Name: تسليط الضوء على المؤلف: تطوير اختبار التخثر من خلال دمج ديناميكيات التدفق في النماذج المختبرية
Uploaded: 2024-04-19T13:40:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Thrombolytic Testing by Integrating Flow Dynamics in In-Vitro Models at JoVE.com

تم دعم البحث الوارد في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم R01HL167877. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

جميع الطرق المذكورة أدناه تتوافق مع بروتوكولات مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) ولجنة أخلاقيات البحوث البشرية المؤسسية. قدم جميع المتطوعين الأصحاء موافقة خطية ومستنيرة قبل التبرع بالدم. وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن العثور على جميع المواد المشار إليها في البروتوكول في جدول المواد. بينم?...

الجمع بين حلقة تشاندلر و RT-FluFF لمراقبة تحلل الجلطة خارج الجسم الحي

<ol>
	<li>Ali, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspect+of+thrombolytic+therapy:+a+review.">Aspect of thrombolytic therapy: a review.</a> Scientific World Journal. 2014, 586510 (2014).</li><li>Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+thrombectomy-A+brief+review+of+a+revolutionary+new+treatment+for+thromboembolic+stroke.">Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboembolic stroke.</a> Clin Neuroradiol. 28 (3), 313-326 (2018).</li><li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research.">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).</li><li>Kaiser, E. E., West, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+ischemic+stroke+models:+replicating+human+stroke+pathophysiology.">Large animal ischemic stroke models: replicating human stroke pathophysiology.</a> Neural Regen Res. 15 (8), 1377-1387 (2020).</li><li>Elnager, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+whole+blood+clot+lysis+for+fibrinolytic+activity+study+using+d-dimer+and+confocal+microscopy.">In vitro whole blood clot lysis for fibrinolytic activity study using d-dimer and confocal microscopy.</a> Adv Hematol. 2014, 814684 (2014).</li><li>Prasad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+model+to+study+clot+lysis+activity+of+thrombolytic+drugs.">Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs.</a> Thromb J. 4, 14 (2006).</li><li>Robbie, L. A., Young, S. P., Bennett, B., Booth, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombi+formed+in+a+Chandler+loop+mimic+human+arterial+thrombi+in+structure+and+RAI-1+content+and+distribution.">Thrombi formed in a Chandler loop mimic human arterial thrombi in structure and RAI-1 content and distribution.</a> Thromb Haemost. 77 (3), 510-515 (1997).</li><li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+thrombi+formed+under+flow+reveal+the+role+of+factor+XIII-mediated+cross-linking+in+resistance+to+fibrinolysis.">Model thrombi formed under flow reveal the role of factor XIII-mediated cross-linking in resistance to fibrinolysis.</a> J Thromb Haemost. 8 (9), 2017-2024 (2010).</li><li>Blinc, A., Kennedy, S. D., Bryant, R. G., Marder, V. J., Francis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+through+clots+determines+the+rate+and+pattern+of+fibrinolysis.">Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis.</a> Thromb Haemost. 71 (2), 230-235 (1994).</li><li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+Chandler+loop+to+examine+the+interaction+potential+of+NXY-059+on+the+thrombolytic+properties+of+rtPA+on+human+thrombi+in+vitro.">The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro.</a> Br J Pharmacol. 153 (1), 124-131 (2008).</li><li>Herbig, B. A., Yu, X., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidic+devices+to+study+thrombosis+in+pathological+blood+flows.">Using microfluidic devices to study thrombosis in pathological blood flows.</a> Biomicrofluidics. 12 (4), 042201 (2018).</li><li>Jigar Panchal, H., Kent, N. J., Knox, A. J. S., Harris, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+in+haemostasis:+A+review.">Microfluidics in haemostasis: A review.</a> Molecules. 25 (4), 833 (2020).</li><li>Zeng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+conjugated+annular+fibrin+clot+for+multiplexed+real-time+digestion+analysis.">Fluorescently conjugated annular fibrin clot for multiplexed real-time digestion analysis.</a> J Mater Chem B. 9 (45), 9295-9307 (2021).</li><li>Zeng, Z., Christodoulides, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+tracking+of+fibrinolysis+under+constant+wall+shear+and+various+pulsatile+flows+in+an+in-vitro+thrombolysis+model.">Real-time tracking of fibrinolysis under constant wall shear and various pulsatile flows in an in-vitro thrombolysis model.</a> Bioeng Transl Med. 8 (3), e10511 (2023).</li><li>Christodoulides, A., Zeng, Z., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+thromboelastographic+characterization+of+reconstituted+whole+blood+utilizing+cryopreserved+platelets.">In-vitro thromboelastographic characterization of reconstituted whole blood utilizing cryopreserved platelets.</a> Blood Coagul Fibrinolysis. 32 (8), 556-563 (2021).</li><li>Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Christodoulides, A., Hall, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Chandler+loop+shear+and+tubing+size+on+thrombus+architecture.">Effect of Chandler loop shear and tubing size on thrombus architecture.</a> J Mater Sci Mater Med. 34 (5), 24 (2023).</li><li>Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+investigation+of+fluid+flow+in+a+chandler+loop.">Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop.</a> J Biomech Eng. 136 (7), (2014).</li><li>Wojdyla, M., Raj, S., Petrov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absorption+spectroscopy+of+single+red+blood+cells+in+the+presence+of+mechanical+deformations+induced+by+optical+traps.">Absorption spectroscopy of single red blood cells in the presence of mechanical deformations induced by optical traps.</a> J Biomed Opt. 17 (9), (2012).</li><li>Wu, J. H., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+quench+and+dequench+assay+of+fibrinogen+polymerization,+fibrinogenolysis,+or+fibrinolysis.">A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization, fibrinogenolysis, or fibrinolysis.</a> Anal Biochem. 224 (1), 83-91 (1995).</li></ol>

