</a> Mol Biochem Parasitol. 141 (2), 133-143 (2005).</li><li>Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University Available from: <a target="_blank" href="https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University">https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University</a> (2007)</li><li>Makumire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+GGMP+repeat+segments+of+Plasmodium+falciparum+Hsp70-1+compromises+chaperone+function+and+Hop+co-chaperone+binding.">Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding.</a> Int J Mol Sci. 22 (4), 2226 (2021).</li><li>Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+Hsp70+family+proteins:+Expanding+the+chaperone+code.">Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code.</a> J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).</li><li>Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+functionality+of+non-native+Hsp70+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Bio Protoc. 9 (19), e3389 (2019).</li></ol>

O protocolo demonstra a utilidade das células dnaK756 de E. colina exploração da função chaperona de Hsp70 heterologamente expressa. Este ensaio pode ser adotado para rastrear inibidores visando a função de Hsp70 em celulose. No entanto, uma limitação deste método é que Hsp70s incapazes de substituir DnaK em E. coli não são compatíveis com este ensaio. A falta de modificação pós-traducional21 de algumas Hsp70s não-nativas pode explicar sua falta de fun?...

As proteínas de choque térmico desempenham um papel importante como chaperonas moleculares, facilitando o enovelamento de proteínas, prevenindo a agregação proteica e revertendo o mau enovelamento de proteínas 1,2. A proteína de choque térmico 70 (Hsp70) é uma das chaperonas moleculares mais proeminentes, desempenhando um papel central na homeostase proteica 3,4. DnaK é o homólogo 5 de E. coli Hsp70.
Vários ensaios biofísicos, bioquímicos e baseados em células foram desenvolvidos para explorar a atividade de chaperona de Hsp70 e rastrear inibidores direcionados a essa chaperona 6,7,8. Hsp70 é uma proteína altamente conservada. Por essa razão, vários Hsp70s de organismos eucarióticos, como o Plasmodium falciparum (o principal agente da malária), têm sido relatados para substituir a função DnaK em E. coli 6,9. Desta forma, um ensaio de complementação baseado em E. coli foi desenvolvido envolvendo a expressão heteróloga de Hsp70s em E. coli para explorar sua função citoprotetora. Normalmente, este ensaio envolve a utilização de células de E. coli que são deficientes para DnaK ou que expressam um DnaK nativo que está funcionalmente comprometido. Embora a DnaK não seja essencial para o crescimento de E. coli em condições normais, ela se torna essencial quando as células são cultivadas sob condições estressantes, como temperaturas elevadas ou outras formas de estresse10,11.
Cepas de E. coli que foram desenvolvidas para estudar a função Hsp70 usando um ensaio de complementação incluem E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) e E. coli dnaK756. As células dnaK103 de E. coli produzem um DnaK truncado que não é funcional e, como tal, as células crescem adequadamente a 30 °C, enquanto a cepa é sensível ao estresse térmico e ao frio12,13. Da mesma forma, a cepa de E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) não cresce acima de 40 °C14,15. A cepa de E. coli dnaK756 expressa um DnaK nativo mutante (DnaK756) caracterizado por três substituições de glicina para aspartato nas posições 32, 455 e 468, dando origem a resultados proteostáticos comprometidos. Consequentemente, essa cepa é resistente ao DNA λ do bacteriófago14. Além disso, E. coli dnaK756 exibe elevada atividade da ATPase, enquanto sua afinidade pelo fator de troca de nucleotídeos, GrpE, é reduzida16. E. coli Linhagens mutantes de DnaK servem como modelos ideais para investigar a atividade de chaperona de Hsp70 através de uma abordagem de complementação. Como a DnaK só é essencial sob condições estressantes, o ensaio de complementação é tipicamente conduzido em temperaturas elevadas (Figura 1). Algumas vantagens do uso de E. coli para este estudo incluem seu genoma bem caracterizado, crescimento rápido e baixo custo de cultivo e manutenção17.
Neste artigo, descrevemos em detalhes um protocolo envolvendo o uso de células de E. coli dnaK756 para estudar a função da Hsp70. As Hsp70s que empregamos no ensaio são DnaK selvagens e seu derivado quimérico, KPf (composto pelo domínio ATPase da DnaK fundido ao domínio C-terminal de ligação ao substrato C-terminal Hsp70-1 6,18). O KPf-V436F foi heterologamente expresso como um controle negativo, uma vez que a mutação essencialmente o bloqueia de substratos de ligação, revogando assim sua atividade de chaperona9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8,05,740</td>
			<td>Constituent for sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Labchem</td>
			<td>101005125</td>
			<td>Constituent of destainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8008300100</td>
			<td>Component of SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HG000BX1.500</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Clever Scientific</td>
			<td>14131031</td>
			<td>Certified molecular biology agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>101875295</td>
			<td>Constituent for SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>0339&#8212;EU&#8212;25G</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>1015460100</td>
			<td>Component of SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>0449-25G</td>
			<td>Constituent for sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>For competent cells preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>443293X</td>
			<td>SDS-PAGE dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RB10368</td>
			<td>Constituent of PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>32109</td>
			<td>Western blot detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>17898</td>
			<td>DNA intercalating dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR2676520L</td>
			<td>Constituent for sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10119CU</td>
			<td>Component of SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Glentham life sciences</td>
			<td>162IL</td>
			<td>inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Melford</td>
			<td>K0126</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR4123000EM</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Labchem</td>
			<td>113140129</td>
			<td>Constituent of destainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,04,87,30,250</td>
			<td>Constituent of PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HG000BX4.250</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR5042020EM</td>
			<td>Constituent of PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Thermofischer scientific</td>
			<td>PB7320</td>
			<td>Western blot membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR5822320EM</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>108073</td>
			<td>To resolve expressed proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax iD3</td>
			<td>Separations</td>
			<td>373705019</td>
			<td>Automated plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>ACRO420580500</td>
			<td>Component of SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Duchefa Biochemies</td>
			<td>T0150.0025</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>19A094101</td>
			<td>Component of SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR3164500XF</td>
			<td>Constituent for Western wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western transfer chamber</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>PB0112</td>
			<td>Transfer of protein to nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HG000BX6.500</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-DnaK antibody</td>
			<td>Inqaba</td>
			<td>BK CAC09317</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-rabbit antibody</td>
			<td>Thermofischer scientific</td>
			<td>31460</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

