Name: Författare i fokus: Utforska värmechockproteiner vid malaria- och tuberkulosinfektioner
Uploaded: 2024-03-08T14:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Exploring Heat Shock Proteins in Malaria and Tuberculosis Infections at JoVE.com

Arbetet finansierades med anslag från International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB) anslagsnummer, HDI/CRP/012, Research Directorate of the University of Venda, anslag I595, Department of Science and Innovation (DSI) och National Research Foundation (NRF) i Sydafrika (anslagsnummer, 75464 och 92598) som tilldelats AS.

1. Omvandling
OBS: Använd sterila glas för odling, pipettspetsar och nyberedda och autoklaverade medier. Förbered kulturer av E. coli-cellerna i 2x jästrypton (YT) [1,6 % trypton (vikt/volym), 1 % jästextrakt (vikt/volym), 0,5 % NaCl (vikt/volym), 1,5 % agar (vikt/volym)] agar. Allmänna reagenser som används i protokollet och deras källor finns i materialförteckningen.
<ol><li>Märk 2,0 ml mikrocentrifugrör och alikvot 50 μL kompetenta <e...

Bedömning av Hsp70 chaperonaktivitet med hjälp av Escherichia coli dnaK756-celler

<ol>
	<li>Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+newly+synthesized+proteins+into+shape.">Getting newly synthesized proteins into shape.</a> Cell. 101 (2), 119-122 (2000).</li><li>Shonhai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodial+heat+shock+proteins:+targets+for+chemotherapy.">Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy.</a> FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).</li><li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins:+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB.">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li><li>Edkins, A. L., Boshoff, A., Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+structural+and+functional+features+of+molecular+chaperones.+Heat+shock+proteins+of+malaria.">General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria.</a> Adv Exp Med Biol. , (2021).</li><li>Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+conformation+of+wild-type+E.+coli.+Hsp70+(DnaK)+chaperone+complexed+with+ADP+and+substrate.">Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate.</a> PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).</li><li>Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+heat+shock+protein+70+is+able+to+suppress+the+thermosensitivity+of+an+Escherichia+coli+DnaK+mutant+strain.">Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain.</a> Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).</li><li>Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+study+of+a+Plasmodium+falciparum+Hsp70+using+three-dimensional+modelling+and+in+vitro+analyses.">Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses.</a> Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).</li><li>Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -. R., Blatch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+modulation+of+plasmodial+Hsp70s+by+small+molecules+with+antimalarial+activity.">Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity.</a> Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).</li><li>Makhoba, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+chimeric+Hsp70+to+enhance+the+quality+of+recombinant+Plasmodium+falciparum+s-adenosylmethionine+decarboxylase+protein+produced+in+Escherichia+coli.">Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli.</a> PLoS One. 11 (3), 0152626 (2016).</li><li>Bukau, B., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+defects+caused+by+deletion+of+the+Escherichia+coli+dnaK+gene+indicate+roles+for+heat+shock+protein+in+normal+metabolism.">Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism.</a> J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).</li><li>Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaK+protein+alleviates+toxicity+induced+by+citrate-coated+gold+nanoparticles+in+Escherichia+coli.">DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli.</a> PLoS One. 10 (4), 0121243 (2015).</li><li>Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Escherichia+coli+heat+shock+proteins+DnaK+and+HtpG+(C62.+5)+in+response+to+nutritional+deprivation.">Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation.</a> J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).</li><li>Mayer, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistep+mechanism+of+substrate+binding+determines+chaperone+activity+of+Hsp70.">Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70.</a> Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).</li><li>Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+bacterial+gene+(groP+C)+which+affects+&#955;+DNA+replication.">A new bacterial gene (groP C) which affects &#955; DNA replication.</a> Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).</li><li>Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dnaK+protein+modulates+the+heat-shock+response+of+Escherichia+coli.">The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli.</a> Cell. 34 (2), 641-646 (1983).</li><li>Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+defects+of+the+DnaK756+mutant+chaperone+of+Escherichia+coli+indicate+distinct+roles+for+amino-and+carboxyl-terminal+residues+in+substrate+and+co-chaperone+interaction+and+interdomain+communication.">Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication.</a> J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).</li><li>Taj, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+as+a+model+organism.">Escherichia coli as a model organism.</a> Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).</li><li>Sato, S., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle-specific+cochaperonins+in+apicomplexan+parasites.">Organelle-specific cochaperonins in apicomplexan parasites.</a> Mol Biochem Parasitol. 141 (2), 133-143 (2005).</li><li>Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University Available from: <a target="_blank" href="https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University">https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University</a> (2007)</li><li>Makumire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+of+GGMP+repeat+segments+of+Plasmodium+falciparum+Hsp70-1+compromises+chaperone+function+and+Hop+co-chaperone+binding.">Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding.</a> Int J Mol Sci. 22 (4), 2226 (2021).</li><li>Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+Hsp70+family+proteins:+Expanding+the+chaperone+code.">Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code.</a> J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).</li><li>Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+the+functionality+of+non-native+Hsp70+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Bio Protoc. 9 (19), e3389 (2019).</li></ol>