تشكيل الجلطة ووضع العلامات لقد ثبت أن حلقة تشاندلر توفر وسيلة سهلة وفعالة لتوليد جلطات تحاكي الجلطات الدموية16 في الجسم الحي. تسمح معلمات الضبط الدقيق مثل حجم الأنبوب وسرعات الدوران وقطر الأسطوانة ووقت التخثر بالتوليد السريع للجلطات في ظل ظروف قص مختلفة يمكنه...

تمثل الأمراض الناجمة أساسا عن مسببات الانصمام الخثاري مصدرا رئيسيا للمراضة والوفيات في المجتمع الحالي. تشمل مظاهر التسبب في الانسداد الخثاري ، على سبيل المثال لا الحصر ، احتشاء عضلة القلب والسكتات الدماغية الإقفارية والجلطات الوريدية العميقة والصمات الرئوية1. يدور قدر هائل من الأبحاث الجارية ، التي تغطي تخصصات متعددة ، حول تطوير طرق آمنة وفعالة للتعامل مع تجلط الدم الممرض. أدت الاختلافات في المظاهر الشريانية والوريدية للتخثر والمواقع التشريحية المختلفة إلى تطوير مناهج علاجية مختلفة. ومع ذلك ، يعتمد العلاج الحاد عموما على استخدام انحلال الخثرة الدوائي عبر منشطات البلازمينوجين مع إمكانية استئصال الخثرة الميكانيكية في ظل ظروف سريرية معينة2.
يعتمد تطوير استراتيجيات العلاج الدوائي الجديدة بشكل أساسي على كل من النماذج الحيوانية في الجسم الحي ونماذج الهضم في المختبر للاختبارات قبل السريرية 3,4. تستفيد النماذج في الجسم الحي بشكل طبيعي من قدرتها على التقاط التفاعل المعقد لمختلف المعلمات الفسيولوجية على فعالية العلاج التي تشمل إزالة العوامل الصيدلانية وكذلك التفاعلات الخلوية مع الأدوية. ومع ذلك ، فإن هذا التعقيد نفسه غالبا ما يجعل مثل هذه النماذج مكلفة للغاية ويقدم مشكلات إضافية عند محاولة عزل الديناميات الدوائية / الحركية الأساسية في التي تختلف اختلافا كبيرا عن علم وظائف الأعضاء البشرية. ساعد تطوير النماذج في المختبر من خلال تسهيل إعداد الاختبار المقطر الذي يمكن فيه إجراء تطوير الأدوية وفحصها ولكنه غالبا ما يفتقر إلى الدقة اللازمة لتلخيص حالة المرض قيد الدراسة.
تعتمد البروتوكولات المختبرية الشائعة لاختبار التخثر الجديد على استخدام الجلطات التي تشكلت وتحلل في ظل ظروف ثابتة حيث تعمل كتلة الجلطة المتبقية كنقطة نهاية أولية 5,6. لسوء الحظ ، تفشل هذه التقنيات في حساب الجوانب الميكانيكية لتحلل الجلطة مثل التدفق المضطرب وانخفاض ضغط الخثرة التي يمكن أن تغير بشكل كبير الديناميكا الدوائية لأدوية الاختبار. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي الجلطات المتكونة في ظل ظروف ثابتة على بنية دقيقة تختلف عن الجلطات الفسيولوجية. وقد تبين أن وجود القص أثناء تكوين الجلطة يؤثر بشكل متكرر على خصائص الجلطة الناتجة مثل تنشيط الصفائح الدموية وتشابك الفيبرين. تظهر الجلطات التي يتم إنتاجها تحت تدفق القص عدم تجانس معقد من الطرف إلى الذيل الغائب في الجلطات المكونةبشكل ثابت 7,8. قد تؤثر مثل هذه الانحرافات عن بنية الجلطة الفسيولوجية على توصيف تطوير الدواء المهم الذي يتضمن تغلغل الدواء داخل الجلطة وكفاءة التحلل اللاحقة9.
لمعالجة بعض هذه القيود المرتبطة باستخدام نماذج التخثر / تحلل الجلطة الثابتة ، شهد اعتماد حلقة تشاندلر لكل من تكوين الجلطة وتحلل الجلطة في وجود القص عودة10. على الرغم من أن هذه الأنظمة تسمح بتمثيل أفضل لديناميكيات التدفق وتوليد جلطات ذات بنية أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية مقارنة بالمقايسات الثابتة نسبيا ، إلا أن ظروف التدفق المبسطة لا تزال تمثل انحرافا عن الظروف الفسيولوجية. وأخيرا، اتخذت أيضا نهج الموائع الدقيقة نظرا لسهولة تصويرها وأنماط تدفقها الموحدة؛ ومع ذلك ، فإنها تظل إزالة كبيرة من الظروف الفسيولوجية المتوقعة داخل الأوعية الكبيرة المتأثرة بشكل أساسي في معظم اضطرابات الانسداد الخثاري ذات الصلةسريريا 11,12.
مع وضع المناقشة أعلاه في الاعتبار ، قمنا بتطوير نموذج انحلال الخثرة عالي الدقة في المختبر لفحص الأدوية قبل السريرية. يهدف النموذج إلى معالجة بعض المزالق الحالية المفصلة أعلاه في مجال فحص العلاج بالتخثر الجديد وتم التحقق من صحته من أجل التكاثر والحساسية بتركيزات متفاوتة من منشط البلازمينوجين النسيجي (tPA). يوفر النظام الموصوف هنا تدفقات قص فسيولوجية باستخدام مضخة تمعجية ، ومثبط ضغط ، وخزان ساخن ، ومستشعرين للضغط ، ومقياس فلوري في الخط ، وتناظرية جلطة على شكل قص حلقة تشاندلر تسمى الفلورسنت لتسهيل التتبع في الوقت الفعلي لانحلال الفيبرين13. مجتمعة ، يطلق على النظام العام اسم مقايسة انحلال الفيبرين المتدفق الفلورومتري في الوقت الفعلي (RT-FluFF Assay)14 وستناقش هذه المخطوطة تعقيدات إعداد وتشغيل المقايسات بنجاح في نموذج انحلال الخثرة في المختبر عالي الدقة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G&#160;Disposable Hypodermic Needles</td>