escherichia coli -based complementation assay to study the chaperone function of heat shock protein 70

A proteína de choque térmico 70 (Hsp70) é uma proteína conservada que facilita o enovelamento de outras proteínas dentro da célula, tornando-a uma chaperona molecular. Enquanto Hsp70 não é essencial para células de E. coli crescendo em condições normais, esta chaperona torna-se indispensável para o crescimento em temperaturas elevadas. Uma vez que a Hsp70 é altamente conservada, uma maneira de estudar a função de chaperona de genes de Hsp70 de várias espécies é expressá-los heterologamente em cepas de E. coli que são deficientes em Hsp70 ou expressam uma Hsp70 nativa que está funcionalmente comprometida. As células de E. coli dnaK756 são incapazes de suportar o DNA do bacteriófago λ. Além disso, sua Hsp70 nativa (DnaK) exibe atividade ATPase elevada, enquanto demonstra afinidade reduzida por GrpE (fator de troca de nucleotídeos Hsp70). Como resultado, as células de E. coli dnaK756 crescem adequadamente em temperaturas que variam de 30 °C a 37 °C, mas morrem em temperaturas elevadas (>40 °C). Por esta razão, essas células servem de modelo para o estudo da atividade de chaperona da Hsp70. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a aplicação dessas células na realização de um ensaio de complementação, possibilitando o estudo da função da chaperona in cellulo da Hsp70.