Protokollet visar användbarheten av E. coli dnaK756-cellerför att utforska chaperonfunktionen hos heterologt uttryckt Hsp70. Denna analys kan användas för att screena hämmare som riktar sig mot Hsp70-funktionen i cellulo. En begränsning med denna metod är dock att Hsp70 som inte kan ersätta DnaK i E. coli inte är kompatibla med denna analys. Brist på posttranslationell modifiering21 av vissa icke-nativa Hsp70 kan förklara deras brist på funktion inom E. c...

Värmechockproteiner spelar en viktig roll som molekylära chaperoner genom att underlätta proteinveckning, förhindra proteinaggregering och vända felveckningav proteiner 1,2. Värmechockprotein 70 (Hsp70) är en av de mest framträdande molekylära chaperoner, som spelar en central roll i proteinhomeostas 3,4. DnaK är E. coli Hsp70-homolog5.
Olika biofysiska, biokemiska och cellbaserade analyser har utvecklats för att utforska chaperonaktiviteten hos Hsp70 och för att screena för hämmare riktade mot detta chaperon 6,7,8. Hsp70 är ett mycket konserverat protein. Av denna anledning har flera Hsp70 av eukaryota organismer, såsom Plasmodium falciparum (malarians huvudämne), rapporterats ersätta DnaK-funktionen i E. coli 6,9. På detta sätt har en E. coli-baserad komplementeringsanalys utvecklats som involverar det heterologa uttrycket av Hsp70 i E. coli för att utforska deras cytoprotektiva funktion. Vanligtvis innebär denna analys användning av E. coli-celler som antingen har brist på DnaK eller som uttrycker en naturlig DnaK som är funktionellt komprometterad. Även om DnaK inte är nödvändigt för E. coli-tillväxt under normala förhållanden, blir det viktigt när cellerna odlas under stressiga förhållanden som förhöjda temperaturer eller andra former av stress10,11.
E. coli-stammar som har utvecklats för att studera Hsp70-funktionen med hjälp av en komplementeringsanalys inkluderar E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) och E. coli dnaK756. E. coli dnaK103-celler producerar en trunkerad DnaK som är icke-funktionell, och som sådan växer cellerna tillräckligt vid 30 °C, medan stammen är känslig för kyla och värmestress 12,13. På samma sätt växer inte stammen E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) över 40 °C14,15. E. coli dnaK756-stammen uttrycker en muterad naturlig DnaK (DnaK756) som kännetecknas av tre glycin-till-aspartat-substitutioner vid positionerna 32, 455 och 468, vilket ger upphov till komprometterade proteostatiska resultat. Följaktligen är denna stam resistent mot bakteriofag λ DNA14. Dessutom uppvisar E. coli dnaK756 förhöjd ATPas-aktivitet, medan dess affinitet för nukleotidutbytesfaktorn, GrpE, är reducerad16. E. coli DnaK-mutantstammar fungerar som idealiska modeller för att undersöka chaperonaktiviteten hos Hsp70 genom en komplementeringsmetod. Eftersom DnaK endast är essentiellt under stressiga förhållanden utförs komplementeringsanalysen vanligtvis vid förhöjda temperaturer (figur 1). Några fördelar med att använda E. coli för denna studie inkluderar dess välkarakteriserade genom, snabba tillväxt och den låga kostnaden för odling och underhåll17.
I den här artikeln beskriver vi i detalj ett protokoll som involverar användning av E. coli dnaK756-celler för att studera funktionen hos Hsp70. De Hsp70 som vi använde i analysen är vildtyps-DnaK och dess chimära derivat, KPf (som består av ATPas-domänen av DnaK fusionerad med den C-terminala substratbindande domänen av Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18). KPf-V436F uttrycktes heterologiskt som en negativ kontroll eftersom mutationen i huvudsak blockerar den från att binda substrat, vilket upphäver dess chaperonaktivitet9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8,05,740</td>
			<td>Constituent for sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Labchem</td>
			<td>101005125</td>
			<td>Constituent of destainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8008300100</td>
			<td>Component of SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HG000BX1.500</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Clever Scientific</td>
			<td>14131031</td>
			<td>Certified molecular biology agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>101875295</td>