			<td>Exel International&#160;</td>
			<td>26439</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long</td>
			<td>uxcell</td>
			<td>B07SXGSQ82</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3635</td>
			<td>Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>MLB3</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus , dampeners</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arium Mini Plus Ultrapure Water System</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>NA</td>
			<td>DI water source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable BP Transducers</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>MLT0670</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drager Siemans HemoMed Pod</td>
			<td>Drager</td>
			<td>5588822</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drager Siemans Patient Monitor</td>
			<td>Drager</td>
			<td>SC 7000</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chandler loop,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face Shield</td>
			<td>Moxe</td>
			<td>SHIELDS10</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F13191</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>30600-04</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein (FITC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>119245000</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General-Purpose Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2839</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate 4 &#215; 4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1152016H</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Source Plasma Fresh-Frozen</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td>SER-SPL</td>
			<td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Whole Blood&#160;</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td>SER-WB-SDS&#160;</td>
			<td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>77200-62</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus, Pump Head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>7528-10</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus, Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor Speed Controller</td>
			<td>CoCocina</td>
			<td>ZK-MG</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Tubing T-Type Connectors</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6151-0312</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump tubing&#160;</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06424-15&#160;</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>M5</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switching Power Supply</td>
			<td>SoulBay</td>
			<td>UC03U</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S751010</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue plasminogen activator, human</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T0831</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing ID 1/4&#39;&#39;, OD 3/8&#39;&#39;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AGL00017</td>
			<td>Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing ID 5/32&#34;, OD 7/32&#34;</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ND-100-65, ADF 00009&#160;</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight</td>
			<td>uvBeast</td>
			<td>uvB-V3-365-MINI</td>
			<td>Chandler loop, used to check completed clots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm</td>
			<td>Pangyoo</td>
			<td>ZGA37RG</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking fibrinolysis of chandler loop-formed whole blood clots under shear flow in an in-vitro thrombolysis model