Heat shock proteins play an important role as molecular chaperones by facilitating protein folding, preventing protein aggregation, and reversing protein misfolding1,2. Heat shock protein 70 (Hsp70) is one of the most prominent molecular chaperones, playing a central role in protein homeostasis3,4. DnaK is the E. coli Hsp70 homologue5.
Various biophysical, biochemical, and cell-based assays have been developed to explore the chaperone activity of Hsp70 and to screen for inhibitors targeting this chaperone6,7,8. Hsp70 is a highly conserved protein. For this reason, several Hsp70s of eukaryotic organisms, such as Plasmodium falciparum (the main agent of malaria), have been reported to substitute for DnaK function in E. coli6,9. In this way, an E. coli-based complementation assay has been developed involving the heterologous expression of Hsp70s in E. coli to explore their cytoprotective function. Typically, this assay involves the utilization of E. coli cells that are either deficient for DnaK or that express a native DnaK that is functionally compromised. While DnaK is not essential for E. coli growth under normal conditions, it becomes essential when the cells are grown under stressful conditions such as elevated temperatures or other forms of stress10,11.
E. coli strains that have been developed to study Hsp70 function using a complementation assay include E. coli dnaK103&#160;(BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) and E. coli dnaK756. E. coli dnaK103&#160;cells produce a truncated DnaK that is non-functional, and as such, the cells grow adequately at 30 &#176;C, while the strain is sensitive to cold and heat stress12,13. Similarly, the E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756&#160;recA::TcR Pdm1,1) strain does not grow above 40 &#176;C14,15. The E. coli dnaK756&#160;strain expresses a mutant native DnaK (DnaK756) characterized by three glycine-to-aspartate substitutions at positions 32, 455, and 468, giving rise to compromised proteostatic outcomes. Consequently, this strain is resistant to bacteriophage &#955; DNA14. Additionally, E. coli&#160;dnaK756 exhibits elevated ATPase activity, while its affinity for the nucleotide exchange factor, GrpE, is reduced16. E. coli DnaK mutant strains serve as ideal models for investigating the chaperone activity of Hsp70 through a complementation approach. Since DnaK is only essential under stressful conditions, the complementation assay is typically conducted at elevated temperatures (Figure 1). Some advantages of using E. coli for this study include its well-characterized genome, rapid growth, and the low cost of culturing and maintenance17.
In this article, we describe in detail a protocol involving the use of E. coli dnaK756&#160;cells to study the function of Hsp70. The Hsp70s we employed in the assay are wild-type DnaK and its chimeric derivative, KPf (made up of the ATPase domain of DnaK fused to the C-terminal substrate-binding domain of Plasmodium falciparum Hsp70-16,18). KPf-V436F was heterologously expressed as a negative control since the mutation essentially blocks it from binding substrates, thus abrogating its chaperone activity9.

Autor em destaque: Explorando proteínas de choque térmico em infecções por malária e tuberculose

Ensaio de Complementação Baseado em Escherichia coli para Estudo da Função Chaperone da Proteína de Choque Térmico 70

I study the role of heat shock proteins in conferring future static protection to antigens that cause human infections such as malaria and tuberculosis. My research essentially focuses on the structure and function features of the heat shock protein machinery of these pathogens that cause human infections. Heatstroke proteins are generally highly concept, however, they display some level of functional specialization.In addition, they are implicated in drug resistant. As such, there are ongoing efforts to target them towards reversing drug resistance in various disease models. They include biochemical, biophysical, bioinformatics, and cell biologic techniques.In other words, various areas of techniques are used to study the roles of these proteins. In our case, the study of proteins of Plasmodium was the main agent of malaria and that they are difficult to produce and this limits the capability to study these proteins. For example, it is difficult to generate sufficient levels to crystallize and image the proteins.We have established some of the functional networks of these proteins in the malaria parasite. We have also established assays to study the compounds targeting these proteins in agents causing malaria and TB.The current protocol is used to explore the chaperone protein folding role and then cytoprotective function of HSP 70 using equal as a model. The protocol could also be adopted for screening small molecule inhibitors targeting protein 70.