			<td>Constituent for SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>0339&#8212;EU&#8212;25G</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>1015460100</td>
			<td>Component of SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>0449-25G</td>
			<td>Constituent for sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>For competent cells preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>443293X</td>
			<td>SDS-PAGE dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RB10368</td>
			<td>Constituent of PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>32109</td>
			<td>Western blot detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td>17898</td>
			<td>DNA intercalating dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR2676520L</td>
			<td>Constituent for sample loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>10119CU</td>
			<td>Component of SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Glentham life sciences</td>
			<td>162IL</td>
			<td>inducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Melford</td>
			<td>K0126</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR4123000EM</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Labchem</td>
			<td>113140129</td>
			<td>Constituent of destainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1,04,87,30,250</td>
			<td>Constituent of PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HG000BX4.250</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR5042020EM</td>
			<td>Constituent of PBS buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Thermofischer scientific</td>
			<td>PB7320</td>
			<td>Western blot membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR5822320EM</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulphate</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>108073</td>
			<td>To resolve expressed proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectramax iD3</td>
			<td>Separations</td>
			<td>373705019</td>
			<td>Automated plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>ACRO420580500</td>
			<td>Component of SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Duchefa Biochemies</td>
			<td>T0150.0025</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>19A094101</td>
			<td>Component of SDS gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Merck</td>
			<td>SAAR3164500XF</td>
			<td>Constituent for Western wash buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western transfer chamber</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>PB0112</td>
			<td>Transfer of protein to nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>HG000BX6.500</td>
			<td>Constituent of medium and liquid growth assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-DnaK antibody</td>
			<td>Inqaba</td>
			<td>BK CAC09317</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-rabbit antibody</td>
			<td>Thermofischer scientific</td>
			<td>31460</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

escherichia coli -based complementation assay to study the chaperone function of heat shock protein 70

Heat shock protein 70 (Hsp70) är ett konserverat protein som underlättar veckningen av andra proteiner i cellen, vilket gör det till en molekylär chaperon. Även om Hsp70 inte är nödvändigt för E. coli-celler som växer under normala förhållanden, blir detta chaperon oumbärligt för tillväxt vid förhöjda temperaturer. Eftersom Hsp70 är mycket konserverat är ett sätt att studera chaperonfunktionen hos Hsp70-gener från olika arter att heterologiskt uttrycka dem i E. coli-stammar som antingen har brist på Hsp70 eller uttrycker en naturlig Hsp70 som är funktionellt komprometterad. E. coli dnaK756-celler kan inte stödja λ bakteriofag DNA. Dessutom uppvisar deras naturliga Hsp70 (DnaK) förhöjd ATPas-aktivitet samtidigt som de visar minskad affinitet för GrpE (Hsp70 nukleotidutbytesfaktor). Som ett resultat växer E. coli dnaK756-celler tillräckligt vid temperaturer från 30 °C till 37 °C, men de dör vid förhöjda temperaturer (>40 °C). Av denna anledning fungerar dessa celler som en modell för att studera chaperonaktiviteten hos Hsp70. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för applicering av dessa celler för att genomföra en komplementeringsanalys, vilket möjliggör studier av in cellulo chaperonfunktionen hos Hsp70.