الجلطات الدموية والمضاعفات ذات الصلة هي السبب الرئيسي للمراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم ، وقد تم تطوير فحوصات مختلفة لاختبار كفاءة الأدوية الانحلالية للتخثر في كل من المختبر والجسم الحي. هناك طلب متزايد على نماذج الجلطات في المختبر ذات الصلة الفسيولوجية لتطوير الأدوية بسبب التعقيد والتكلفة المرتبطة بالنماذج الحيوانية بالإضافة إلى افتقارها في كثير من الأحيان إلى قابلية الترجمة إلى فسيولوجيا الإنسان. يعد التدفق والضغط ومعدل القص من الخصائص المهمة للجهاز الدوري ، حيث تظهر الجلطات التي تتشكل تحت التدفق خصائص مورفولوجية وهضمية مختلفة عن الجلطات المتكونة بشكل ثابت. غالبا ما تكون هذه العوامل غير ممثلة في فحوصات هضم الجلطات التقليدية في المختبر ، والتي يمكن أن يكون لها آثار دوائية تؤثر على معدلات نجاح ترجمة الأدوية.
تم تطوير اختبار انحلالالخثرة Real-T ime Flu Flumetric Flowing F(RT-FluFF) كمنصة اختبار انحلال الخثرة عالية الدقة تستخدم جلطات موسومة بالفلورسنت تتشكل تحت تدفق القص ، والتي يتم هضمها بعد ذلك باستخدام البلازما المنتشرة في وجود أو عدم وجود عوامل صيدلانية محللة للفبرين. يسمح تعديل معدلات التدفق لكل من خطوات تكوين الجلطة وهضم الجلطة للنظام بتقليد الحالات الشريانية والرئوية والوريدية عبر إعدادات تجريبية متنوعة للغاية. يمكن إجراء القياسات بشكل مستمر باستخدام مقياس الفلور المضمن أو عن طريق أخذ نقاط زمنية منفصلة ، بالإضافة إلى قياس كتلة جلطة نقطة النهاية التقليدية. اختبار RT-FluFF هو نظام مرن يسمح بالتتبع في الوقت الفعلي لهضم الجلطة في ظل ظروف التدفق التي تمثل بدقة أكبر الظروف الفسيولوجية في الجسم الحي مع الاحتفاظ بالتحكم في نظام الاختبار في المختبر وإمكانية استنساخه.