A Figura 2 apresenta a imagem do ágar escaneado contendo células que foram manchadas e cultivadas à temperatura permissiva de crescimento de 37 °C e 43,5 °C, respectivamente. No lado direito da Figura 2, os componentes do western blot excisados representam a expressão de DnaK, KPf e KPf-V436F em células de E. coli dnaK756. Como esperado, todas as células de E. coli dnaK756 cultivadas à temperatura permissiva de crescimento de 37 °C co...

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Este protocolo demonstra a atividade de chaperona da proteína de choque térmico 70 (Hsp70). As células de E. coli dnaK756 servem de modelo para o ensaio, pois abrigam uma Hsp70 nativa funcionalmente prejudicada, tornando-as suscetíveis ao estresse térmico. A introdução heteróloga de Hsp70 funcional resgata a deficiência de crescimento das células.

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. ...

Estudo o papel das proteínas de choque térmico na conferição de proteção estática futura a antígenos causadores de infecções humanas, como malária e tuberculose. Minha pesquisa se concentra essencialmente nas características de estrutura e função da maquinaria de proteínas de choque térmico desses patógenos que causam infecções humanas. As proteínas de insolação são geralmente altamente conceituais, no entanto, apresentam algum nível de especialização funcional.Além disso, eles estão implicados em drogas resistentes. Como tal, há esforços contínuos para direcioná-los para reverter a resistência aos medicamentos em vários modelos de doenças. Eles incluem técnicas bioquímicas, biofísicas, bioinformática e biológicas celulares.Em outras palavras, várias áreas de técnicas são usadas para estudar os papéis dessas proteínas. No nosso caso, o estudo de proteínas do Plasmodium foi o principal agente da malária e que elas são de difícil produção e isso limita a capacidade de estudar essas proteínas. Por exemplo, é difícil gerar níveis suficientes para cristalizar e obter imagens das proteínas.Estabelecemos algumas das redes funcionais dessas proteínas no parasita da malária. Também estabelecemos ensaios para estudar os compostos que têm como alvo essas proteínas em agentes causadores de malária e TB. O protocolo atual é usado para explorar o papel de dobramento da proteína chaperona e, em seguida, a função citoprotetora da HSP 70 usando igual como modelo. O protocolo também pode ser adotado para a triagem de inibidores de pequenas moléculas visando a proteína 70.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Escherichia coli -Based Complementation Assay to Study the Chaperone Function of Heat Shock Protein 70

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. While Hsp70 is not essential for E. coli cells growing under normal conditions, this chaperone becomes indispensable for growth at elevated temperatures. Since Hsp70 is highly conserved, one way to study the chaperone function of Hsp70&#160;genes from various species is to heterologously express them in E. coli strains that are either deficient in Hsp70 or express a native Hsp70 that is functionally compromised. E. coli dnaK756&#160;cells are unable to support &#955; bacteriophage DNA. Furthermore, their native Hsp70 (DnaK) exhibits elevated ATPase activity while demonstrating reduced affinity for GrpE (Hsp70 nucleotide exchange factor). As a result, E. coli dnaK756&#160;cells grow adequately at temperatures ranging from 30 &#176;C to 37 &#176;C, but they die at elevated temperatures (&#62;40 &#176;C). For this reason, these cells serve as a model for studying the chaperone activity of Hsp70. Here, we describe a detailed protocol for the application of these cells to conduct a complementation assay, enabling the study of the in cellulo chaperone function of Hsp70.

This protocol demonstrates the chaperone activity of heat shock protein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756 cells serve as a model for the assay as they harbor a native, functionally impaired Hsp70, making them susceptible to heat stress. The heterologous introduction of functional Hsp70 rescues the growth deficiency of the cells.