Heat shock proteins play an important role as molecular chaperones by facilitating protein folding, preventing protein aggregation, and reversing protein misfolding1,2. Heat shock protein 70 (Hsp70) is one of the most prominent molecular chaperones, playing a central role in protein homeostasis3,4. DnaK is the E. coli Hsp70 homologue5.
Various biophysical, biochemical, and cell-based assays have been developed to explore the chaperone activity of Hsp70 and to screen for inhibitors targeting this chaperone6,7,8. Hsp70 is a highly conserved protein. For this reason, several Hsp70s of eukaryotic organisms, such as Plasmodium falciparum (the main agent of malaria), have been reported to substitute for DnaK function in E. coli6,9. In this way, an E. coli-based complementation assay has been developed involving the heterologous expression of Hsp70s in E. coli to explore their cytoprotective function. Typically, this assay involves the utilization of E. coli cells that are either deficient for DnaK or that express a native DnaK that is functionally compromised. While DnaK is not essential for E. coli growth under normal conditions, it becomes essential when the cells are grown under stressful conditions such as elevated temperatures or other forms of stress10,11.
E. coli strains that have been developed to study Hsp70 function using a complementation assay include E. coli dnaK103&#160;(BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) and E. coli dnaK756. E. coli dnaK103&#160;cells produce a truncated DnaK that is non-functional, and as such, the cells grow adequately at 30 &#176;C, while the strain is sensitive to cold and heat stress12,13. Similarly, the E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756&#160;recA::TcR Pdm1,1) strain does not grow above 40 &#176;C14,15. The E. coli dnaK756&#160;strain expresses a mutant native DnaK (DnaK756) characterized by three glycine-to-aspartate substitutions at positions 32, 455, and 468, giving rise to compromised proteostatic outcomes. Consequently, this strain is resistant to bacteriophage &#955; DNA14. Additionally, E. coli&#160;dnaK756 exhibits elevated ATPase activity, while its affinity for the nucleotide exchange factor, GrpE, is reduced16. E. coli DnaK mutant strains serve as ideal models for investigating the chaperone activity of Hsp70 through a complementation approach. Since DnaK is only essential under stressful conditions, the complementation assay is typically conducted at elevated temperatures (Figure 1). Some advantages of using E. coli for this study include its well-characterized genome, rapid growth, and the low cost of culturing and maintenance17.
In this article, we describe in detail a protocol involving the use of E. coli dnaK756&#160;cells to study the function of Hsp70. The Hsp70s we employed in the assay are wild-type DnaK and its chimeric derivative, KPf (made up of the ATPase domain of DnaK fused to the C-terminal substrate-binding domain of Plasmodium falciparum Hsp70-16,18). KPf-V436F was heterologously expressed as a negative control since the mutation essentially blocks it from binding substrates, thus abrogating its chaperone activity9.

Författare i fokus: Utforska värmechockproteiner vid malaria- och tuberkulosinfektioner

Escherichia coli-baserad komplementeringsanalys för att studera chaperonfunktionen hos värmechockprotein 70

I study the role of heat shock proteins in conferring future static protection to antigens that cause human infections such as malaria and tuberculosis. My research essentially focuses on the structure and function features of the heat shock protein machinery of these pathogens that cause human infections. Heatstroke proteins are generally highly concept, however, they display some level of functional specialization.In addition, they are implicated in drug resistant. As such, there are ongoing efforts to target them towards reversing drug resistance in various disease models. They include biochemical, biophysical, bioinformatics, and cell biologic techniques.In other words, various areas of techniques are used to study the roles of these proteins. In our case, the study of proteins of Plasmodium was the main agent of malaria and that they are difficult to produce and this limits the capability to study these proteins. For example, it is difficult to generate sufficient levels to crystallize and image the proteins.We have established some of the functional networks of these proteins in the malaria parasite. We have also established assays to study the compounds targeting these proteins in agents causing malaria and TB.The current protocol is used to explore the chaperone protein folding role and then cytoprotective function of HSP 70 using equal as a model. The protocol could also be adopted for screening small molecule inhibitors targeting protein 70.