Diseases fundamentally stemming from thrombo-embolic etiologies present a major source of morbidity and mortality in present-day society. Manifestations of thrombo-embolic pathogenesis include, but are not limited to, myocardial infarctions, ischemic strokes, deep venous thromboses, and pulmonary emboli1. A tremendous amount of ongoing research, spanning multiple disciplines, revolves around the development of safe and effective methods for dealing with pathogenic thrombosis. Variations in arterial and venous manifestations of thrombosis and varying anatomic locations have resulted in the development of different treatment approaches. However, acute treatment generally relies on the use of pharmacologic thrombolysis via plasminogen activators with the potential for mechanical thrombectomy under certain clinical circumstances2.
The development of novel pharmacologic treatment strategies fundamentally relies on both in-vivo animal models and in-vitro digestion models for preclinical testing3,4. In-vivo models naturally benefit from their ability to capture the complex interaction of various physiologic parameters on treatment efficacy that include clearance of pharmaceutical agents as well as cellular interactions with drugs. However, this same complexity often makes such models quite costly and introduces additional issues when attempting to isolate underlying pharmaco-dynamics/kinetics in animals that significantly differ from human physiology. The development of in-vitro models has helped by facilitating a distilled testing setting in which drug development and screening can be performed but often lacks the fidelity necessary to recapitulate the disease state being studied. 
Commonly found in-vitro protocols for testing novel thrombolytics rely on the utilization of clots formed and lysed under static conditions whereby the residual clot mass serves as the primary endpoint5,6. Unfortunately, such techniques fail to account for the mechanical aspects of clot lysis such as turbulent flow and trans-thrombus pressure drops that can significantly alter the pharmacodynamics of test drugs. Additionally, clots formed under static conditions contain microarchitecture that differs from physiologic clots. The presence of shear during clot formation has reproducibly been shown to impact the resulting clot characteristics such as platelet activation and fibrin-crosslinking. Clots being produced under shear flow exhibit complex heterogeneity from tip-to-tail that is absent in statically formed clots7,8. Such departures from physiologic clot architecture may impact important drug development characterization that includes drug penetration within a thrombus and subsequent lysis efficiency9. 
To address some of these limitations associated with the use of static clotting/clot-lysis models, the adoption of the Chandler loop for both clot formation and clot lysis in the presence of shear has seen a resurgence10. Although such systems allow for a better representation of flow dynamics and generate clots with more physiologically relevant architecture compared to relatively static assays, their simplified flow conditions still represent a deviation from physiologic conditions. Lastly, microfluidic approaches have also been undertaken due to their ease of imaging and uniform flow patterns; however, they remain a significant removal from the physiologic conditions expected within the larger vessels primarily affected in most clinically relevant thrombo-embolic disorders11,12. 
With the above discussion in mind, we developed a high-fidelity, in-vitro thrombolysis model for preclinical thrombolytic drug screening. The model aims at addressing some of the current pitfalls detailed above in the realm of novel thrombolytic therapy screening and was validated for reproducibility and sensitivity at varying concentrations of tissue plasminogen activator (tPA). The system described herein offers physiological shear flows utilizing a peristaltic pump, a pressure dampener, a heated reservoir, two pressure sensors, an in-line fluorometer, and a fluorescently labeled Chandler loop shear-formed clot analog to facilitate real-time tracking of fibrinolysis13. Taken together, the overall system is called the Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF Assay)14 and this manuscript will discuss the intricacies of successfully setting up and running assays in this high-fidelity in-vitro thrombolysis model.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير اختبار التخثر من خلال دمج ديناميكيات التدفق في النماذج المختبرية

تتبع انحلال الفيبرين لجلطات الدم الكاملة المكونة من حلقة تشاندلر تحت تدفق القص في نموذج انحلال الخثرة في المختبر

Thrombosis is associated with numerous medical conditions and current treatments risk severe bleeding. Circulatory system flow significantly impacts blood clot structure. Incorporating flow into in-vitro models may improve their physiological relevance, enhancing the selection of better candidates for in-vivo testing.The assays for the study of fibrinolytics predominantly utilize static clot or microfluidic systems to assess properties such as lysis time, clot structure, or viscoelasticity. Static clot lysis assays typically rely on spectrophotometric measurements or clot mass determination as endpoints to evaluate fibrinolysis efficiency. Current thrombolytic testing uses statically-formed clots, which differ structurally from those formed under flow conditions.Microfluidic systems consider flow dynamics, but their smaller scales create unique hemodynamics and clot structures. The currently developed RT-FluFF assay provides ease in monitoring fibrinolysis in real time under physiological flow conditions. This means we now have a platform that allows control over multiple parameters to mimic conditions closer to in-vivo study models for better translation when screening new thrombolytics.