Figur 2 visar en bild av de skannade agarinnehållande celler som upptäcktes och odlades vid den tillåtna tillväxttemperaturen 37 °C respektive 43,5 °C. På höger sida av figur 2 representerar utskurna western blot-komponenter uttrycket av DnaK, KPf och KPf-V436F i E. coli dnaK756-celler. Som väntat lyckades alla E. coli dnaK756-celler som odlats vid den tillåtna tillväxttemperaturen 37 °C växa. Under de icke-tillåtande tillväxtbet...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Exploring Heat Shock Proteins in Malaria and Tuberculosis Infections at JoVE.com

Detta protokoll demonstrerar chaperonaktiviteten hos värmechockprotein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756-celler fungerar som en modell för analysen eftersom de har en infödd, funktionellt nedsatt Hsp70, vilket gör dem mottagliga för värmestress. Den heterologa introduktionen av funktionell Hsp70 räddar tillväxtbristen hos cellerna.

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. ...

Jag studerar värmechockproteiners roll för att ge framtida statiskt skydd till antigener som orsakar infektioner hos människor, såsom malaria och tuberkulos. Min forskning fokuserar i huvudsak på strukturen och funktionsegenskaperna hos värmechockproteinmaskineriet hos dessa patogener som orsakar infektioner hos människor. Värmeslagsproteiner är i allmänhet mycket konceptuella, men de uppvisar en viss nivå av funktionell specialisering.Dessutom är de inblandade i läkemedelsresistenta. Därför pågår arbetet med att rikta in sig på att vända läkemedelsresistens i olika sjukdomsmodeller. De inkluderar biokemiska, biofysiska, bioinformatiska och cellbiologiska tekniker.Med andra ord används olika teknikområden för att studera dessa proteiners roller. I vårt fall var studiet av proteiner av Plasmodium den huvudsakliga orsaken till malaria och att de är svåra att producera och detta begränsar möjligheten att studera dessa proteiner. Det är till exempel svårt att generera tillräckliga nivåer för att kristallisera och avbilda proteinerna.Vi har etablerat några av de funktionella nätverken av dessa proteiner i malariaparasiten. Vi har också etablerat analyser för att studera de substanser som riktar sig mot dessa proteiner i medel som orsakar malaria och tuberkulos. Det nuvarande protokollet används för att utforska chaperonproteinveckningsrollen och sedan cytoprotektiv funktion av HSP 70 med lika som modell. Protokollet skulle också kunna användas för screening av småmolekylära hämmare riktade mot protein 70.

escherichia-coli-based-complementation-assay-to-study-chaperone

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Escherichia coli -Based Complementation Assay to Study the Chaperone Function of Heat Shock Protein 70

Heat shock protein 70 (Hsp70) is a conserved protein that facilitates the folding of other proteins within the cell, making it a molecular chaperone. While Hsp70 is not essential for E. coli cells growing under normal conditions, this chaperone becomes indispensable for growth at elevated temperatures. Since Hsp70 is highly conserved, one way to study the chaperone function of Hsp70&#160;genes from various species is to heterologously express them in E. coli strains that are either deficient in Hsp70 or express a native Hsp70 that is functionally compromised. E. coli dnaK756&#160;cells are unable to support &#955; bacteriophage DNA. Furthermore, their native Hsp70 (DnaK) exhibits elevated ATPase activity while demonstrating reduced affinity for GrpE (Hsp70 nucleotide exchange factor). As a result, E. coli dnaK756&#160;cells grow adequately at temperatures ranging from 30 &#176;C to 37 &#176;C, but they die at elevated temperatures (&#62;40 &#176;C). For this reason, these cells serve as a model for studying the chaperone activity of Hsp70. Here, we describe a detailed protocol for the application of these cells to conduct a complementation assay, enabling the study of the in cellulo chaperone function of Hsp70.

This protocol demonstrates the chaperone activity of heat shock protein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756 cells serve as a model for the assay as they harbor a native, functionally impaired Hsp70, making them susceptible to heat stress. The heterologous introduction of functional Hsp70 rescues the growth deficiency of the cells.