تشكيل جلطة حلقة تشاندلر عند تكوين الجلطات ، كنا نهدف بشكل عام إلى التكرار الرباعي لضمان وجود أي قيم متطرفة للجلطة (بناء على التشكل الإجمالي والكتلة) ، فلا يزال لدينا القدرة على تشغيل مقايسات انحلال الخثرة الثلاثي. بافتراض ظروف التحميل المثلى ، يجب أن تكون الجلطات موحدة تماما في ...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Thrombolytic Testing by Integrating Flow Dynamics in In-Vitro Models at JoVE.com

غالبا ما كافحت فحوصات انحلال الخثرة في المختبر لتكرار الظروف داخل الجسم الحي سواء في نموذج الجلطة الذي يتم هضمه أو في البيئة التي يحدث فيها انحلال الخثرة. هنا ، نستكشف كيفية استخدام اقتران حلقة تشاندلر ومقايسة انحلال الفيبرين المتدفق الفلورومتري في الوقت الفعلي (RT-FluFF) لمراقبة تحلل الجلطة عالية الدقة ، خارج الجسم الحي.

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test ...

يرتبط تجلط الدم بالعديد من الحالات الطبية والعلاجات الحالية تخاطر بنزيف حاد. يؤثر تدفق الدورة الدموية بشكل كبير على بنية الجلطة الدموية. قد يؤدي دمج التدفق في النماذج المختبرية إلى تحسين أهميتها الفسيولوجية ، مما يعزز اختيار المرشحين الأفضل للاختبار في الجسم الحي.تستخدم فحوصات دراسة تحلل الفيبرين في الغالب الجلطة الثابتة أو أنظمة الموائع الدقيقة لتقييم خصائص مثل وقت التحلل أو بنية الجلطة أو مرونة اللزوجة. تعتمد مقايسات تحلل الجلطة الثابتة عادة على القياسات الطيفية أو تحديد كتلة الجلطة كنقاط نهاية لتقييم كفاءة تحلل الفيبرين. يستخدم اختبار التخثر الحالي جلطات مشكلة بشكل ثابت ، والتي تختلف هيكليا عن تلك التي تشكلت في ظل ظروف التدفق.تأخذ أنظمة الموائع الدقيقة في الاعتبار ديناميكيات التدفق ، لكن موازينها الأصغر تخلق ديناميكا دموية فريدة وهياكل جلطة. يوفر اختبار RT-FluFF المطور حاليا سهولة في مراقبة انحلال الفيبرين في الوقت الفعلي في ظل ظروف التدفق الفسيولوجية. هذا يعني أن لدينا الآن منصة تسمح بالتحكم في معلمات متعددة لتقليد الظروف الأقرب إلى نماذج الدراسة في الجسم الحي للحصول على ترجمة أفضل عند فحص التخثرات الجديدة.

tracking-fibrinolysis-chandler-loop-formed-whole-blood-clots-under

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tracking Fibrinolysis of Chandler Loop-Formed Whole Blood Clots Under Shear Flow in An In-Vitro Thrombolysis Model

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test thrombolytic drug efficiency both in vitro and in vivo. There is increasing demand for more physiologically relevant in-vitro clot models for drug development due to the complexity and cost associated with animal models in addition to their often lack of translatability to human physiology. Flow, pressure, and shear rate are important characteristics of the circulatory system, with clots that are formed under flow displaying different morphology and digestion characteristics than statically formed clots. These factors are often unrepresented in conventional in-vitro clot digestion assays, which can have pharmacological implications that impact drug translational success rates.
The Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) assay was developed as a high-fidelity thrombolysis testing platform that uses fluorescently tagged clots formed under shear flow, which are then digested using circulating plasma in the presence or absence of fibrinolytic pharmaceutical agents. Modifying the flow rates of both clot formation and clot digestion steps allows the system to imitate arterial, pulmonary, and venous conditions across highly diverse experimental setups. Measurements can be taken continuously using an in-line fluorometer or by taking discrete time points, as well as a conventional end point clot mass measurement. The RT-FluFF assay is a flexible system that allows for the real-time tracking of clot digestion under flow conditions that more accurately represent in-vivo physiological conditions while retaining the control and reproducibility of an in-vitro testing system.

In-vitro thrombolysis assays have often struggled to replicate in-vivo conditions whether in the model thrombus being digested or in the environment in which thrombolysis is occurring. Herein, we explore how coupling the Chandler loop and Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) is used for high-fidelity, ex-vivo, clot lysis monitoring.